依赖于DNA的RNA聚合酶研究 VII.玉米胚RNA聚合酶B性质的研究

真核细胞的RNA聚合酶的研究已经有很 多报道〔3,41。但是以高等植物为材料研究RNA 聚合酶远不如其他真核生物多，在植物细胞中 RNA聚合酶B（或11）的含量比RNA聚合酶A 和C要丰富，而且性质也比较稳定IS]，这对研究 RNA聚合酶B的性质和它在结构基因表达中 的作用是很有利的。我们以玉米自交系黄早4 为材料，提取了RNA聚合酶B。本文将报道植 物RNA聚合酶B的分离和纯化，并研究这种酶 的性质和功能。     

依赖于DNA的RNA聚合酶的研究——Ⅴ.615小鼠肝RNA聚合酶B(Ⅱ)的免疫学特性研究

用615小鼠肝RNA聚合酶B免疫母鸡获得了抗血清。在免疫扩散实验中,这种抗血清和615小鼠肝RNA聚合酶B之间形成清晰的沉淀线;与L615(可移植性小鼠白血病)小鼠及大鼠肝RNA聚合酶B之间形成弱的沉淀线;而与615小鼠肝RNA聚合酶A和C以及大肠杆菌RNA聚合酶之间不形成沉淀线。这种抗血清对615小鼠肝RNA聚合酶B离体转录活性有明显的抑制作用,而对大肠杆菌的RNA聚合酶没有抑制作用。在免疫扩散实验中,这种抗血清可以和不同批号的615小鼠肝RNA聚合酶B产生沉淀线。 这种抗血清和615小鼠肝RNA聚合酶B形成免疫沉淀后的离心上清液电泳图谱中,血清免疫球蛋白的区带消失了。     

RNA聚合酶的模板特异性

研究了多种动物、植物、酵母及细菌RNA聚合酶对不同DNA模板的转录活性,结果表明,各种RNA聚合酶都表现出对同源模板比对异源模板具有更高的转录活性;对热变性DNA比对天然DNA有更高的转录活性。用混合DNA作为转录模板时,玉米RNA聚合酶B和615小鼠RNA聚合酶B都能优先转录其同源模板。     

依赖于DNA的RNA聚合酶的研究 Ⅲ.615小鼠和白血病615小鼠(L615)肝细胞RNA聚合酶B的比较研究

研究了正常的615小鼠和白血病615小鼠(L615)肝细胞的RNA聚合酶B,发现两种肝细胞的RNA聚合酶B都可能存在着结合状态和游离状态的形式。在电泳图中L615 RNA聚合酶B有两条电泳区带是615 RNA聚合酶B所没有的。两种B酶的最适铵离子浓度都是90mM;最适锰离子浓度为2mM;镁离子的激活作用在10mM以下时,酶活性随镁离子浓度增高而增强。两种RNA聚合酶B对α-鹅膏蕈碱的抑制作用都非常敏感,而L615 B酶更敏感一些。两种RNA聚合酶B都适于利用变性的单链DNA作转录模板。     

高等真核生物RNA聚合酶B免疫方法研究

在真核生物中,关于依赖于DNA的RNA聚合酶(依赖于DNA的RNA聚合酶A、B、C,以下统简称为A酶、B酶、C酶)免疫特性的研究对于了解酶的结构、功能、在细胞中的分布以及在生物进化过程中的变化都具有重要意义。在A酶、C酶以及低等真核生物的B酶的研究中都有不少成功的报道。然而,也有许多作     

高等真核生物RNA聚合酶B免疫方法研究

在真核生物中,关于依赖于DNA的RNA 聚合酶（依赖于DNA的RNA聚合酶A, B,C,以 下统简称为A酶、B酶、C酶）免疫特性的研究 对于了解酶的结构、功能、在细胞中的分布以及 在生物进化过程中的变化都具有重要意义。在 A酶、C酶以及低等真核生物的B酶的研究中 都有不少成功的报道^[4-10]。然而,也有许多作 者报道,用高等真核生物的B酶免疫兔子、豚鼠 都未获得B酶的抗血清^[4,7-10].     

大肠杆菌RNA聚合酶的分子研究进展

大肠杆菌是生物工程研究中最重要的外源基因表达系统,许多真核生物及病毒基因表达的早期研究都是在大肠杆菌中进行的,在外源基因表达的全过程中,依赖于DNA的RNA聚合酶在基因的转录中担负了重要的角色,随着＊＊A聚合酶各亚单位结构和功能研究的深入,人们对于RNA聚合酶的研究取得了今人瞩目的进展,本文就RNA聚合酶的分子水平研究进展作～介绍。IRNA聚合酶全酶（H010－enzyme）原核生物的依赖｝yDNA的RNA的聚合酶（以下简称ANA…一般由几种不同的亚单位组成。大肠杆菌RNAP至少含有四种不同的亚单位a、p、日’和a,一般以两…     

RNA聚合酶——抗流感病毒的新靶点

RNA聚合酶是由PA、PB1和PB2三个亚基构成的蛋白质复合物,在流感病毒基因组的转录复制过程中发挥着重要作用。随着研究的不断深入,RNA聚合酶已经成为抗流感病毒药物重要的靶点。本文介绍了RNA聚合酶各个亚基结构、功能以及RNA聚合酶抑制剂的研究进展。     

丙型肝炎病毒依赖于RNA的RNA聚合酶(RdRp)研究进展

由于缺乏合适的HCV感染细胞模型,严重制约了HCV复制,特别是HCV复制的关键因子依赖于RNA的RNA聚合酶(RdRp)的研究.对HCV序列比较分析并通过异源表达证明NS5B是HCV复制的RdRp.NS5B C端疏水性氨基酸区域以及NS5B与细胞膜形成复合体等影响NS5B溶解性.在合适的反应条件下NS5B可以多种RNA分子为模板催化RNA复制,特别是能有效复制HCV全长(+)RNA.高浓度GTP激活HCV RdRp活性.NS5B N/C端缺失突变和保守性A、B、C区中的点突变影响RdRp活性,但D区345位精氨酸突变为赖氨酸时RdRp活性明显升高.HCV RdRp的发现及其功能研究为HCV药物研究提供了新型靶标.     

真核生物RNA聚合酶组装及其生物学意义

RNA聚合酶负责RNA生物合成,是维持机体细胞生长和器官发育的重要调控机器.真核生物主要通过3种多亚基RNA聚合酶(RNAPⅠ、RNAPⅡ和RNAPⅢ)进行基因转录.RNA聚合酶Ⅱ由10个核心亚基组成,分子质量约为520 ku.RNA聚合酶结构已经解析,但其组装过程却还不清楚.RNA聚合酶各亚基无法完成体外自我组装,说明细胞内其装配过程需要组装因子帮助.RNA聚合酶组装是一个复杂的生物学过程,近年来组装因子的鉴定和发现使RNA聚合酶组装研究成为热点.在酿酒酵母中发现的组装因子有Rba50、Bud27和GPN蛋白家族等.其中GPN蛋白家族是重要的GTP酶(GTPase)家族,从古细菌到酵母以及高等真核生物中都存在,且高度保守.近期研究发现,Rba50在动植物的同源蛋白(RPAP1和IYO)与细胞分化和发育有关.GPN等组装因子编码基因的突变与细胞发育及恶性肿瘤发生发展密切关联.本文对真核生物RNA聚合酶组装最新进展做出综述,以期为RNA聚合酶组装机制的最终阐明及其与疾病发生的关联研究提供基础.     

依赖于DNA的RNA聚合酶的研究

真核细胞转录是一个极为复杂的过程,有很多迄 今尚未研究清楚的因子参加。依赖于DNA的RNA 聚合酶^{(E. C. 2.7.7.6）}直接或间接地和转录的调节 过程有关。真核细胞有三种结构不同的RNA聚合 酶^5,6,8,10,11),它们有不同的转录功能。因此,研究真 核细胞RNA聚合酶的结构对弄清酶对转录和调节显 得十分重要。     

RNA病毒RNA依赖的RNA聚合酶的结构与功能

RNA病毒一般传播迅速,给人类和自然造成巨大危害和威胁.许多RNA病毒的结构蛋白在基础研究和应用方面已日趋完善.相比之下,就非结构蛋白(NS)所做的研究较少,存在许多未知问题.在这些非结构蛋白中,病毒自身编码的RNA依赖的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase,RdRP)对病毒的复制起关键作用.对RdRP的研究不仅使对病毒RNA复制的机制更精细明了,且有可能提供新的抗病毒靶标和诊断试剂.本文对RdRP特别是动物RNA病毒RdRP的结果与功能作一综述.     

RNA聚合酶监视的DNA修复机制

生物体在正常生命过程中面临内/外因来源的DNA损伤,DNA损伤不仅影响基因正确复制,也阻碍其正常转录. 为避免DNA损伤带来的灾难性后果,生物体进化出一整套修复机制,以保证复制和转录的正确性、基因组的完整性和遗传的稳定性. 本文重点综述了RNA聚合酶监视（RNA polymerase-surveilled,RNAP-S）的DNA修复机制. 首先从RNA聚合酶（RNA polymerase,RNAP）的结构出发介绍了RNAP对DNA损伤的感知机制;其次讨论了滞留RNAP的回溯、与其模板DNA的解离以及后续修复机制的启动,真核细胞科凯恩综合征B蛋白（Cockayne syndrome protein B,CSB）及其泛素化和8-氧代鸟嘌呤DNA糖基化酶1（8-oxoguanine DNA glycosylase1,OGG1）介导的RNAP-S修复;最后探讨了RNAP-S损伤修复的生物学意义并展望其前景.     

RNA聚合酶Ⅱ启动子调控RNA 干扰在肿瘤治疗中的应用前景

RNA干扰是双链RNA介导的特异性转录后基因表达沉默现象.由于双链小干扰RNA介导的RNA干扰技术设计简便、作用迅速、效果明显,目前已被广泛应用于基因功能和重大疾病治疗的研究,尤其为肿瘤治疗提供了一条新途径.利用RNA干扰技术通过调节肿瘤发生发展相关基因的表达可制定出一系列有效的抗癌策略.然而在现行大多数策略中往往采用不可调控的RNA聚合酶Ⅲ启动子(H1,U6)表达经典的发夹结构RNA,经由Dicer酶切割成功能性siRNA,因此缺乏组织细胞靶向性和抗癌效率.最新研究表明,采用RNA聚合酶Ⅱ启动子可弥补由RNA聚合酶Ⅲ启动子调控RNA干扰缺陷和不足.此外,运用病毒载体特别是具有靶向和溶瘤效应的肿瘤特异性复制腺病毒,介导RNA聚合酶Ⅱ启动子调控表达siRNA有望成为更有效的治疗手段.     

烟叶中依赖于RNA的RNA聚合酶的部分提纯及其合成产物的性质

从烟叶无细胞匀浆液的20,000xg沉淀中用含30mM EDTA无Mg2+的悬浮液溶解出依赖于RNA的RNA聚合酶,再用聚乙二醇一葡聚糖双相分离法除去内源RNA,从而获得无内源模板的依赖于RNA的RNA聚合酶。此酶合成RNA绝对依赖于外加的RNA模板,需要四种核糖核苷三磷酸、酶活性可被焦磷酸盐抑制而不被磷酸盐抑制。酶活性不受放线菌素D(AMD)和利福平的抑制。以TMV RNA为模板,该酶催化的合成产物为分子量相当于168的双链RNA和分子量相当于tRNA的单链RNA,90％以上的RNA产物是互补于模板的负链。从感染TMV的烟叶提取的酶(IE)和健康烟叶提取的酶(HE)在性质上无明显差别。对此酶在病毒RNA复制中的作用也进行了初步探讨。     

依赖于DNA的RNA聚合酶与体外转录的研究II．酵母变异株20B一12RNA聚合酶B的纯化及鉴定

从酵母变异株20B—12经过超声波处理,硫酸铵沉淀、DEAE纤维素、磷酸纤维素和DEAE-Sephadex 层析等步骤,纯化依赖于DNA的RNA聚合酶B,在聚丙烯酰胺凝胶电泳中呈二条有聚合酶B活力的区带。其中不合有Dnase、Rnasc和蛋白酶活力,无内源DNAo50μg/ml 的a-鹅膏华碱抑制聚合酶活力达90％以上。最适(NH4),SO4．浓度为40mM。最适 Mn2+浓度为2mM。 Mg2+对酶B无激活作用。变性DNA对酶B较天然DNA有更高的效率。     

依赖RNA的RNA聚合酶介导RNA干扰的扩增效应

RNA干扰(RNA interference,RNAi)是一种非常高效的基因沉默效应,RNA依赖性RNA聚合酶(RNA—de—pendent RNA polymerase,RdRP)介导的扩增作用可能是RNAi具有高效性的一个主要原因。了解RdRP在生物体中存在的证据、RdRP及其复合体的结构、次级siRNA的产生及转移性RNAi的发生机制等问题,对深入理解RNAi的作用机制和促进RNAi的临床应用有重要意义。     

DNA指导的RNA聚合酶的研究1. 615小鼠肝RNA聚合酶B (11)的提取和鉴定

本文叙述了从‘15小鼠肝中提取和纯化RNA聚合酶B (11)的程序。这种酶在性质和结构上与已 报道的其他真核生物的同类酶基本一致。其DEAE一纤维素DE52洗脱部分在280 nm光吸收测定和 3H-UTP掺人活性测定都表明它是单一的峰，在不变性的聚丙烯酚胺凝胶电泳上也是一条电泳带；在变 性电泳条件下，它由11条电泳带组成，其中有两个大亚基，其分子量分别为220,000和125,000道尔 顿。这种酶对a-鹅膏覃碱的抑制作用非常敏感，III盯ml，鹅膏苹碱可以抑制RNA合成的50%.     

依赖于DNA的RNA聚合酶与体外转录的研究——Ⅱ.酵母变异株20B-12 RNA聚合酶B的纯化及鉴定

从酵母变异株20B-12经过超声波处理、硫酸铵沉淀、DEAE纤维素、磷酸纤维素和DEAE-Sephadex层析等步骤,纯化依赖于DNA的RNA聚合酶B,在聚丙烯酰胺凝胶电泳中呈二条有聚合酶B活力的区带。其中不含有DNase、RNase和蛋白酶活力,无内源DNA。50μg/ml的α-鹅膏蕈碱抑制聚合酶活力达90％以上。最适(NH_4)_2SO_4浓度为40mM。最适Mn~(2 )浓度为2mM。Mg~(2 )对酶B无激活作用。变性DNA对酶B较天然DNA有更高的效率。     

草鱼呼肠孤病毒RNA聚合酶基因的表达与产物纯化

草鱼呼肠孤病毒是引起草鱼出血病的主要病原,隶属于呼肠孤病毒科水生呼肠孤病毒属.序列分析表明,GCRV S2 片段长为3 877核苷酸,编码一个分子量为138kDa 的蛋白VP2,具有RNA聚合酶性质.为进一步了解该病毒 RNA聚合酶特性,本研究在对GCRV RNA聚合酶基因(GCRV-RdRp)保守区(约1.5kb)重组质粒pR/RRp高效表达的基础上,分别构建了编码GCRV RNA聚合酶保守区N端与C端部分基因的 pR/RRpN及pR/RRpC重组表达载体,并在原核细胞中获得成功表达.筛选的重组表达菌株经IPTG诱导培养,得到分子量分别为98kDa、103kDa的目的表达融合蛋白.Western blot分析表明,该表达产物与兔抗GCRV-VP2血清呈阳性反应.通过ProBond柱亲和层析,纯化了融合有6个组氨酸的重组表达产物,并获得约90%纯的目的蛋白.上述结果为GCRV RNA聚合酶特性分析提供了依据.