速成单层法半微量病毒空斑技术的研究

本文报道一种不需预先制备细胞单层的速成单层法半微量病毒空斑技术(简称速成法)及其在空斑中和试验与空斑纯化试验中的应用。作者以脊髓灰质炎病毒为代表,对速成法的实验条件、可靠性、敏感性、重复性等作了系统研究,并以此法对单纯疱疹病毒、呼吸道合胞病毒和水泡性口炎病毒进行了空斑滴定。结果提示速成法简单快速、经济方便、敏感稳定、可靠易行,可能具有较大的实用和推广价值。     

速成单层法病毒空斑技术的影响因素

本文建立了不需预先制备细胞单层的速成单层法病毒空斑技术(简称速成法)。将细胞和病毒同时加入培养孔内,使细胞在贴壁的同时被病毒吸附。细胞形成单层的同时病毒产生空斑,简单快速,经济方便,重复性好,敏感性高。为了进一步探讨速成法的最佳实验条件,使其能应用于更多的病毒—细胞系统,本文以骨髓灰质炎病毒Ⅰ型Mahoney株(PV1)为代表。观察了细胞种类、细胞数量和病毒吸附、细胞贴壁     

检测流行性出血热病毒滴度和中和抗体效价的半微量空斑法

建立了检测流行性出血热病毒滴度和中和抗体效价的半微量空斑法。小牛血清与胎牛血清的培养效果无差异。7株不同来源的出血热病毒均能在E6细胞上形成空斑。接种的病毒浓度与形成的空斑数呈直线关系。用空斑法测得的病毒滴度稍低于荧光TCIE50滴定法。空斑减少中和试验的敏感性较荧光中和试验高30倍左右。同时还初步表明了本方法可用于流行性出血热病毒的抗原性分析。     

流行性乙型脑炎病毒血清抗体半微量空斑抑制法的改进

本文报道一种检测流行性乙型脑炎(简称乙脑)中和抗体的简化空斑抑制试验方法,用BHK21传代细胞在24孔塑料板上进行试验,在细胞未形成单层时,将病毒直接接种在刚消化的细胞悬液内,孵育后加甲基纤维素复盖物,再培养,细胞层经染色后即可计算空斑数。 用该法检查47名儿童乙脑疫苗免疫前后的中和抗体,与常规的鸡胚细胞全量法或BHK21传代细胞微量中和试验法作了比较,结果表明本法与其它常规法的敏感性一致,且具有简便快速、节省人力和原材料、空斑形成率高的优点,便于大量血清学检测。     

流行性出血热(EHF)病毒半微量甲基纤维素空斑法的建立

本文报道EHF病毒一种新的空斑形成按术,即半微量甲基纤维素空斑法的建立及其应用。6株来源不同的毒株均可在V_(ero)-E_6细胞或V_(ero)细胞上形成清晰的空斑,形成的空斑能被特异抗EHF病毒血清所中和。其敏感性与用琼脂糖作覆盖物的空斑法一致。该法具有操作简便、快速等优点,适用于EHF的病原学和血清学研究。     

严重发热伴血小板减少综合征病毒培养以及病毒滴度检测方法的建立

目的:建立严重发热伴血小板综合征病毒(SFTSV)培养和病毒滴度检测的方法,为其致病机制研究奠定基础。方法:选取生长良好的Vero细胞铺六孔板接种SFTSV,每隔24 h收集培养病毒上清检测SFTSV病毒复制拷贝数,从而选取最佳时间点收获病毒液并用浓缩离心管浓缩病毒液,保存备用。将SFTSV病毒液进行10倍比稀释,每梯度200μL接种生长良好的单层Vero细胞,用3 m L高压灭菌的甲基纤维素-DMEM覆盖物覆盖每孔Vero细胞,约9 d后温和去除甲基纤维素-DMEM覆盖物,经预冷的4%甲醛固定细胞后,用结晶紫染色,PBS洗脱3次,计算空斑数。结果:根据病毒繁殖生长情况,病毒在第4 d后达复制高峰并随后进入平台期,第8天病毒复制开始下降。参照甲基纤维素-结晶紫空斑法实验结果,病毒滴度为6×106PFU/m L。结论:SFTSV病毒培养以及滴度检测方法成功建立,选取4天后收获病毒上清最佳,甲基纤维素-结晶紫空斑法形成的空斑清晰可数。     

云南辛德毕斯病毒的生物学性状研究

本文对云南首次分离到的Sindbis病毒进行了滤过试验、耐酸耐醚试验、致细胞病变、动物敏感性试验、血凝特性、空斑和毒力等试验研究,结果符合披膜病毒科的病毒特性。交叉血抑试验和免疫荧光试验,以及空斑减少中和试验进一步证实为甲病毒属的Sindbis病毒。其空斑纯化株的生物学特性也与原株相符,纯化株的制备为该株病毒分子生物学研究的准确性和一致性提供了条件。云南Sindbis病毒的首次分离具有重要的流行病学意义,其生物学特性研究结果对我省该病的诊断和防治具有重要的指导意义。     

云南辛德毕斯病毒的生物学性状研究

本文对云南首次分离到的Sindbis病毒进行了滤过试验,耐酸耐醚试验、致细胞病变、动物敏感性试验、血压 凝特性、空斑和毒力等试验研究,结果符合披膜病毒科的病毒特性。交 因抑试验和免疫荧光试验,以及空斑减小中和试验进一步证实为甲病毒属的Sindbis病毒,其空斑纯化株的生物学特性也与原株相符,纯化株的制备为该株病毒分子生物学研究的准确性和一致性提供了条件。云南Sindbis病毒的首次分离具有重要的流行病学意义,其生物学特性研究结果对我省该病的诊断和防治具有重要的指导意义。     

鳗鲡开口病的病毒分离及特性研究

从患开口病鳗中分离到一种病毒于３０℃条件下,病毒能在ＥＧ细胞上产生细胞病变及形成１．２ｍｍ大小的空斑,电镜下观察,病毒呈圆形,具囊膜。膜上有纤状突起,成熟颗粒直径为７０－８５ｍｍ其核酸为单链单分子ＲＮＡ,病毒对氯仿,热和ｐＨ３不稳定,经多次冻融,其滴度稍有下降,病毒是在细胞浆内复制,温度范围在２５－３２℃之间,最适复制温度为３０℃。     

SARS-CoV细胞空斑试验

目的建立适用于生物安全三级实验室操作的SARS．CoV空斑试验方法。方法SARS－CoVl0倍系列稀释接种Vero－E6细胞,用0．6％琼脂糖覆盖中性红着色（琼脂糖．中性红法）或覆盖1％甲基纤维素,4％甲醛固定,结晶紫染色（甲基纤维素－结晶紫法）,空斑计数。结果琼脂糖－中性红法病毒滴度为6．14Lg pfu／mL,甲基纤维素－结晶紫法病毒滴度为6．57Lg pfu／mL。结论二种空斑试验方法相比,病毒滴度无明显差异。甲基纤维素－结晶紫空斑试验法形成的空斑比琼脂糖－中性红法清晰、操作简单安全、结果可长期保存。     

失配双链核糖核酸抑制柯萨奇B3病毒感染细胞的研究

通过药物抑制病毒致细胞病变效应实验和药物对病毒空斑形成抑制实验,研究低毒性失配双链核糖核酸（Poly I：C12u）和已知的抗病毒药物双链核糖核酸聚肌胞（Poly I：C）在细胞水平对柯萨奇病毒感染的抑制作用比较,证明Poly I：C12U的抗病毒作用。实验结果表明Poly I：C12U和Poly I：C均可有效地抑制病毒空斑的形成,且量效关系已确定。     

伪狂犬病病毒TK-/gG-缺失株的构建及其生物学特性研究

将伪狂犬病病毒TK^-／gG^-／LacZ^ 突变株的基因组DNA与含有缺失的gG基因的转移质粒pUSKBB共转染猪肾传代细胞PK-15,待完全病变后收获病毒进行空斑试验,用PCR筛选gG缺失的重组病毒。空斑纯化3次后,随机挑取空斑进行PCR扩增,证实所获得的病毒为均一的TK^-／gG^-缺失株。遗传稳定性试验表明该重组病毒能在PK-15细胞上稳定遗传,动物试验表明该缺失株对Balb／c小鼠极为安全且能保护Balb／c小鼠抵抗致死量PRV强毒的攻击。该突变株的获得为我国伪狂犬病的控制和根除奠定了基础。     

标记抗体染色病毒空斑计数技术的研究

用细胞病变阳性（ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｙｔｏｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｅｆｆｅｃｔ,ＣＰＥ＋ ）病毒马立克氏病毒（Ｍａｒｅｋ＇ｓｄｉｓｅａｓｅ ｖｉｒｕｓ, ＭＤＶ）血清１,２,３ 型以及细胞病变阴性（ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｙｔｏｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｅｆｆｅｃｔ,ＣＰＥ－ ）病毒猪瘟病毒（Ｈｏｇ ｃｈｏｌｅｒａ ｖｉｒｕｓ,ＨＣＶ）强毒与弱毒和鸡新城疫病毒（Ｎｅｗ ｃａｓｔｌｅ ｄｉｓｅａｓｅｖｉｒｕｓ． ＮＤＶ）Ｌａｓｏｔａ 毒株及其对应的异硫氢酸荧光素（ＦＩＴＣ）标记的特异抗体为试验材料,以免疫荧光抗体技术（ＦＡ）为基础、并加以改进,建立了标记抗体染色病毒空斑计数技术． 该技术不仅能克服常规病毒空斑计数技术不能计数细胞病变阴性病毒和一种样品含有两种或两种以上病毒的各自空斑数的缺点,能迅速准确计数出ＣＰＥ－ 病毒和多病毒样品中病毒各自空斑数及其空斑总数,具较高敏感性、良好的可重复性．     

XJ-160病毒单方向血清学反应分子基础研究

本研究通过基因替换和重组等技术构建重组病毒解释XJ-160病毒单方向血清学反应的分子基础。以实验室构建的XJ-160病毒全感染性克隆为基础获得XJ-160病毒和辛德毕斯病毒(SINV)糖蛋白基因单独和同时相互替换的重组病毒。首先研究重组病毒对细胞及动物感染性和致病性,同时利用微量细胞中和试验方法鉴定引起XJ-160病毒单方向血清学反应的基因区段。研究结果显示XJ-160病毒E2糖蛋白是影响病毒在细胞中的生长速率,空斑形态及对乳鼠致病性的主要因素。中和试验结果显示SIN病毒E2糖蛋白对决定引起XJ-160病毒单方向血清学反应起着重要作用。本研究确定了引起XJ-160病毒单方向血清学反应的基因区段,并为进一步研究XJ-160病毒基因组结构与功能打下了基础。     

SINDBIS病毒基因组的研究

Sindbis病毒经蔗糖密度梯度离心纯化后,用SDS/酚/氯仿/异戊醇处理和乙醇沉淀,制得的基因组RNA具有典型核酸紫外吸收光谱的特征:最大吸收在260nm,最小在235nm。沉降系数为45S。沉降扫描图表明,RNA样品均一,分子完整。 用高渗法在原代鸡胚纤维母细胞测定了基因组RNA的感染性,空斑滴度为5.9×10~4pFU(空斑形成单位)/ml,空斑形态和大小与完整病毒颗粒相同。经核糖核酸酶处理,基因组RNA即丧失感染性,说明了这种生物活性的特异性。     

大蒜中抗人巨细胞病毒成份的筛选

临床试用大蒜制剂预防和治疗人巨细胞病毒感染取得了明显效果。在此基础上我们应用细胞病变(CPE)抑制试验和空斑抑制试验,对大蒜中的抗人巨细胞病毒成份进行了初步筛选和比较,证实新鲜大蒜中存在多种抗该病毒的有效成份,其中至少包括大蒜新素(二丙烯三硫)和Ajoene类似物。     

肾综合征出血热病毒LR1株在Vero细胞上适应的特性研究

选取不同代次的ＬＲ１毒株在Ｖｅｒｏ细胞上传代适应,不同天数连续动态观察细胞病变情况,同时用免疫荧光法和ＥＬＩＳＡ进行抗原检测,收毒前细胞反复冻融及超声波破碎,细胞破碎前后用ＥＬＩＳＡ检测抗原含量,半微量空斑法检测病毒滴度。结果证明：ＬＲ１株病毒能在Ｖｅｒｏ细胞上产生细胞病变,病变程度与其毒力明显相关;ＬＲ１株病毒在Ｖｅｒｏ细胞上繁殖的最佳收毒时间为１１天左右;病毒释放性较差,冻融和超声波破碎细胞能明显提高其抗原含量和病毒滴度     

用蚀斑法进行麻疹疫苗的病毒滴定

按世界银行中国疫苗项目对麻疹疫苗检定的要求,建立了麻疹疫苗病毒滴定的蚀斑方法。以蚀斑法对Ｈｕ１９１株生产的冻干麻疹活疫苗样品进行了测定。结果发现,Ｈｕ１９１株生产的麻疹疫苗在琼脂和甲基纤维素覆盖下所形成的蚀斑大小及形状不同,但滴度无显著性差异;在室温和３７℃吸附的滴度无显著性差异,但细胞在３７℃生长较好;在本实验条件下,蚀斑滴定和ＣＣＩＤ５０测定的滴度呈正相关,蚀斑滴定相对较敏感;采用国产６孔聚苯乙稀培养板,Ｖｅｒｏ细胞单层,在３７℃吸附,用甲基纤维素覆盖,经结晶紫及甲醛固定染色后计数空斑,操作简便易行,结果特异敏感,重复性好,可用于麻疹疫苗病毒滴定     

鸭源新城疫病毒M蛋白核定位信号突变影响病毒的毒力和复制能力

【目的】研究鸭源新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)M蛋白核定位信号(nuclear localization signal,NLS)突变对其毒力和复制能力的影响。【方法】利用鸭源NDV SS1株P基因和F基因上的AgeⅠ和Bstz17Ⅰ酶切位点,将overlapPCR方法获得的M蛋白NLS突变的片段替换到p NDV/SS1GFP中获得全长质粒pNDV/SS1GFP-M/NLSm。通过反向遗传学技术拯救M蛋白NLS突变体病毒,并对拯救的病毒进行血凝(hemagglutination,HA)试验、荧光试验和M基因测序鉴定。另外,对突变体病毒进行M蛋白的亚细胞定位观察,以及病毒的生物学特性、空斑形成能力和体外增殖能力测定。【结果】成功构建M蛋白NLS突变的全长质粒pNDV/SS1GFP-M/NLSm。细胞转染物接种鸡胚后的第1代尿囊液无HA效价,盲传3代才能检测到拯救病毒的HA效价。进一步的荧光试验和M基因测序确定拯救的病毒是突变体病毒r SS1GFP-M/NLSm。与亲本病毒rSS1GFP相比,突变体病毒M蛋白由细胞核定位变为细胞质定位。此外,突变体病毒的毒力、在鸡胚上的复制能力以及在细胞中的空斑形成能力显著降低,并且感染细胞后产生的细胞病变轻微,M蛋白和绿色荧光蛋白的表达量均降低,说明M蛋白NLS突变使病毒的体外增殖能力受到抑制。【结论】NLS突变导致的M蛋白细胞核定位功能丧失可明显降低鸭源NDV的毒力和复制能力。     

家蚕质多角体病毒（BmCPV）结构研究

用负染和冷冻电镜技术以及计算机数据处理方法,研究了ＣＰＶ２和空病毒的结构,完整病毒和空病毒的结构和生化组成比较表明,ＣＰＶ具有单层衣壳结构,病毒的５种结构蛋白都位于该单层衣壳上。该单层衣壳按Ｔ＝１的对称结构排列,在二十面体的顶点具有塔状突起。空病毒与完整病毒具有相同的衣壳结构,但内部结构却不相同。