介绍一种少量冻存细胞复苏技术

液氮冻存后复苏细胞活力有所下降,有不少死亡细胞。特别是在冻存细胞数量较少时,如在单克隆抗体制备过程中为防止传代污染或变异而丢失杂交瘤细胞,随时冻存的少量细胞,复苏效果往往并不理想。除了加入饲养细胞有利于细胞生长等措施外,我们将常规的复苏技术加以改进。     

一种无血清冻存液在猪胎儿成纤维细胞上的应用研究

在猪胎儿成纤维细胞(porcine fetal fibroblasts, PFF)冻存过程中,血清品质常常制约着细胞的冻存效果。为了解决这个问题,本研究旨在开发一种无血清冻存液应用于猪胎儿成纤维细胞冻存。用3种不同冻存液冻存猪胎儿成纤维细胞,每种冻存10管。冻存30 d后复苏细胞,测定冻存细胞存活率,细胞增殖活力以及电转后细胞活性。结果显示:自制无血清细胞冻存液,冻存猪胎儿成纤维细胞后存活率达95.33%;细胞增殖活力以及电转后细胞活性均显著高于标准胎牛血清冻存液(p<0.05),与特级胎牛血清冻存液效果相当(p>0.05)。因此,自制冻存液冻存猪胎儿成纤维细胞效果稳定,能够替代含血清冻存液,有良好的推广应用前景。     

低温冻存对骨髓基质细胞生物学特性的影响

目的：探讨低温冻存对骨髓细胞和贴壁基质细胞生物学特性的影响。方法：取新鲜骨髓和经Dexter法培养14d的骨髓贴壁基质细胞(称“基质细胞”),经-196℃液氮冻存(前者称“冻存骨髓”,后者称“冻存基质细胞”)2周,复温,再用Dexter法培养这些细胞,检测细胞增殖、细胞形态、细胞化学染色、细胞表面抗原及基质细胞支持另一骨髓造血细胞形成的鹅卵石造血区(CAFC),长期培养起始细胞(LTCIC)的变化,比较冻存对骨髓细胞和基质细胞生物学特性的影响。结果：生长特性：冻存骨髓比新鲜骨髓、冻存基质细胞比新鲜基质细胞培养后融合成片的时间延迟,细胞增殖数比也有减低。细胞成分：冻存骨髓比新鲜骨髓形成的成纤维细胞、内皮细胞比率下降,而巨噬细胞和脂肪细胞比率升高,冻存基质细胞上述现象更明显：冻存后含凋亡小体的细胞在骨髓细胞和基质细胞内均有增加。细胞表面抗原：冻存骨髓、冻存基质细胞CD14、HLA-DR抗原表达百分率比新鲜骨髓、新鲜基质细胞高,CD45、CD33反之。支持造血：冻存前后骨髓和基质细胞支持形成的CAFC和LTC-IC,生长良好,无显著差异。结论：骨髓细胞和经培养生成的贴壁基质细胞,经冻存和复温,生物学特性有一定变化,但仍可以保留良好的支持造血重建功能。     

一种适合骨髓瘤、杂交瘤细胞生长的无血清培养基

在基础培养液 DME/F12(1:1)中加入10μg/ml 转铁蛋白(T),5μg/ml 胰岛.素(Ⅰ),10μmol/L 乙醇胺(E),10^-9mol/L 亚硒酸钠(S)及1mg/ml 牛血清白蛋白(BSA)等诸种添加剂成分而构成了本试验的无血清培养基,定名为 LDSF.试验表明,LDSF 可取代常规培养基 DMEM(含10—15%胎牛血清),用于骨髓瘤、杂交瘤细胞的长期传代培养,支持杂交瘤细胞稳定、持续地分泌特异单克隆抗体(McAb),并可用于细胞融合、冻存和复苏.     

BALB/C小鼠杂交瘤细胞冻存初探

自从Polge(1949)用甘油作为保护剂成功的冻存了Hela和L细胞以来,细胞冻存技术已日趋完善。本文对细胞株的冻存分别采用-70℃冰箱和常用的液氮深低温的方法。定期复苏,测定抗体效价,最后作染色体比较,至今已一年多,其结果令人满意。现将结果简要报告如下。方法1.细胞冻存:选择生长旺盛期,形态良好的细胞,按每ml细胞冻存液内含活细胞约1×106个,每支冻存管1ml。细胞冻存管置-20℃冰箱内15小时左右,分别放入液氮和-70℃冰箱内。经不同时期后取出作复苏及抗体效价比较。2.细胞复苏:取出冻存管,迅速浸入37℃水浴中,在1分钟内解冻后转种到已预制…     

谷胱甘肽与富氢冻存液在鸡血细胞冻存中的保护作用

目的通过观察细胞冷冻复苏后的存活率及凋亡情况,探讨细胞冻存液中添加谷胱甘肽(GSH)和氢气(H_2)对细胞的保护作用。方法在冻存液中添加GSH和/或通入H_2后冻存鸡血细胞,1个月后复苏,采用台盼蓝拒染和MTT法分别检测细胞存活率与细胞活性,流式细胞仪检测细胞的凋亡率。结果 GSH、H_2或H_2+GSH处理使细胞活力明显提高,而早期凋亡率明显降低。结论谷胱甘肽与富氢冻存液对鸡血细胞冻存具有保护作用。     

冻存密度对外周血单个核细胞冻存效果的影响

探讨冻存密度对外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC)冻存效果的影响。设定新鲜PBMC组(F组)及3个PBMC冻存密度组即2.0×10~7/mL(A组),4.0×10~7/mL(B组),6.0×10~7/mL(C组)。通过对冻存前后的PBMC活率及复苏后多种细胞因子诱导的杀伤细胞(Cytokine-induced killer,CIK)的扩增倍数、淋巴细胞亚群、体外杀伤效率进行比较,验证其冻存效果。结果显示,冻存前F组与冻存后A组、B组、C组的细胞活率分别为(96.0±0.3)%、(95.6±0.4)%、(94.7±0.2)%和(94.9±0.4)%,B组与C组显著低于A组,P0.05;细胞扩增14 d后,F组与A组、B组、C组细胞扩增倍数分别为(156.4±18.2)倍、(160.2±28.4)倍、(126.1±19.8)倍和(110.4±11.3)倍,B组与C组显著低于F组(P0.05);PBMC冻存前复苏后淋巴细胞亚群结果无显著差异。与F组相比,A组、B组、C组细胞扩增14 d后,CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3-CD56+、CD3+CD56+淋巴细胞亚群无显著差异(P0.05),体外杀伤效率无显著差异(P0.05)。过高的冻存密度会影响PBMC冻存效果而间接影响细胞的复苏应用,而过低的冻存密度则增加冻存体积而大大提高冻存成本,因此,选择合适的细胞冻存密度是细胞库或细胞银行必须要考虑的问题。     

不同冻存条件对甘蔗原生质体活力和再生能力的影响

为了获得活力高和再生能力强的甘蔗原生质体,该文对甘蔗原生质体的冻存液浓度、冻存温度和冻存部位进行了研究。结果表明:(1)不同的冻存液、不同的冻存温度和不同的取材部位原生质体冻存后复苏对甘蔗原生质体的活力影响有显著差异性,三个冻存液组合比较,在组合2(70%培养基+20%血清+10%DMSO),冻存30 d后复苏活力最强,高达72%;冻存90 d内复苏,-196℃液氮和-80℃冰箱冻存,甘蔗原生质体的活力差异不显著,活力均在75%以上,但90 d冻存后复苏,-196℃液氮冻存后复苏比-80℃冰箱冻存冻存后复苏原生质活力强;不同取材部位比较,幼叶冻存30 d后复苏所得原生质体活力较高(达79. 2%),茎尖冻存30 d后复苏所得原生质体活力仅为42.7%。(2)不同的冻存液和不同的冻存温度,细胞第一次启动分裂和形成细胞团的时间差异不显著,一般培养5～6 d,细胞壁基本形成完整,培养6 d后,细胞启动分裂,培养15 d后形成细胞团。不同的材料部位相比较,茎尖酶解所得原生质体再生能力最强,较幼叶酶解原生质体,形成细胞壁的时间早3 d,第一次分裂时间早2 d。     

人乳头瘤病毒特异性T细胞系细胞冻存后细胞的存活率及功能

研究人乳头瘤病毒特异性T细胞系细胞冻存后细胞的存活率及功能。应用包含10%二甲基亚砜、90%小牛血清的冻存液冻存6个T细胞系(5个CD4 T细胞系,1个CD8 T细胞系)细胞,液氮中冻存32~54个月后复苏,台盼蓝染色法检测复苏后T细胞系细胞的存活率,用酶联免疫斑点法(enzyme-linked immunospot assay,ELISPOT)检测复苏后T细胞系细胞的功能。结果显示,6个T细胞系细胞液氮冻存解冻后细胞的存活率为24.7%~93.5%,过夜培养后细胞的存活率为2.5%~72.2%。CD8 T细胞系细胞的存活率高于CD4 T细胞系细胞。6个复苏后的T细胞系细胞在PHA诱导后均能分泌IFN-γ。人乳头瘤病毒特异性T细胞系细胞冻存复苏后能够保持较好的存活率和功能。     

分泌白细胞介素—2T细胞杂交瘤株的建立

本研究利用T淋巴细胞杂交瘤技术建立了能持续稳定地分泌白细胞介素—2(IL—2)的小鼠T淋巴细胞杂交瘤株,首先用刀豆蛋白A(ConA)活化BALB/C小鼠的脾细胞,然后使其与小鼠胸腺瘤细胞BW5147融合,用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色分析法从261个杂交克隆中筛选出至少30个分泌IL—2的T细胞杂交瘤株,对选出的一个杂交瘤细胞株FB4作了进一步研究,该杂交瘤株的染色体平均44(42～47)条,经传代培养、冻存和复苏后仍能持续稳定地分泌IL—2,用含2％小牛血清的DMEM完全培养基大量培养FB4杂交瘤细胞,制得含IL—2的培养上清,再经沉淀和凝胶过滤等步骤制得了部分纯化的IL—2,用十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS—PAGE)技术检出了IL—2成分,其表观分子量(MW)约28KDa。     

美洲鲥雄性生殖细胞冷冻保存及移植

采用分离细胞冻存和组织块直接冻存2种方法, 进行美洲鲥(American shad, Alosa sapidissima)精巢细胞的长时间冷冻保存(>250d), 并比较分析2种不同冻存方法对美洲鲥雄性生殖细胞的冻存效果。解冻复苏后用Hochest33342和PI共染细胞核, 分析统计各期雄性生殖细胞的存活率, 结果显示组织块冻存方法所得精原干细胞和精母细胞的存活率明显高于分离细胞冻存的; 而精细胞及其他细胞存活率在2种方法间无显著差异; 特别是, 镜检发现组织块冻存方法所得精子存活率高达93.83%, 说明此冻存方法能同时高效地冻存美洲鲥各期生殖细胞, 包括成熟的精子。同时, 将组织块冻存的美洲鲥生殖细胞用PKH26染色标记后移植到出苗第1天的斑马鱼仔鱼中, 在细胞植入后5d仍能在受体中检测到供体细胞, 且有部分供体细胞能与内源生殖细胞共定位, 表明经过长时间冷冻保存的美洲鲥生殖细胞仍具有生殖细胞特性, 且能整合到斑马鱼受体性腺原基。研究结果为进一步开展美洲鲥, 或其他洄游性鱼类的生殖细胞发育、培养及种质资源保存等研究工作奠定了技术理论基础。     

乙型肝炎病毒表面抗原a、d、r亚型单克隆抗体的制备与应用

本文成功地建立了分泌抗乙型肝炎病毒表面抗原(抗-HBsAg)a,d、r3种亚型决定簇抗体的4株杂交瘤细胞。经一系列生化、免疫学鉴定,证明4株细胞所分泌的单克隆抗体(McAb)均具有各自的亚型特异性。反复克隆培养16周,并液氮冻存8个月后复苏,抗体的效价仍稳定不变。用纯化的McAb制备RPHA诊断试剂,检测了80例有乙型肝炎自觉症     

利用流式细胞术评价长期冻存对PBMCs各亚型的影响

目的:利用流式细胞术,检测长期冻存后PBMCs总数及各亚型的变化,评价PBMCs的长期冻存效果。方法:收集志愿者外周血PBMCs,利用流式细胞术分析液氮冻存后PBMCs细胞总数及其亚型的变化。结果:长期冻存后,PBMCs总细胞量和细胞活力无显著改变(P=0.19, P=0.32);T细胞、NK细胞和NKT细胞比例无明显变化,但B细胞比例增多(P0.01),单核细胞比例显著减少(P0.001);低温保存影响活化的T细胞和Tregs细胞数量(P0.05, P0.05),其中初始Tregs和记忆Tregs显著减少(P0.05,P0.01)。结论:PBMCs长期冻存会影响B细胞,单核细胞、活化T细胞和Tregs细胞的活性。     

冻存时间对脐血造血细胞体外增殖潜能的影响

目的研究冻存时间对脐血造血细胞增殖潜能的影响.方法在所分离的脐血有核细胞中加入联合低温保护剂Dextran-40+10%DMSO,经梯度降温后置液氮深低温保存.采用无血清造血细胞扩增液对冻存不同时间的脐血造血细胞进行体外扩增,动态监测扩增潜能.结果将冻存1个月、4个月脐血造血细胞体外扩增5周,其总有核细胞分别被扩增了(1499.0±115.6)倍和(1513.0±110.4)倍,FCs均于体外扩增的第3周达到高峰,分别扩增了(53.8±6.3)倍和(54.8±6.7)倍,D34+造血细胞于体外扩增的第2周均达到高峰,分别扩增了(63.8±6.1)倍和(62.4±5.7)倍;统计分析冻存1个月与4个月后造血细胞扩增结果,不存在显著性差异,>0.05.结论在适宜深低温条件下冻存脐血造血细胞,在一定时间内,冻存时间的长短不会导致其增殖潜能下降.     

人外周血淋巴细胞长期冻存后结构和功能的研究

从肝素和 ACD 抗凝血中分离的淋巴细胞,用 DMSO 或甘油作为低温保护剂,保存在液氮内,在冻前和冻后10、20、40和365天时分别检测细胞的功能活性。当冻存液内含10%DMSO 和40%人 AB 血清时,冻存效果最好。冻存一年时,淋巴细胞的回收率和存活率均大于92.5%。冻存细胞的 E 和 ME 花环形成率、ANAE 阳性率、LDH 同工酶谱和细胞超微结构与冻前相比,均无明显变化,冻存细胞的淋转能力虽在冻存初期有所下降,以后就处于稳定状态。     

β-TCP三维支架用于骨髓间充质干细胞原位冻存研究

目的:探索骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)三维扩增原位冻存策略实践性及其对传代迁徙和成骨分化能力的影响.方法:制备β-TCP三维支架,相对2D平板考察三维扩增细胞数,冻存后以CCK-8染色计数考察收获冻存效率,迁徙率,并以ALP染色考察总体成骨分化水平和比分化活力.结果:与2D平板相比,3D培养速率提升7倍,原位冻存细胞收获存活效率由传统消化吹打方式的55.9%提升为81.3%;冻存处理后其迁徙率传代效率下降无统计学意义(P>0.05),比ALP活性经冻存处理非但未下降,反而在迁徙传代支架上显著性提升.结论:利用β-TCP三维支架扩增、传代MSC并进行原位冻存不影响传代迁徙能力,对成骨分化水平反而有贡献作用,具有较好的科研及工业生产应用前景.     

抗豚鼠IgG1单克隆抗体的制备

本研究应用B淋巴细胞杂交瘤技术,建立了能持续稳地分泌豚鼠IgG1 McAb的杂交瘤细胞株NB_(11)B_6和NB_(11)N_3。两株细胞分泌的单克隆抗体(MeAb)经间接血凝检测效价均达到1:12400以上,本McAb经检测属小鼠IgG_1亚类。该杂交瘤细胞株染色体的数目为93.12±12.3和103.25±11.2对,经半年的冻存与复苏分泌McAb性能稳定。     

小鼠杂交瘤细胞在双口滚动培养瓶中的生长及抗体分泌

研制了一种新的滚动式细胞培养装置(rolling culture system)和双口滚动瓶(double-mouthed roller).利用分泌抗人绒毛膜促性腺激素(hCG)单克隆抗体的小鼠杂交瘤细胞作为检验材料,对培养在双口滚动培养装置及常规T形瓶中的细胞生长和单抗分泌进行了比较.在滚动培养装置中(转速2～10 r/min)培养的细胞生长和抗体分泌皆增加30%以上.不同浓度的血清对细胞生长和抗体产量有一定影响,含5%血清的培养液中生长的杂交瘤细胞单抗产量最高;添加少量明胶可增加细胞生长和抗体产量.     

低温冻存对脐血树突状细胞生物特性的影响

目的 :观察低温冻存对脐血来源的树突状细胞 (DCs)培养生物特性的影响 ,为DCs的应用提供冻存方法。方法 :设未冻存脐血细胞 (UFCB)经增殖培养后产生的DCs(UFDCs)为对照组 ,来源于经低温冻存的脐血 (CPCB)的DCs和经低温冻存的DCs(CPDCs)为实验组 ,比较实验组与对照组DCs生物特性 ,包括细胞增殖量 ,不染色和染色的细胞形态 ,台盼蓝拒染回收率 (TBR) ;细胞表面抗原 ;混合淋巴细胞培养剌激指数 (SI)、抗毒 杀灭效应处理率(ER)。结果 :CPCB与UFCB比 ,形成DCs的时间迟 ,细胞增殖量、树突状细胞量、CD1a、CD83、HLA DR表达、SI、ER均低。CPDCs与UFDCs比 ,形成贴壁树突状细胞迟 ,细胞增殖量、树突状细胞量、CD1a、CD83、HLA DR表达、SI、ER均低。CPCB的TBR为 95.8% ,CPDCs的TBR为 88.7%。结论 :脐血细胞和经增殖培养的脐血DCs ,经低温冻存后复温培养 ,DCs的生物特性有一定的损伤 ,但基本功能仍比较完整 ,回收率均 >85%。     

超低温保存鸡红细胞条件的选择

通过比较液氮冻存鸡红细胞(CRBC)时,不同组成的冻存保护液及不同的降温程序,对CRBC活力的影响来选择最佳的冻存条件。结果表明,含15％二甲基亚砜(DMSO)的不添加血清RP—MI-1640培养液．具有良好保持冻存CRBC活力的作用。以样品悬置液氮罐口10min→浸入液氮的程序降温,经40℃水浴复苏,CRBC的活力高于90％。CRBC由于廉价易得,是学生人数较多时进行细胞冻存与复苏实验的优良材料。