细菌内同源重组法制备FMDV聚蛋白编码基因重组腺病毒

采用PCR方法从重组质粒pMD18_T/PP中扩增出FMDV的聚蛋白(PP)编码基因,再亚克隆至腺病毒穿梭质粒中,形成重组穿梭质粒rpAd_CMV/PP;将获得的重组穿梭质粒与腺病毒骨架载体通过在大肠杆菌内质粒间同源重组获得重组腺病毒质粒rpAd/PP。将腺病毒载体线性化后用脂质体介导转染293细胞从而获得含有口蹄疫病毒PP编码基因的重组腺病毒。通过倒置显微镜观测,可见明显的细胞病变,利用荧光显微镜可观测到报告基因绿色荧光蛋白的表达,并在电镜下观察到FMDV的空衣壳。结果证明已成功获得了含有口蹄疫病毒PP编码基因的重组腺病毒rAd/PP,并成功表达组装FMDV空衣壳,为FMDV腺病毒活载体疫苗的研究奠定了基础。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白重组腺病毒的构建与免疫原性测定

应用RT-PCR方法扩增出猪繁殖与呼吸综合征病毒国内分离株S1毒株的GP5基因序列,然后通过KpnI和XhoI酶切位点把该基因克隆入经过同样双酶切的穿梭载体pShuttle-CMV中.重组穿梭载体经过酶切和PCR鉴定后进行测序,证明所克隆入的基因以正确的阅读框插入.获得的重组穿梭载体经线性化后与腺病毒骨架载体共转化大肠杆菌BJ5183菌株.纯化的重组腺病毒质粒经酶切线性化后转染293细胞获得重组腺病毒.重组腺病毒经纯化后进行RT-PCR和间接免疫荧光鉴定,证明了用PRRSVGP5蛋白基因所构建的重组腺病毒成功的表达了GP5蛋白.猪体免疫试验后收集血清进行中和实验证明所构建的重组腺病毒在猪体内能够诱导产生中和抗体,因此我们所构建的重组腺病毒可以作为PRRSV基因工程疫苗研究候选病毒株.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白重组腺病毒的构建与免疫原性测定

应用RT-PCR方法扩增出猪繁殖与呼吸综合征病毒国内分离株S1毒株的GP5基因序列,然后通过KpnI和XhoI酶切位点把该基因克隆入经过同样双酶切的穿梭载体pShuttle-CMV中。重组穿梭载体经过酶切和PCR鉴定后进行测序,证明所克隆入的基因以正确的阅读框插入。获得的重组穿梭载体经线性化后与腺病毒骨架载体共转化大肠杆菌BJ5183菌株。纯化的重组腺病毒质粒经酶切线性化后转染293细胞获得重组腺病毒。重组腺病毒经纯化后进行RT-PCR和间接免疫荧光鉴定,证明了用PRRSVGP5蛋白基因所构建的重组腺病毒成功的表达了GP5蛋白。猪体免疫试验后收集血清进行中和实验证明所构建的重组腺病毒在猪体内能够诱导产生中和抗体,因此我们所构建的重组腺病毒可以作为PRRSV基因工程疫苗研究候选病毒株。     

H5N1禽流感病毒HA和NA基因重组腺病毒共表达载体的构建

利用口蹄疫病毒(FMDV)2A蛋白具有自我裂解的功能,将其作为连接肽构建携带有H5N1亚型AIVHA和NA基因的重组腺病毒表达载体,进而为AIV基因工程疫苗的开发以及相关诊断试剂的开发提供依据。采用融合PCR的方法扩增出含有H5N1 AIV HA-2A-NA的基因,定向插入pAdtrack-CMV腺病毒穿梭质粒中,含有目的基因的腺病毒穿梭质粒pAdtrack-HA-2A-NA与腺病毒骨架质粒pAdeasy-1在基因工程菌BJ5183中进行同源重组,获得腺病毒质粒pAdeasy-HA-2A-NA,将pAdeasyd-H5经PacI线性化后转染HEK293细胞株包装出含有HA-2A-NA基因的腺病毒pAd-HA-2A-NA。结果表明,构建的含有目的基因的腺病毒穿梭质粒pAdtrack-HA-2A-NA和含有目的基因的腺病毒质粒pAdeasy-HA-2A-NA经PCR、双酶切及核苷酸测序测定无误。线性化后的pAdeasy-HA-2A-NA转染HEK293细胞包装成功获得腺病毒pAd-HA-2A-NA载体,经绿色荧光蛋白和RT-PCR分析证实,目的基因在该细胞中成功表达。本试验构建的含有AIV H5N1亚型HA-2A-NA基因的重组腺病毒表达载体,将为进一步研究开发基因工程疫苗提供病毒模型。     

人核糖核酸酶抑制因子基因重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的构建含有人核糖核酸酶抑制因子（hRI）基因的重组腺病毒载体。方法以含有全长cDNA的pT7-RI为模板,PCR扩增hRI,经T载体克隆后,酶切亚克隆到穿梭质粒pAdTrack—CMV上,在BJ5183细菌内和pAdEasy-1同源重组。筛选阳性克隆,酶切、PCR及测序鉴定,线性化后脂质体法转染293细胞进行包装、扩增。通过观察绿色荧光蛋白（GFP）的表达及PCR扩增目的基因等方法鉴定重组的腺病毒。结果酶切鉴定及PCR结果证明hRI基因重组腺病毒载体构建成功,病毒滴度为1．5×10^10 pfu/ml。结论应用细菌内同源重组法成功构建了含hRI基因的重组腺病毒载体。     

人eNOS复制缺陷型重组腺病毒的构建

目的:构建以巨型细胞病毒(CMV)为启动子的heNCS重组腺病毒转移载体.方法和结果:将heNOS cDNA全长亚克隆到穿梭质粒启动子CMV的下游,通过I-Ceu Ⅰ和PI-SceⅠ两个稀有酶切位点将目的基因heNOS与腺病毒质粒DNA(pAdeno-X)进行体外连接,获得重组腺病毒质粒DNA(pAdeno-heNOS),后者经限制性内切酶PacⅠ切割,利用脂质体转染法获得heNOS重组腺病毒.PCR双引物法鉴定是否成功构建heNCS重组腺病毒.结论:PCR双引物检测含有heNOS片段,表明成功构建了heNOS重组腺病毒转移载体AdhCMV-heNOS.     

脂肪储存小滴蛋白5 重组腺病毒的制备

目的:利用AdEasy腺病毒表达系统构建含有小鼠脂肪储存小滴蛋白5(LSDP5)基因的重组腺病毒。方法:从小鼠肝脏cDNA克隆出LSDP5基因全长,克隆至pMD18-T载体中,酶切测序。回收酶切产物,连接到腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV,构建pShuttle-CMV-LSDP5重组质粒,经PmeI酶切线性化后转化至含有腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的BJ5183中。筛选阳性克隆,提取重组质粒,PacI酶切线性化并转染AD293细胞进行包装,提取病毒DNA,鉴定重组病毒并检测病毒滴度。结果:LSDP5基因克隆经测序证实与Genebank公布一致,双酶切重组pMD18-T载体得到1400 bp左右的片段。重组穿梭载体经Kpn I和Sal I双酶切后得到预期片段。PacI酶切得到30 Kb大片段和4.5 Kb小片段。转染AD293细胞后收集病毒,经PCR鉴定,获得理想的目的片段。取病毒上清反复感染AD293细胞以扩增病毒,最后所得病毒滴度为2.5×109pfu/ml。结论:成功构建了携带脂肪储存小滴蛋白5基因的重组腺病毒载体,为进一步研究LSDP5基因功能奠定基础。     

脂肪储存小滴蛋白5重组腺病毒的制备

目的：利用AdEasy腺病毒表达系统构建含有小鼠脂肪储存小滴蛋白5（LSDP5）基因的重组腺病毒。方法：从小鼠肝脏cDNA克隆出LSDP5基因全长,克隆至pMD18-T载体中,酶切测序。回收酶切产物,连接到腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV,构建pShuttle-CMV-LSDP5重组质粒,经PmeI酶切线性化后转化至含有腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的BJ5183中。筛选阳性克隆,提取重组质粒,PacI酶切线性化并转染AD293细胞进行包装,提取病毒DNA,鉴定重组病毒并检测病毒滴度。结果：LSDP5基因克隆经测序证实与Genebank公布一致,双酶切重组pMD18-T载体得到1400 bp左右的片段。重组穿梭载体经Kpn I和Sal I双酶切后得到预期片段。PacI酶切得到30 Kb大片段和4.5 Kb小片段。转染AD293细胞后收集病毒,经PCR鉴定,获得理想的目的片段。取病毒上清反复感染AD293细胞以扩增病毒,最后所得病毒滴度为2.5×109pfu/ml。结论：成功构建了携带脂肪储存小滴蛋白5基因的重组腺病毒载体,为进一步研究LSDP5基因功能奠定基础。     

人肝癌靶向性CD80基因表达重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的:构建人肝癌靶向性CD80基因重组腺病毒载体。方法:首先,从人基因组DNA中克隆AFP增强子、启动子,利用腺病毒穿梭质粒pShuttle和pShutte-CMV,采用AFP增强子替换CMV启动子,构建含有AFP启动子和增强子的穿梭质粒,命名为pShuttle-AFP。将人CD80基因克隆到pShuttle-AFP的AFP增强子和启动子之后,构建pShuttle-AFP-CD80质粒。再将其与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共转化E.coliBJ5183,利用同源重组构建腺病毒质粒pAd-AFP-CD80。以获得的重组子转染AD293细胞后制备重组腺病毒,并对重组的病毒进行鉴定和病毒滴度测定。结果:测序结果与Genebank中公布的AFP启动子、核心增强子和CD80基因序列相符。双酶切结果与预期结果相符。PacI酶切结果与目的结果一致。穿梭质粒pShutte-AFP-CD80和腺病毒质粒pAd-AFP-CD80经酶切和PCR鉴定均获得期望大小的目的片段。结论:成功的构建了人肝癌靶向性pAd-AFP-CD80腺病毒载体,为CD80基因在肝癌靶向性治疗的研究奠定了基础。     

猪繁殖与呼吸综合症病毒E基因克隆及重组腺病毒表达载体的构建

研究采用RT-PCR技术对猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)E基因进行了克隆、测序和特征分析,得到长度为603 bp,编码201个氨基酸残基的目的基因片段.将克隆到的E基因插入到pAdTrack-CMV穿梭质粒中,再将重组穿梭质粒pAdTrack-CMV/E用PmeⅠ线性化后电转化携带有腺病毒骨架载体pAdeasy-1的大肠杆菌BJ5183感受态细胞,经细菌内同源重组产生重组腺病毒质粒pAdEasy-E,成功获得了含有PRRSV E基因的重组腺病毒表达载体.为猪繁殖与呼吸综合症活载体疫苗的研制提供了依据.     

同源重组法制备口蹄疫病毒多基因重组腺病毒

通过细菌内同源重组的方法成功构建了含有O型口蹄疫病毒P1-2A和3C蛋白酶基因和3D基因的重组腺病毒表达载体.首先将P1-2A、3C和3D基因亚克隆连接到穿梭质粒pShuttle-CMV上,再将重组穿梭质粒用PmeI线性化后电转化携带有腺病毒骨架载体pAdeasy-1的大肠杆菌BJ5183感受态菌,经细菌内同源重组产生pAdcmv-p12x3c和pAdcmv-p12x3cd重组腺病毒质粒,经序列测定证实目的基因已正确的插入到腺病毒骨架载体中.重组腺病毒质粒经PacI线性化后转染HEK293细胞,转染1w内细胞出现典型病变.取转染细胞裂解液上清连续传代至第4代时,细胞于24~48h内即病变完全,收取接毒后24h细胞进行PCR和RT-PCR检测,表明目的基因已整合到腺病毒基因组内,且在mRNA水平上有表达.取第4、6、8和10代病毒,用蛋白酶K处理后可扩增出目的基因,证明此重组病毒可稳定存在.本研究为FMDV腺病毒活载体疫苗的研究奠定了基础.     

同源重组法制备口蹄疫病毒多基因重组腺病毒

通过细菌内同源重组的方法成功构建了含有O型口蹄疫病毒P1—2A和3C蛋白酶基因和3D基因的重组腺病毒表达载体。首先将P1—2A、3C和3D基因亚克隆连接到穿梭质粒pShuttle—CMV上,再将重组穿梭质粒用PmeI线性化后电转化携带有腺病毒骨架载体pAdeasy—1的大肠杆菌BJ5183感受态菌,经细菌内同源重组产生pAdcmv—p12x3c和pAdcmy—p12x3cd重组腺病毒质粒,经序列测定证实目的基因已正确的插入到腺病毒骨架载体中。重组腺病毒质粒经PacI线性化后转染HEK293细胞,转染1w内细胞出现典型病变。取转染细胞裂解液上清连续传代至第4代时,细胞于24～48h内即病变完全,收取接毒后24h细胞进行。PCR和RT—PCR检测,表明目的基因已整合到腺病毒基因组内,且在mRNA水平上有表达。取第4、6、8和10代病毒,用蛋白酶K处理后可扩增出目的基因,证明此重组病毒可稳定存在。本研究为FMDV腺病毒活载体疫苗的研究奠定了基础。     

抑癌基因Fhit重组腺病毒的构建表达及其在结肠癌细胞中的生物学功能

目的：构建携带抑癌基因Fhit的重组腺病毒并通过其研究Fhit蛋白对结直肠癌细胞增殖能力的影响。方法：利用PCR方法从人胎肝文库中克隆Fhit基因片段,Fhit基因PCR产物连入T载体构建重组质粒pMD18T-Fhit。测序正确后,将基因片段导入ptrack-CMV穿梭质粒中,构建重组穿梭载体ptrack-CMV-Fhit。将经PmeⅠ 单酶切线性化的ptrack-CMV-Fhit和骨架腺病毒质粒pAdEasy-1共转BJ5183大肠杆菌,使ptrack-CMV-Fhit和pAdEasy-1发生同源重组。经PacI酶切鉴定正确后,将重组腺病毒质粒转染293A细胞获得表达Fhit蛋白的重组腺病毒rAd-Fhit,将获得的重组腺病毒感染结肠癌细胞,采用蛋白印迹法检测外源Fhit蛋白的表达,并进一步观察其对细胞增殖能力的影响。结果：我们成功构建了携带有Fhit基因的重组腺病毒,且能够在结肠癌细胞中成功表达Fhit蛋白。在结肠癌细胞中,Fhit蛋白明显减弱了结肠癌细胞的增殖能力。结论：在结肠癌细胞中,Fhit基因可能扮演抑癌基因的角色,而表达Fhit的重组腺病毒很可能成为一种结肠癌生物治疗的新策略。     

乙型肝炎病毒S基因与截短C基因融合的穿梭表达载体的构建

研究目的是构建HBVS基因和截短C基因融合的胞壁型和分泌型大肠杆菌和分枝杆菌(E．coli-BCG)穿梭质粒。采用PCR方法从结核分枝杆菌MTB毒株H37Rv的基因中扩增出相对分子质量为19000的抗原胞壁区及其上游调控元件基因,克隆入穿梭载体pOLYG中。以含HBV基因组的质粒pCP10序列为模板,PCR扩增获得5基因片段Sw和C基因编码氨基端的部分基因片段Ct,克隆入胞壁型穿梭表达载体pCW和分泌型穿梭表达载体pDE22。经酶切和序列测定证实,胞壁型和分泌型载体pCW-Sw-Ct和pDE22-Sw-Ct构建成功。为进一步研究含S基因和截短C基因融合的重组BCG活疫苗奠定了基础。     

跨膜型TNF-alpha单克隆抗体腺病毒表达载体的构建和鉴

目的：应用AdEasy-1 系统构建包含tmTNF-alpha单克隆抗体轻、重链序列的重组腺病毒表达载体。方法：首先PCR 合成抗体 轻、重链序列,分别将轻、重链序列插入经过改造的含有双启动子的穿梭质粒pShuttle-2CMV,将穿梭载体电转化转化AdEasy 系 统BJ5183 感受态,挑取单克隆扩增质粒后酶切鉴定。结果：成功构建重组腺病毒表达载体pAdEasy-tmTNF-alpha,抗体重链、轻链序 列酶切后经1%琼脂糖凝胶电泳证实条带片段大小正确,电转化BJ5183 后挑选重组克隆提取质粒,PacI酶切后重组片段位于4.5 kb及3 kb位置,证明重组腺病毒质粒pAdeasy-1-tmTNF-alpha构建成功。结论：将腺病毒系统与单克隆抗体技术相结合,利用AdEasy-1 系统成功构建腺病毒重组tmTNF-alpha单克隆抗体表达载体,为进一步开展肿瘤基因治疗的研究提供基础。     

跨膜型TNF-α单克隆抗体腺病毒表达载体的构建和鉴定

目的:应用AdEasy-1系统构建包含tmTNF-α单克隆抗体轻、重链序列的重组腺病毒表达载体。方法:首先PCR合成抗体轻、重链序列,分别将轻、重链序列插入经过改造的含有双启动子的穿梭质粒pShuttle-2CMV,将穿梭载体电转化转化AdEasy系统BJ5183感受态,挑取单克隆扩增质粒后酶切鉴定。结果:成功构建重组腺病毒表达载体pAdEasy-tmTNF-α,抗体重链、轻链序列酶切后经1%琼脂糖凝胶电泳证实条带片段大小正确,电转化BJ5183后挑选重组克隆提取质粒,PacI酶切后重组片段位于4.5kb及3 kb位置,证明重组腺病毒质粒pAdeasy-1-tmTNF-α构建成功。结论:将腺病毒系统与单克隆抗体技术相结合,利用AdEasy-1系统成功构建腺病毒重组tmTNF-α单克隆抗体表达载体,为进一步开展肿瘤基因治疗的研究提供基础。     

猪圆环病毒Ⅱ型Cap蛋白重组腺病毒的构建与鉴定

猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)是近年来新发现的引起仔猪多系统衰弱综合症的必需病原,含有两个主要的阅读框ORF1和ORF2,分别编码复制相关蛋白(Rep)和核衣壳蛋白(Cap),其中Cap含有病毒主要抗原表位,是研究PCV2基因工程苗的主要候选目的基因。本研究利用PCR技术将Cap蛋白基因克隆入人5型腺病毒穿梭载体(pShuttle-CMV),与腺病毒骨架载体(pAdEasyTM)共转化大肠杆菌BJ5183进行同源重组并转染HEK-293A细胞,经多次亚克隆获得了重组腺病毒rAd-Cap,测定其TCID50为1013.7/mL。用RT-PCR、间接ELISA、Westernblot和IPMA等方法证明了Cap蛋白在腺病毒中获得表达。该研究为发展PCV2的重组腺病毒基因工程疫苗奠定了基础。     

小鼠CCR7基因重组腺病毒的构建与鉴定

目的:构建含有小鼠趋化因子受体-7(CCR7)基因的重组腺病毒,为下一步转染不成熟树突状细胞(imDC)诱导免疫耐受研究奠定基础。方法:提取小鼠胸腺总RNA,应用逆转录PCR(RT-PCR)方法,以自行设计的带有酶切位点的引物,扩增获得CCR7基因全部序列,经过T-A克隆,酶切亚克隆到穿梭质粒pAdTrack-CMV上,在BJ5183菌内和pAdeasy-1同源重组,筛选阳性克隆,酶切鉴定,线性化后脂质体法转染HEK293细胞进行包装、PCR鉴定及扩增,得到含有CCR7基因的重组腺病毒,根据报告基因GFP测定病毒滴度。结果:成功构建小鼠CCR7基因重组腺病毒,病毒滴度为1×10~9U/mL。结论:该重组腺病毒载体的成功构建,为进一步研究携带CCR7基因的imDC的趋化迁移性等研究提供了一定的工作基础。     

猪Ⅱ型圆环病毒ORF2与猪GM-CSF基因重组腺病毒共表达及免疫效果分析

旨在构建含融合基因pGMCSF-ORF2的重组腺病毒,并对其表达水平和免疫效果进行分析.运用PCR方法扩增PCV2 ORF2和pGM-CSF基因,拼接后克隆入pMD18-T载体,然后再亚克隆入腺病毒穿梭质粒pShuttle-CMV中,阳性穿梭质粒经PmeⅠ酶线性化后电转化含腺病毒基因组(AdEasy-1)的大肠杆菌细胞BJ5183-Ad-1,成功获得了重组腺病毒DNA.将纯化后的重组腺病毒DNA转染AD293细胞,经过病毒基因组的PCR和转录水平的RT-PCR及Western blot等方面对融合蛋白的表达进行了鉴定.以该病毒免疫Babl/c小白鼠,对免疫小鼠血清中PCV2抗体进行检测.结果显示,获得了pGMCSF-ORF2重组基因,重组腺病毒载体构建成功,获得了表达pGMCSF-ORF2融合蛋白的重组腺病毒.该病毒免疫小鼠后,在小鼠血清中检测到了PCV2的特异性抗体.获得的重组腺病毒能有效表达pGMCSF-ORF2融合蛋白,且可诱导小鼠产生针对PCV2的特异性抗体.     

汉坦病毒包膜糖蛋白G2重组腺病毒的构建及其在Hela细胞中的表达

本研究旨在构建可表达汉坦病毒(HTNV)糖蛋白G2的重组腺病毒。应用PCR方法扩增G2编码基因,经T/A克隆、测序鉴定后再亚克隆到腺病毒shuttle载体pAd5-CMV中并用磷酸钙沉淀法分别将携带G2编码基因的重组腺病毒shuttle载体与携带报告基因eGFP的腺病毒骨架质粒共转染HEK293细胞,包装、扩增、纯化后得到携带HTNV糖蛋白G2编码基因的重组腺病毒;用重组腺病毒感染Hela细胞并收获蛋白,间接免疫荧光、Western blotting检测蛋白表达。经酶切鉴定表明已成功构建了携带G2基因的重组腺病毒载体;RT-PCR鉴定表明目的基因能够在感染重组腺病毒的Hela细胞中转录;荧光显微镜观察重组腺病毒感染的Hela细胞,可见报告基因eGFP的表达;间接免疫荧光法和Western blotting均证实表达产物可被抗G2单克隆抗体所识别,表明糖蛋白G2在感染细胞中得到了表达。本研究成功构建了可表达HTNV包膜糖蛋白G2的重组腺病毒,转染宿主细胞可稳定表达目的蛋白,为HTNV糖蛋白G2的结晶、结构解析研究以及新型汉坦病毒疫苗的研制奠定了基础。