透明颤菌血红蛋白的表达及对基因工程菌的影响

利用已克隆的透明颤菌(Vitreoscilla)血红蛋白基因(vgb),构建了一批复制类型和抗生标记不同的vgb表达载体,并就vgb基因表达及其对几种基因工程大肠杆菌的影响进行了初步研究。实验证明vgb基因的表达具有氧调控特性,在溶氧水平下跌至20％饱和度时迅速合成。Vgb基因的表达产物(Vitreoscilla Hemoglogin,VHb)可促进青霉素酰化酶和TNF、IL-2等基因工程菌在低氧条件下细胞生长和产物表达的状况,由于vgb基因的表达降低了细胞对氧的敏感程度,可望运用它来改善发酵过程中溶氧控制裕度。这些实验结果预示着vgb基因在耗氧生物过程中,如抗生素工业和基因工程菌高密度发酵,有着良好的应用前景。     

在兽疫链球菌中表达vgb基因和HA合成基因提高透明质酸产量

透明质酸(HA)是一种在医药及化妆品领域具有广泛应用的天然粘多糖。兽疫链球菌(Streptococcuszooepidemicus)是工业上生产透明质酸的菌种之一。透明颤菌血红蛋白(VHb)具有增强细胞摄氧的作用。对生产透明质酸的兽疫链球菌进行了基因改造:将兽疫链球菌HA的合成基因hasABC以及合成透明颤菌血红蛋白的vgb基因(Vitreoscillahemoglobingene,vgb)分别或同时插入阳性菌表达质粒pEU308中,通过电转化导入兽疫链球菌中。通过一氧化碳(CO)差光谱检测到了VHb的表达。在摇瓶实验中,同时带有hasABC和vgb基因的重组菌比野生菌的透明质酸产量提高了30％。而在发酵罐中,带有这2个基因的重组菌的透明质酸产量达到了6．9g／L,高于重组菌5．5g／L的产量。实验结果表明,vgb基因的存在促进了细胞的生长,hasABC操纵子的过表达增强了透明质酸的合成。首次将VHb导入兽疫链球菌中,获得了表达,并证明其对菌体生长及透明质酸合成有促进作用。通过研究,VHb将可以在阳性菌中获得更广泛的应用。     

毕赤酵母中表达透明颤菌血红蛋白提高重组脂肪酶的表达

解脂耶氏酵母胞外脂肪酶Lip2(YlLip2)是一种具有广泛应用前景的工业酶.为了改善高密度发酵生产Y1Lip2过程中的溶氧限制,提高Y1Lip2的表达量,将YlLip2基因lip2和透明颤菌血红蛋白(VHb)基因vgb分别置于AOXl启动子和PsADH2启动子的调控之下,进行YlLip2和VHb在毕赤酵母中的共表达.PsADH2启动子来源于树干毕赤酵母Pichia stipitis,在低氧条件下能被激活.SDS-PAGE和CO-差式光谱分析表明,Y1Lip2和VHb在重组菌中成功实现了共表达.在氧限制性条件下,VHb表达的细胞(VHb+,GS 115/9Klip2-pZPVT)与对照细胞(VHb-,GS 115/9Klip2)相比,摇瓶和10 L发酵罐中YlLip2表达量分别提高了25％和83％.此外,在低氧条件下,VHb+细胞在10 L发酵罐中的生物量也比VHb-细胞高.文中也获得了一株表达了VHb的并携带有多个lip2基因拷贝的克隆子GS 115/9Klip2-pZP VTlip2 49#,在低氧条件下,该克隆子在10L发酵罐中的最高脂肪酶水解活力达33 900 U/mL.因此,在毕赤酵母中用PsADH2启动子表达VHb,同时增加lip2基因的拷贝数是提高YlLip2表达量的一种有效策略.     

透明颤菌血红蛋白的表达对酵母中麦角固醇合成的影响

构建了含透明颤菌（Vistreoscilla）血红蛋白基因vgb和酵母遗传霉素（G418）抗性基因的重组质粒pVgbkanMX4,转化至酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae 1190中,经过分析,基因vgb在酵母细胞中得到表达。对重组菌和野生菌进行了摇瓶培养及5 L发酵罐培养的研究。在摇瓶实验中,重组菌的麦角固醇产量比野生菌有显著提高,在野生菌中的含量为0.573%、而在重组菌中的产量为1.07%。 经过30 h发酵罐培养的实验,野生菌中麦角固醇含量为0.9%,重组菌中其含量为1.38%,验证了摇瓶实验的结果。结果证明vgb基因有利于酵母中麦角固醇的合成。     

透明颤菌血红蛋白基因调控与功能的研究

透明颤菌(Vitreoscila)血红蛋白(VHB)是一种氧调节、氧结合蛋白。其基因(vgb)已被克隆及表达。Vgb基因表达在转录水平上受氧控制．FNR蛋白作为厌氧激活于介入该调节过程。VHb可与氧结合参与细胞代谢过程,使细胞适应贫氧环境。Vgb基因的氧调控启动子和VHb蛋白的生理功能在基因工程和发酵工程具有良好的应用前景。     

Vgb在大肠埃希菌中表达及生物活性的研究

目的将vgb克隆到大肠埃希菌表达载体pQE-30中,研究vgb表达产物对细胞摄氧能力的影响。方法利用PCR和基因重组技术克隆vgb与大肠埃希菌表达质粒pQE V,大肠埃希菌转化采用CaCl2法,VHb活性分析采用CO示差光谱法。结果克隆了vgb和重组质粒pQE V,vgb基因在大肠埃希菌中获得表达,在A420 nm处达到典型吸收峰。结论 vgb在大肠埃希菌中表达产物加强了对氧的摄取能力,对解决细胞高密度发酵培养中氧需矛盾、促进代谢产物的产率具有非常重要的应用价值。     

透明颤菌血红蛋白基因在解淀粉芽孢杆菌中的表达及其影响

将强启动子P43与透明颤菌血红蛋白基因（vgb）通过重叠延伸PCR进行融合,克隆到芽孢杆菌整合表达载体pDG1730中,重组表达载体pDG-P43vgb转化促生防病解淀粉芽孢杆菌FZB42,Wsetern-Blot和CO差光谱分析表明重组菌株FZB42-VHb表达了有活性的VHb蛋白,VHb的表达对重组菌株菌体的生长及抗菌脂肽的产生都有促进作用.在相同培养条件下,重组菌最大菌体密度比原始菌株提高了14.49 %,抗菌脂肽fengycin的产量提高了1.74倍,抗菌脂肽surfactin的产量提高了3.14倍.     

耐高渗透压酵母产生甘油及阿拉伯糖醇的研究IV．耐高渗透压酵母的糖代谢途径

1．测定了两株耐高渗透压酵母(Hansenula arabitolgenes Fang．275及 Zygosaacharo-myces cheyalieri Guill．2．309)无细胞提取液中EMP 及磷酸戊糖循环的酶活力,除在2．309中未能测出磷酸果糖激酶外,其他所测备酶在两株酵母中均有活力。 2．在两株酵母中均有联系NADP的多元醇脱氢酶,催化二攫丙酮还原为甘油(275厦2．309中)以及D-核酮糖还原为D一阿拉伯糖醇(仅在275中)。 3．用葡萄糖-C14的呼吸实赊表明在275号酵母中磷酸戊糖循环占较大比重,这与它能产生大量五碳化合物——阿拉伯糖醇是相符的。     

通过透明颤菌血红蛋白基因表达提高γ-聚谷氨酸的生物合成

γ-聚谷氨酸(γ-PGA)的微生物合成是高消耗氧的生物过程,采取基因工程手段改造γ-PGA生产菌株Bacillus subtilis NX-2,以提高细胞利用氧的能力。利用重叠PCR方法将P43强启动子与透明颤菌血红蛋白(VHb)基因vgb拼接,插入大肠杆菌-枯草芽胞杆菌穿梭质粒p MA5上,得到重组质粒p MA5-P43-vgb,并将其转化至B.subtilis NX-2中,从而获得重组菌B.subtilis NX-2(vgb+)。经SDS-PAGE分析和CO差光谱法证明VHb能在γ-PGA生产菌株中成功表达,且具有生理活性,大小约为1.6×104。在7.5 L发酵罐上对重组菌B.subtilis NX-2(vgb+)进行发酵性能考察,结果显示:重组菌比出发菌的生物量提高了41.2%,γ-PGA的产量提高了7.5%,传代多次表明重组菌具有良好的发酵稳定性。该研究为γ-PGA的进一步工业化生产奠定了基础。     

透明颤菌vgb基因的整合对生物法发酵香兰素的影响

在以阿魏酸为底物生物法转化香兰素过程中,通过Red重组技术用外源的透明颤菌血红蛋白基因(vgb)取代大肠杆菌基因组icdA基因,使菌株可以适应高密度、低溶氧发酵,为香兰素的发酵生产提供新的尝试。CO差光谱分析显示整合的vgb基因表达产生了VHb,且该蛋白具有活性。发酵结果显示表达了vgb基因的新菌株与原重组菌株相比在低氧环境下仍能维持较高的生物量,且香兰素产量由原来的1 668 mg/l上升到2 240 mg/l,提高了约34. 2%。     

透明颤菌血红蛋白基因的研究与应用

总结了近 15年来透明颤菌血红蛋白的研究结果 ,包括它的分布、结构、功能、合成等分子生物学以及在基因工程中的应用。透明颤菌的血红蛋白是 2 0世纪 70年代被发现的 ,由于它具有结合氧的特性 ,可使透明颤菌这一专性好氧的革兰氏阴性菌在贫氧环境中生长。透明颤菌血红蛋白是同型二聚体形式的可溶性血红蛋白分子 ,每分子透明颤菌血红蛋白由两个分子量为 15 775的亚基和两个b型血红素组成。透明颤菌血红蛋白的功能是为透明颤菌强大的呼吸膜增加氧的流量。完整的有功能的血红蛋白由血红蛋白亚基和血红素组成 ,血红蛋白亚基由基因vgb编码 ,血红素由生化代谢合成。透明颤菌血红蛋白基因在野生透明颤菌中是以单拷贝的方式随染色体一起复制表达的。透明颤菌血红蛋白基因已经被克隆和测序。同时也讨论了将透明颤菌血红蛋白基因整合到异源宿主菌中增加重组蛋白产量和发酵产量方面的研究。最后 ,概述了当透明颤菌血红蛋白在植物中表达时 ,转基因植物表现出生长增加以及代谢物产量发生变化的情况。     

透明颤菌血红蛋白基因在产PHB重组大肠杆菌中的引入

将透明颤菌血红蛋白基因 (vgb)采用插入染色体的方式引入产聚 β 羟基丁酸酯(PHB)重组大肠杆菌VG1 (pTU1 4)中 ,以从分子水平上提高克隆菌对氧的利用率 ,解决PHB发酵生产过程中的供氧矛盾 ,透明颤菌血红蛋白的一氧化碳差光谱分析明表 ,vgb基因可以在VG1 (pTU1 4)中成功表达 ,且其表达量受溶氧水平的调控。Vgb基因的引入可以同时促进菌体生长和PHB产品的积累 ,且溶氧水平越低 ,VHB表达量越高 ,这种促进作用就越明显     

透明颤菌血红蛋白基因vgb和腈水解酶基因bxn在毕赤酵母中的表达研究

为获得高效表达外源蛋白的Pichia pastoris菌株而设计了重组质粒pPIC9K—vgbbxn,其中透明颤菌血红蛋白基因vgb胞内表达以提高菌体的发酵密度,腈水解酶基因bxn分泌表达。转化GS115菌株后,通过PCR、SDS-PAGE检测证实两基因已经整合进酵母基因组且能高效表达,以及用准确的蛋白活性测定方法成功地检测到二所表达的产物均具有正常的活性。摇瓶发酵实验证明,血红蛋白在贫氧条件下可明显促进酵母菌体生长和bxn基因分泌表达。     

在链霉菌中表达透明颤菌血红蛋白需要异源启动子

构建了质粒pIJ4083Mpro、pIJ4083\|pro\,pWLD8和pFW3。在浅青紫链霉菌TK24中,启动子探针质粒pIJ4083上的邻苯二酚双加氧酶基因(xylE)不能被透明颤菌血红蛋白基因(vgb)的启动子带动转录,表明vgb启动子在链霉菌中无作用。TK24中,pWLD8和pFW3均能表达透明颤菌血红蛋白(VHb),pWLD8上可能是由Plac带动vgb的表达;pFW3上vgb基因去掉了非必要部分,克隆在PCR扩增得到的glnA启动子下游,两者连成嵌合基因。     

透明颤菌vgb基因在产核黄素B.subtilis中的整合表达研究

目的:将透明颤菌血红蛋白vgb基因应用于核黄素的工业化生产。方法:以枯草芽孢杆菌整合载体pAmyE构建了vgb基因的整合表达载体pAudV,采用化学转化法将vgb基因整合到枯草芽孢杆菌GJ08的染色体上,并通过发酵摇瓶实验检测核黄素的产量。结果:得到产核黄素枯草芽孢杆菌GJ09,摇瓶试验结果表明,在限氧条件下核黄素的产量分别提高了5.23%和3.42%。结论:透明颤菌血红蛋白vgb基因能够促进核黄素产量的提高,可以应用于核黄素的工业化生产中。