麦迪霉素聚酮缩合酶基因的亚克隆及表达

利用与麦迪霉素生物合成有类似途径的放线紫红素聚酮缩台酶基因ActⅠ作为探针,将来源于麦迪霉素产生菌基因文库的与ActⅠ有同源性的阳性初级克隆pcN8812进一步缩小,亚克隆获得了2．4kb的麦迪霉素聚酮缩台酶基因,将其插入pwHM3载体中构建了重组质粒pcG2 DNA。pcG2 DNA在放线紫红素聚酮缩合酶基因缺陷型变株天蓝色链霉菌TKl7及螺旋霉素产生菌S．Ambofaciens中均获得表达。前者所得产物不同于麦迪霉素和放线紫红素,可能为新的杂合抗生素,后者能使螺旋霉素产量得到提高。另外pcG2 DNA在道诺红霉素产生菌调节变株S.peucetiusH6101中的表达产物经TLC及HPLC分析表明为紫红霉酮。pcG2 DNA在Tetracenomycin C产生菌S．Glaucescens中亦有一定的功能表达,而在红霉素产生菌红霉内酯阻断变株Saccharapolyspara erythraea WMH 15,26l中未观察到活性表达。推测pCG2 DNA具有一定调节或在某些聚酮类抗生素产生菌变株中超互补的功能。     

硫霉素生物合成酶基因克隆的研究

利用NTG诱变从硫霉素产生菌中获得了生物合成阻断变株Y₃。通过对Y3变株原生质体形成、再生条件及DNA转化的研究,初步建立了以变株为受体的克隆系统,以pIJ680为载体,从硫霉素产生菌S．Cattleya中鸟枪克隆,获得了能使Y₃变株恢复产生硫霉素的酶基因。根据对Y₃积累的中间产物的分析,认为该酶基因可能与硫霉素生物合成过程中肽的环化作用有关。重组质粒分子大小为9．8kb左右,插入片段大小为4．5kb,分子杂交试验证明插入片段来源于硫霉素产生菌S．Cattleya。     

蓝细菌ORF469的分子克隆和缺失突变工程株的构建

PCR扩增了蓝细菌Synechocystis sp．PCC 6803的ORF469(编码469个氨基酸的开放阅读框),进一步以pUC118为载体将其克隆到E．Coli中,构建了pOQ2质粒。通过DNA体外重组,以红霉素抗性基因取代部分克隆化ORF469片段,又构建丁缺失ORF469片段(保留部分上游和下游序列)的pOQ22质粒。用pOQ22质粒转化Synechocystis sp．PCC 6803野生株细胞,获ORF489缺失突变工程株,它在红霉素抗性培养基上生长正常。对缺失突变工程株DNA的PCR和Southern blot分析证明,Synechocystis sp．PCC 6803的ORF469已被删除。色素测定结果揭示Synechocystis sp．PCC 6803中ORF469表达产物控制细胞内不依赖光的叶绿素生物合成。     

转座子Tn5096对刺孢吸水链霉菌北京变种RF220转座的诱变

用大肠杆菌/链霉菌穿梭质粒pCZA168(bla,tsr,Tn5096,ColEI rep,Strep repts)多次转化农抗120产生菌刺孢吸水链霉菌北京变种(S.Streptomyces hygrospinocus var. beijingensis)RF220的原生质体,均未得到转化子。来自吸水链霉菌应城变种(S.Streptomyces hygroscopicus var.)10-22突变株的链霉菌质粒pIJ702(tsr mel+)可以转化RF220,但转化频率只有数十个转化子/μgDNA。用来自RF220本身的pIJ702对消除pIJ702后的RF220的原生质体进行了再转化,转化率没有明显的提高。用氨苄青霉素和甘氨酸协同处理RF220的菌丝体,并经-70℃冷冻原生质体再转化,得到了4个pCZA168的转化子。质粒提取、酶切、抗性测定表明：4个转化子中pCZA168中大肠杆菌DNA部分均被切除,成为大小约50～60kb的小质粒,命名为pWZH102(tsr,Tn5096,strep repts)。用pWZH102上的转座子Tn5096对RF220进行转座实验,在168个转座个体中,有2株可能为抗生素生物合成阻断变株,另有产生抗生素水平各异的变株,说明Tn5096的转座可以引起表型的不同变化。     

红霉素链霉菌突变株的生化互补和红霉素生物合成途径的研究

红霉素链霉菌经不同诱变因素处理后,采用琼脂块法大量筛选得到26株无活性菌株,再用琼脂条共合成方法测定了这些无活性菌株351对互补菌株对,其中85对有共合成能力的生化互补菌株。根据供体菌与受体菌(或转化菌)生化互补共合成红霉素的特性,26株无活性菌株可分为4个类群:这4个类群液体培养共合成试验结果,有的互补对红霉素产量在1,500微克/毫升以上,这为提取和研究红霉素生物合成的中间产物提供了方便。根据固体和液体生化互补顺序,初步绘制了26株无活性突变株的红霉素生物合成途径。     

生米卡链霉菌变株丙酰化酶基因的克隆和表达

麦迪霉素产生菌生米卡链霉菌(streptomyces mycarofaciens)变株具有丙酰化酶活性,可以将螺旋霉素转化为丙酰螺旋霉素。为了进行丙酰化酶基因克隆,本实验以质粒pIJ702为载体通过鸟枪克隆法将变株DNA片段克隆至变铅青链霉菌TK54(Streptomyces livdansTK54),经薄层层析和高压液相色谱分析结果表明,在转化子中,N0．9菌株可以将螺旋霉素转化为丙酰螺旋霉素,这证明丙酰化酶基因已在变铅青链霉菌TK54中克隆并得到初步表达,№．9重组质粒插入DNA片段为4．16kb,经southern杂交表明确实来源于变株。此外还构建了N0．9重组质粒的限制酶酶切图谱。     

硫霉素环化酶基因在变铅青链霉菌TK24中的表达及基因定位

将含有硫霉素环化酶基因的重组质粒p6BCl2转化变铅青链霉菌(Streptomyceslividans)TK24,含有p6BCl2的转化子细胞抽提液分别与琉霉素生物合成阻断变株Y,发酵液以及纯化的Y。中间产物经过体外共培养可产生活性物质．化学分析表明与Y,发酵液混合后产生的是硫霉素,与纯化的Y。中间产物混合产生的是一种不稳定的活性物质。说明硫霉素环化酶基因在S.lividans TK24中得到了表达,其产物以Y。中间产物为底物并弥补了Y,中的缺陷。对p6Bcl2中4．5kb外源片段进行了限制酶酶切分析,建立了酶切图谱．利用含硫霉素环化酶基因的S．Lividans TK24转化子体外转化Y,的应用体系,将硫霉素环化酶基因定位在0．9kb Hinc I—Pst I片段上,并证明了硫霉紊环化酶的活性与IPNS同源片段无关。以上实验为进一步研究琉霉素环化酶基因的结构打下了基础。     

苏芸金杆菌的质粒检测及载晶体蛋白合成基因的质粒在不同菌株间的传递

分析了苏芸金杆菌(Bacillus thuringiensis)7个变种19个野生菌株及无晶体(sp+cr-)和无芽孢(sp-cr+)突变株的质粒图型,证实了苏芸金杆菌的质粒组成既有变种的特异性,亦有菌株的特异性。载有晶体蛋白质合成基因的质粒,B. thuringiensis var．Kurstaki HD-191 菌株可能为42和50Mdal,B．Thuringiensis var. aizawai HD-282菌株为47Mdal, B．Thuringiensis var．Israelensis IPS-82菌株为57Mdal的质粒,而B．Thuringiensis var. wuhanensis 140 菌株的此种基因则可能不在质粒上而在染色体中。HD-191载晶体蛋白合成基因的质粒以很高频率被传递给其无晶体突变株HD-1并在后者细胞中表达。B. thuringiensis var. israelensisIPS-82菌株和 B．Thuringiensis var. kurstaki 无晶体突变株HD—1之间载晶体蛋白合成基因质粒的传递未能成功,提示可能存在着不相容性的障碍。     

中国毛白杨根癌土壤杆菌的类型和对土壤杆菌素敏感性的研究

从我国北方8个毛白杨根癌病发病苗圃分离到根癌土壤杆菌(Agrobacterlum tume[actena)8株。经质粒型、生物型、寄主范匿和对土壤秆菌素agfocin 84和D286的敏感性测定,证明5株系nopaline质粒型,其中生物I型2株,生物|I型2株,I—II中间型1株,3株系agroplne质粒型,其中生物I型2株,生物II型1株。所有分离菌株均系宽寄主群,其中1株经回接能侵染单子叶植物美人蕉(Canna inaiea),水仙(Narcissus)和吊兰(Chlorophytum)。分离菌株中,5株nopaIine质粒型菌榫对土壤杆菌素84敏感,3株agropine质粒和3株生物I型nopali 质粒菌株对土壤杆菌素])286敏感。在温室中,合并使用两种土壤杆菌素产生菌——放射土壤杆菌(A．Radiobaccer)K84和D286的菌体悬浮液,预浸毛白杨和向目荚幼苗根部 或与致病的毛白杨根癌土壤杆菌共接种枝茎,降低根瘟病诱发率达94％以上。表明放射土壤扦菌K84和D286可以控制毛白杨根癌病。     

鸡传染性支气管炎病毒中国流行株免疫原S1基因的分子克隆、序列分析及其DNA免疫的初步研究*

对来源于我国华东地区的鸡传染性支气管炎病毒流行株QD免疫原Sl基因cDNA进行了克隆、序列分析和DNA免疫的初步研究。RT—PCR扩增QD毒株的S1基因,将其5’和3’端分别进行分子修饰后插入克隆载体pUCl8的BamHⅠ／HindⅢ位电,在大肠杆菌中实现了目的基因的克隆;利用英国IBV毒株Sl全基因核酸探针与QD毒株S1基因的重组克隆质粒分子杂交后,采用HaeⅢ,PvuⅡ和XbaⅠ等限制酶对此流行毒株S1基固cDNA进行了酶切分析;在测定QD毒株S1基因5’端高变区核苷酸序列并以此与IBV　M41,H120,6／82及Beaud等参考毒株序列对比分析的基础上,构建了QD株S1基因DNA免疫表达质粒,肌肉注射免疫小鼠后,鸡胚病毒中和试验的结果表明,IBV S1基因DNA免疫表达质粒能诱导小鼠产生病毒特异的中和抗体,具有良好的免疫原性,初步显示基因疫苗在鸡传染性支气管炎防治上应用前景。     

柔红霉素产生菌SIPI-1482中dnmV基因功能的阻断及恢复

dnmV基因产物为柔红霉素生物合成途径中TDP-6-脱氧己糖C4酮基还原酶,破坏该基因能阻断柔红糖胺的合成,进而阻断柔红霉素的产生。从天蓝淡红链霉菌(S. coeruleorubidus)SIPI-1482基因组DNA中经PCR扩增出dnmV及其上游dnmU基因片段,并由此构建了用于阻断dnmV基因的同源重组质粒pYG817,转化SIPI-1482菌株后成功地破坏了dnmV基因,发酵结果显示阻断突变株不再代谢产生柔红霉素,为引入新的基因来改变代谢产物的糖基结构打下了基础。通过导入dnmV基因表达质粒可重建该突变株的生物合成途径,恢复产生柔红霉素,但产量比出发菌株要低。     

苏云金芽孢杆菌蜡螟变种伴孢晶体蛋白基因的克隆及表达

用改进的碱解法分析基因供体菌苏云金芽孢杆菌蜡螟变种81-6(Bacillus thuringiensis var.galleriae 81-6)株有两种小质粒和一种大质粒。 将碱解法抽提到的质粒用Pstl完全酶解,与同样用PstI完全酶解的载体质粒pcAMPUC连接,以此重组质粒转化苏云金杆菌无晶体蛋白突变株 Bacillus thuringiensis var,kurstaki HD-1 Cry—B株的原生质体。用ELlSA法筛选到一株阳性转化菌落,分析了其质粒组成和插入片段的大小。毒性试验显示阳性转化子对昆虫幼虫有毒杀作用。     

吸水链霉菌Streptomyces hygroscopicus 17997中噬菌体基因转移系统的建立及其应用

由吸水链霉菌Streptomyces hygroscopicus 17997产生的格尔德霉素geldanamycin(GA)属安莎类抗生素, 具有良好的抗肿瘤和抗病毒活性。本文应用链霉菌温和噬菌体C31衍生的KC515载体,在吸水链霉菌S.hygroscopicus 17997中建立并优化了S. hygroscopicus　17997的基因转染体系。利用所建立的基因转染体系,以基因阻断技术从S. hygroscopicus 17997基因文库含有多组PKS基因柯斯质粒中,鉴定了与GA PKS生物合成相关基因的柯斯质粒,该工作为GA生物合成基因簇的克隆奠定了基础。     

黑暗链霉菌DNA同源重组系统的构建

以黑暗链霉菌Tt-49基因组为模板,利用PCR方法,扩增安普霉素生物合成关键基因aprF-G的上、下游序列,作为同源交换臂,并将红霉素抗性基因筛选标记及其启动子插入两交换臂之间,以温敏型质粒pKC1139为基础,构建用于阻断黑暗链霉菌Tt-49安普霉素生物合成的重组质粒pFD8.该质粒通过E.coil ET12567/pUZ8002去甲基化修饰后,经接舍转移进入黑暗链霉菌Tt-49,利用红霉素抗性筛选得到3株阳性转化子,分别命名为Tt-49 AG1、Tt-49 AG2和Tt-49 AG3.通过PCR鉴定,证明pFD8已插入黑暗链霉菌Tt-49基因组的目标位点.以亲株作对照,对3株工程菌进行红霉素抗性能力考察,发现3株工程菌的抗红霉素能力均高迭1 000 μg/mL以上.     

巴西固氮螺菌Yu62 draTG基因及其下游区域的定位诱变分析*

用卡那霉素盒(Kmr-cassette)插入法,对巴西固氮螺菌(Azospirillum brasilense)Yu62的draTG基因及其下游区域进行了诱变,并获得相应的突变株。研究表明：draT变突株的固氨酶活性不再受铵抑制,而draG突变株在有铵时则丧失固氮酶活性,但当铵耗尽后却不能像野生型菌株那样恢复活性。draTG下游区域突变株YZ4(突变位点距draG约2kb)在无氮及限铵条件下,其固氮酶活性比野生型菌株的高,但其nifH-lacZ转录融合子的表达并不受影响,说明该区域可能有参与固氮酶活性水平调控的基因。     

螺旋霉素聚酮合成酶基因和抗性基因的克隆与表达的研究

根据不同聚酮合成酶基因DNA的同源性,利用放线紫红素聚酮合成酶基因act Ⅰ,actⅢ作探针,从螺旋霉索产生菌Str．spiramyceticus U-1941基因文库中检测并分离了螺旋霉素聚酮合成酶基因pCN3H8。限制酶酶切分析表明,其分子量为44kb。通过分子杂交实验,将螺旋霉素聚酮缩合酶基因(与act Ⅰ有同源性)及聚酮氧化还原酶基因(与actⅢ有同源性)进行了定位。pCN3H8 DNA在麦迪霉素产生菌变株Str.mycarofaciens sub sp．68中的表达产物,经紫外光谱分析与麦迪霉素相似。pCN3H8在放线紫红素聚酮缩合酶基因缺陷型变株Str．coelicolor TKl7中的表达产物,不具有放线紫红素的色素,其纸层析谱型与螺旋霉素有显著差别。pCN3H8在变青链霉菌Str．lividans TK24中的表达产物,也具有抗菌活性。将pCN3H8 DNA转化对螺旋霉素敏感的Str.griseofuscus原生质体,获得了螺旋霉素抗性的表达。从转化子中分离得到了质粒DNA pSG3,其分子量为7．0kb,可能是pCN3H8DNA转化Str．grlseofuscus时在体内缺失而形成。再转化实验证明,宿主菌对螺旋霉索的抗性,确实是由于pSG3 DNA作用的结果。含质粒pCG4,pSG3的螺旋霉素产生菌Str．Ambofaciens转化子螺旋霉素的产率明显提高。     

我国植物青枯菌的内生质粒及其与致病性的关系

检测了来自我国不同地区的龙葵、苎蔗、芝蔗、木蔬黄、油橄榄、桑、烟草、姜、辣椒、茄、蕃茄、甘薯、花生和马铃薯等14种寄主植物的51株野生型青枯菌的内生质粒(1ndigesPlasmid),并对其中20株野生型菌株及其相应的20株“突变型”菌株进行了质粒的比较研究。14株野生型菌株和10株“突变型”菌株含有1或2个质粒,质粒分子量不一,最小的在5Md以下,最大的为120Md。有些野生型菌株(ssl、Snl、E4、Pc2、Tin9、Z2、P3、PoI、P03、Po¨．)和它们的“突变型”菌株均不含质粒;另一些野生型菌株(MS、M6、El、P9．)和它们相应的“突变型”菌株却具有电泳迁移率相同的质粒;这些菌株的致病性与质粒的存在没有关系。但某些野生型菌株(P7、P8。zl、z3、M2、P041．)不含质粒,而它们的“突变型”菌株中却出现了质粒,这些菌株的致病性的丧失与质粒的形成之间可能有关。     

樱桃根癌土壤杆菌及其对土壤杆菌素84敏感性的研究

从山东、河北、辽宁等地樱桃园的樱桃冠瘿瘤和土壤样品中分离到46株根瘤土壤杆菌。经鉴定有4株是Agrobacteriumtumefaciens（原生物型1）,其余42株是A.rhizogenes（原生物型2）。这些菌株所诱导的冠瘿瘤中均合成胭脂碱（nopaline）,属胭脂碱型Ti质粒的根癌土壤杆菌,并对放射土壤杆菌K84菌株所产生的土壤杆菌素84敏感。由于K84菌株对含胭脂碱Ti质粒的根癌土壤杆菌有很好的抑制效果,因此,用K84菌株防治樱桃根癌病是有应用前景的．     

与慢生大豆根瘤菌吸氢和固氮作用有关的基因克隆

用Tn5插入导致的T-1(His Hup Fix)变株为受体,从慢生大豆根瘤菌USDA 110基因文库中钓取His+结合子10株,经捡测,它们都不同程度地恢复了Hup+与Fix+功能,从它们的DNA琼脂糖凝肢电泳图上,可见到都有一个分子量大小各异的pLAFRI：：his质粒,其中5株接合子的重组质粒已转入E．Coli HB101中,从它们的质粒电泳图型再显示其分子量各有差异,经 Southern转移之后,分别用hup探针和nif探针进行DNA杂交分析,明确Ecr菌株的质粒能与hup和nif探针杂交,Ec。菌株的质粒能与hup探针杂交,其它三株虽能解除Hup Fix-功能上的缺陷,但其质粒DNA序列上并无与nif或hup序列有同源性的成份     

含庚型肝炎病毒E2基因片段质粒DNA能诱发相当强烈的体液免疫应答

研究了庚型肝炎病毒E2(HGVE2 )基因片段作为DNA疫苗的可行性。将来自于质粒pThioHis-E2编码HGVE2的基因片段 (559bp)亚克隆到质粒pCMV-S中 ,使之和HBsAg基因位于同一阅读框 ,形成重组质粒pCMV-S-E2。用纯化的质粒pCMV-S-E2DNA注射到昆明小鼠后腿四头肌中来免疫小鼠 ,同时用pCMV-S作为对照。间隔 14天再加强一次免疫。在加强免疫后的第 8天眼眶取血。用E2-GST融合蛋白作为固定化抗原 ,通过ELISA检测受试小鼠的体液免疫应答。结果表明 ,用质粒pCMV-S-EDNA免疫的小鼠可以产生很强的体液免疫应答。