人细小病毒B19与自然流产关系的研究

无菌留取 5 4例自然流产妇女和 43例妊娠无异常孕妇血清 ,用聚合酶链反应 (PolymeraseChainReaction ,PCR)检测的人细小病毒B19(HumanParvovirusB19,B19)DNA ,在自然流产组中人细小病毒B19DNA有 15例阳性 ,阳性率为 2 7.78%。正常对照组中 ,人细小病毒B19DNA有 2例为阳性 ,阳性率为 4.65 % ,用x2 检验 ,x2 =8.86,P <0 .0 1,两组有非常显著性差异。由此总结 ,人细小病毒B19感染可能是导致自然流产的原因之一     

HHV-8与非Kaposi肉瘤组织相关性的初步研究

目的:检测人类疱疹病毒8型(HHV-8)在四种非Kaposi肉瘤皮损组织中的感染情况,以初步探讨HHV-8与皮肤鳞状细胞癌、蕈样肉芽肿、Castleman病和化脓性肉芽肿相关性研究.方法:使用酚-氯仿-异戊醇方法对新疆维吾尔自治区人民医院皮肤性病科、病理科从2004年到2009年收集的30例鳞状细胞癌、20例Castleman病(其中5例为多中性Castleman病)、13例蕈样肉芽肿、20例化脓性肉芽肿石蜡包埋组织进行HHV-8DNA抽提;然后使用巢式PCR方法对抽提的DNA进行ORF26基因片段的扩增,扩增产物在1.5%的琼脂糖凝胶上电泳,并在凝胶成像系统下观察电泳结果,从而确定ORF26基因阳性标本:然后计算HHV-8在各种标本中的阳性率.结果:30例皮肤鳞状细胞癌皮损组织有5份为阳性(16.7%).13例蕈样肉芽肿石蜡组织有1例为阳性(7.7%),20例化脓性肉芽肿和20例Castleman病石蜡组织中均未检出HHV-8.结论:①HHV-8可能是新疆皮肤鳞状细胞癌发病原因之一.②HHV-8与蕈样肉芽肿的发病可能不具有相关性,HHV-8可能是MF发生后偶发的一种附带感染.(③Castleman 病和化脓性肉芽肿的发病可能均与HHV-8无关.     

犬细小病毒中国内蒙株VP2基因克隆及序列分析

从我国内蒙古地区流行的犬细小病毒病病犬的肠溶物中分离提纯犬细小病毒(CPV).提取病毒基因组DNA,并以此DNA为模板,采用人工合成的引物进行PCR 扩增,PCR产物经BamHI、SacI双酶切后,克隆于pUC19质粒的BamHI/Sac I位点.重组质粒pUCVP2经PCR鉴定、限制酶切分析和序列分析,结果表明:获得了犬细小病毒内蒙株(CPV-IM)VP2基因的全长克隆, VP2基因全长1755nt,与国外报道的美国1株(CPV-N)、美国2株(CPV-B)和猫全白细胞减少症病毒(FPLV)的核苷酸序列同源性分别为99.32%、98.29%、98.52%,氨基酸序列同源性分别为98.87%、97.09%、97.77%.     

应用多重PCR方法检测石蜡包埋组织标本中的分枝杆菌DNA

应用多重PCR方法检测并鉴别石蜡包埋组织中的结核分枝杆菌复合体与非结核分枝杆菌DNA扩增片段类型 ,为结核分枝杆菌复合体感染与非结核分枝杆菌感染的病理学诊断提供一种补充的鉴别诊断方法。应用三对具有特异性的寡核苷酸引物 ,进行多重PCR扩增。这三对引物分别对应于分枝杆菌 6 5kD表面抗原、结核分枝杆菌插入序列IS6 1 1 0及人类β 珠蛋白基因的部分序列 ,其扩增产物分别为 3 83bp、1 2 3bp和 2 6 8bp。此种多重PCR方法检测的灵敏度为 0 6pg。经多重PCR扩增后进行凝胶电泳 ,结核分枝杆菌复合体 (结核分枝杆菌、牛型结核分枝杆菌、BCG)均可见 3 83bp、1 2 3bp片段 ,而非结核分枝杆菌 (鸟、龟、瘰疬、蟾蜍、堪萨斯、胞内、耻垢分枝杆菌 )仅见 3 83bp片段 (猿猴分枝杆菌与结核分枝杆菌复合体相同 )。与上述相比 ,分枝杆菌感染的临床标本分别增加了一条 2 6 8bp片段。对 2 0 9例临床初步诊断为淋巴结结核病人的石蜡包埋组织标本进行了多重PCR检测 ,1 93例病理诊断为淋巴结结核、结核性肉芽组织、结核性肉芽肿性炎症病人的标本 ,检测结果符合结核分枝杆菌复合体感…     

犬细小病毒的PCR诊断试剂盒的研制

目的　建立检测犬细小病毒的PCR诊断试剂盒。方法　通过在犬细小病毒 (CPV)的基因组中设计的特异性寡核苷酸引物 ,利用PCR技术研制犬细小病毒的PCR诊断试剂盒。结果　在特定的反应条件下 ,使用该试剂盒能特异地扩增含有犬细小病毒的样品 ,且能检出痕量 (10ng)的犬细小病毒DNA ,被测粪样只需进行简单煮沸就能进行PCR反应 ,该试剂盒能在常温下保存 1周以上、4℃保存 1年以上。同血凝试验 (HA〕及单克隆抗体ELISA方法比较 ,对 6 6份样品进行检测 ,显示该PCR试剂盒具有特异、灵敏等优点。结论　成功研制了犬细小病毒的PCR诊断试剂盒 ,利用该试剂盒能从DNA水平上对犬细小病毒进行监控     

疱疹病毒科研究进展

疱疹病毒是一类大型双链DNA病毒.至今已发现9种疱疹病毒可感染人类,分别是单纯疱疹病毒1型、2型(HSV-1、2)、带状疱疹病毒(VZV)、EB病毒(EBV)、人巨细胞病毒(HCMV),以及人疱疹病毒(HHV)-6A、HHV-6B、HHV-7、卡波济肉瘤相关病毒(HHV-8)等,它们是已知感染人类的病毒种类数最多的一个病毒科.     

兰州地区女性感染HPV及其基因类型分析

目的:了解兰州地区成年女性感染人乳头瘤病毒(humanpapillomavirus,HPV)及其基因类型分布状况,为本地区HPV分子流行病学研究提供理论依据。方法:利用PCR技术分别对100例妇科门诊就诊者进行HPV基因亚型检测。结果:100例样品中,HPV DNA检出率为19%(19/100),其中HPV16 DNA感染率15%(15/100),HPV58 DNA感染率3%(3/100),HPV18 DNA感染率2%(2/100),HPV 16与HPV18双重感染1例。结论:本地区成年女性HPV感染主要以HPV16多见,而HPV16与恶性肿瘤密切相关,因此对HPVDNA阳性者定期随访,有利于宫颈癌的防治。     

基于基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱的猪呼吸道病毒多目标鉴定方法的建立和应用北大核心

【目的】建立能高效同步鉴定猪伪狂犬病毒(porcine pseudorabies virus,PRV)、猪圆环病毒2型(porcine circovirus 2,PCV-2)和3型(porcine circovirus 3,PCV-3)、非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)以及猪博卡病毒1型(porcine bocavirus group 1,PBoV-G1)、2型(porcine bocavirus group 2,PBoV-G2)和3型(porcine bocavirus group 3,PBoV-G3)等呼吸道病毒的核酸基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS)高通量多目标检测技术。【方法】根据7种病原体基因的保守序列,分别设计不同病原的引物及对应的单碱基延伸探针,通过引物浓度和反应条件优化,方法特异性、敏感性和稳定性分析,以及临床样本和猪源产制品的检测验证,建立常见猪呼吸道DNA病毒的MALDI-TOF MS多目标检测体系。【结果】质谱分析显示,多目标检测体系的7种靶标产物峰只在特定病毒阳性样品检测时产生,与其他病原体检测无交叉反应,表明该方法对7种靶标病毒检测特异性良好。重复性试验结果分析显示,体系中每种病毒在高、中、低浓度时批内阳性符合率均≥98.0%,批间均≥98.3%,表明该方法具有较高的稳定性。体系中7种病原体每种病毒最低检测限在8.65–26.27拷贝/μL之间,与荧光PCR(real-time fluorescence quantitative PCR,RT-qPCR)检测方法相当。采用MALDI-TOF MS多重检测方法对100份组织、饲料和猪肉样品进行检测应用,检出2种及以上混合感染样品39份,其中5份样本同步检出5种病原体阳性;对8份ASFV-p72假病毒人工污染样品进行验证,均可检出ASFV阳性。将以上样本检测应用结果与荧光PCR方法进行比对验证,2种方法对于不同病原体检测结果的符合率高达94.4%–100%。【结论】本研究建立的基于MALDI-TOF MS的猪呼吸道常见DNA病毒多重检测方法为猪群相关疫病快速监测和鉴别诊断,以及便利化进出口动物检疫等提供了一种新的敏感、特异的高通量多目标检测技术。     

禽流感病毒M1蛋白的表达及其免疫反应性分析

根据已发表的禽流感病毒M1基因序列设计合成PCR克隆引物,自接种H5N1亚型病毒的鸡胚组织中提取RNA,反转录后采用高可信度DNA聚合酶(PyobestTM DNA Polymerase)经PCR扩增M1基因,采用Invitrogen定向表达系统(ChampionTM pET directional TOPO expression system)进行克隆表达,纯化获得N末端携带多聚组氨酸标签的重组蛋白,分子量约29.8 kDa.采用单克隆抗体和阳性血清经ELISA、阻断ELISA、免疫印迹分析重组蛋白的免疫反应性.结果发现重组M1蛋白能与单克隆抗体和阳性血清发生特异性结合,且此结合能被天然病毒抗原阻断.研究表明重组蛋白M1具有良好免疫反应性.     

抗CⅡTA核糖核酸酶P抑制Daudi细胞表面MHC-Ⅱ类抗原的

探讨抗MHC-Ⅱ类分子转录激活因子(CⅡTA)的核糖核酸酶P对Daudi细胞表面MHC-Ⅱ类分子表达的抑制作用.M1-RNA 是核糖核酸酶P的催化活性单位.以pTK117质粒为模板,PCR扩增带有抗CⅡTA第452及629位点的引导序列的M1-RNA (M1-452-GS 及M1-629-GS),再分别插入pUC19载体(pUC19-M1-452-GS和pUC19-M1-629-GS).从Raji细胞中克隆CⅡTA基因DNA片段 (114～800)后插入pGEM-7zf(+)质粒.将重组M1-RNA与靶基因的mRNA进行细胞外共孵育,显示仅pUC19-M1-629-GS可特异性地切割靶基因mRNA.再将M1-629-GS克隆入psNAV载体(pA629)并稳定转染Daudi细胞株,RT-PCR检测其CⅡTA的mRNA水平,流式细胞术检测其HLA DR、DP、DQ抗原表达.与对照组比较,M1-629-GS阳性Daudi细胞的CⅡTA mRNA含量减少90.19%(P<0.05),其HLA DR、DP、DQ抗原表达分别降低91.97%、90.19%、92.36%(P<0.05).研究表明,抗CⅡTA的核糖核酸酶P可通过抑制CⅡTA 的转录而降低Daudi细胞表面的MHC-Ⅱ类分子的表达.     

人类疱疹病毒7开放读码框U41功能的初步探讨

应用免疫荧光检测U41蛋白的细胞内定位,RT-PCR检测U41RNA的表达时相,DNA结合试验检测U41蛋白对单、双链DNA的不同结合能力,对人类疱疹病毒7(human herpesvirus 7,HHV-7)U41的部分功能进行分析鉴定.免疫荧光检测显示,无论在HHV-7感染细胞或HHV-7 U41转染细胞,U41蛋白都是仅在其胞核中呈弥漫性分布.在分别加入环己酰亚胺(cycloheximide)和磷甲酸(phosphonoformic acid)作为蛋白合成和核酸合成抑制剂的感染细胞中,U41的表达时相检测结果显示,U41蛋白在HHV-7感染细胞中是一早期表达蛋白.通过DNA结合试验发现,U41蛋白能结合单链DNA而不能结合双链DNA.提示U41的主要功能是保持DNA模板的合适构型,以便DNA的延伸和病毒DNA的合成.     

人疱疹病毒6型基因编码蛋白研究进展

人疱疹病毒6 型( HHV-6) 是一类嗜人淋巴细胞的双链DNA 病毒, 属疱疹病毒β亚科。研究推测HHV-6 基因组可编码80 ～100 种蛋白质, 包括膜蛋白、即刻早期( IE) 蛋白、DNA 蛋白、DNA 包装蛋白、病毒装配蛋白等。本文就HHV-6 基因编码蛋白的特性和功能研究进展予以综述。     

广州地区艾滋病患者中人类疱疹病毒8感染及部分序列的检测

检测广州地区艾滋病患者中人类疱疹病毒8(HHV-8)的感染状况并完成部分序列的测序,从而了解HHV-8感染相关的Kaposi’s肉瘤在本地区艾滋患者中可能的罹患风险,并初步探讨HHV-8在本地区是否存在基因序列的变异。使用n-PCR法检测患者唾液中的HHV-8 DNA,PCR产物经ABI3100系统直接测序。结果显示在广州地区艾滋病患者中唾液HHV-8 DNA阳性率为20.0%,而在作为对照的健康组的阳性率为0.0%,艾滋病患者组与健康对照组间具非常显著性差异;检测的部分碱基序列未发现变异。提示在广州地区的艾滋病患者中存在较高的HHV-8感染。     

头颈部肿瘤基因组中HPV16DNA的同源序列

利用头颈部肿癌临床活检新鲜组织和石蜡包埋组织的两种处理标本,分别采用核酸分子杂交和聚合酶链反应(PCR)两种技术,分析了头颈部肿瘤组织基因组中人乳头瘤病毒16型的同源序列,并研究HPV16的感染同头颈部肿瘤发生发展的关系。结果表明:1.喉鳞状细胞癌DNA中有HPV16 DNA同源序列,检测频率在20.0％以上。2.PCR扩增石蜡包埋肿瘤组织DNA中HPV16的URR(病毒基因上游调控区)中的序列,电泳分析扩增产物在喉乳头状瘤、喉癌、鼻腔内翻性乳头瘤和口腔癌中检测率分别是11.1％、20.0％、42.9％和27.3％。3.研究表明HPV16 DNA阳性率与喉癌原发部位,分化程度和临床分期之间可能有一定的相关性。人乳头瘤病毒可能是头颈部肿瘤的病毒病因之     

猫肾F_(81)传代细胞中犬细小病毒原位PCR检测方法

目的　建立在猫肾F81 细胞中犬细小病毒原位PCR的检测方法。方法　在猫肾F81 细胞上感染犬细小病毒 ,设计特异性引物 ,用直接原位PCR法在染毒 12h ,2 4h ,48h细胞片上检测出犬细小病毒 ,并与常规免疫组化的方法进行了比较。结果　在染毒 48h的细胞片上 ,用阳性记分法将两种检测方法得到的阳性细胞进行统计比较 ,差异极显著 (P <0 .0 0 1) ,用原位PCR法所得出的阳性率高。结论　原位PCR法检测犬细小病毒具有敏感性高和组织定位的优点     

DNA微阵列芯片在皮肤分枝杆菌感染中的早期诊断价值

目的研究DNA微阵列芯片在皮肤分枝杆菌感染早期诊断中的临床应用价值。方法应用传统方法(包括病理学以及培养和测序鉴定)和DNA微阵列芯片技术对6例临床疑似皮肤分枝杆菌感染患者的皮肤组织进行检测。结果 6例患者的发病诱因多有海鲜接触史或外伤史,表现为单发或是呈淋巴管样排列模式;传统的细菌培养有5例患者阳性,经过测序鉴定分别为海分枝杆菌4例、龟分枝杆菌1例;DNA微阵列芯片技术检测6例患者均为阳性,其中海分枝杆菌5例,龟分枝杆菌1例;DNA微阵列芯片技术阳性率(6/6)高于传统的培养技术(5/6),此外检测时间也远低于传统培养技术。结论DNA微阵列芯片技术具有简便、快速、高敏感等特点,可鉴定皮肤分枝杆菌感染的致病菌种,为临床做出早期诊断和治疗提供依据。     

用光敏生物素标记探针检测宫颈癌、尖锐湿疣及假性湿疣组织中HPV DNA

人乳头瘤病毒(简称HPV)能引起人皮肤及粘膜的多种良恶性肿瘤,特别多见于女性生殖系统如宫颈癌、尖锐湿疣和假性湿疣。但由于HPV尚不能在体外细胞培养中增殖,因此目前对其研究主要用核酸杂交和PCR方法,检测HPV DNA。本文采用光敏生物素标记HPV16、HPV18 DNA探针,分别对宫颈癌组织进行斑点杂交,检测宫颈癌组织中HPV16、18DNA并以正常宫颈组织做对照。以同样方法用HPV6b DNA探针检测尖锐湿疣及假性湿疣组织中HPV6b DNA。结果如下:18例宫颈癌组织中仅有1例与HPV16 DNA探针杂交阳性(5.7%);10例与HPV18杂交刚性(55.6%);4例为HPV16+18混合杂交阳性(22.2%)。12例尖锐湿疣组织中8例与HPV6b DNA杂交阳性(66.7%);12例假性湿疣组织中有6例与HPV6b探针杂交阳性(50%)。10例正常宫颈组织对照均为阴性。     

人类疱疹病毒7型糖蛋白gB、gH、gL、gO介导细胞融合

人类疱疹病毒 7 型(HHV-7)的感染依赖于包膜糖蛋白在病毒生命周期的多个阶段发挥功能. 这些蛋白质可以介导病毒吸附,病毒包膜和宿主细胞膜融合以及病毒在细胞间的接触传播. 将表达 HHV-7 糖蛋白的 293T 细胞与 HHV-7 易感的SupT1 细胞共培养,检测虫荧光素酶报告基因的表达,以鉴定介导膜融合的 HHV-7 糖蛋白. 研究发现,HHV-7 糖蛋白 gB、gH、gL、gO 能介导 293T 细胞与 SupT1 细胞的融合,且融合可被抗 CD4 单抗所抑制. 结果表明,糖蛋白 gB、gH、gL、gO对于 HHV-7 引发的膜融合是必需的,其中某个蛋白质或所形成的蛋白质复合物可能是 CD4 的配体.     

用显微切割技术和催化信号扩增法检测何杰金病瘤细胞(H/RS)中的人巨细胞病毒

为明确何杰金病 (Hodgkin’sdisease ,HD)瘤细胞中是否存在人巨细胞病毒 (humancytomegalovirus,HCMV)感染 ,采用显微切割技术结合PCR方法检测HD组织及其瘤细胞Hodgkin/Reed Sternberg(H/RS)中的HCMV核酸 ;采用免疫组织化学催化信号扩增 (catalysedsignalamplification ,CSA)法检测HD中HCMV的立即早期抗原、早期抗原和基质蛋白。结果在 5 4例HD中选取 13例HD的H/RS细胞 ,经显微切割分离后有 4例 (30 8% )经PCR扩增出HCMV的核酸 ;5 4例HD组织中 ,经PCR检测有 10例 (18 5 % )扩增出HCMV的核酸 ;CSA染色显示有 6例(11 1% )HCMV立即早期抗原和早期抗原 (DDG9/CCH2 )阳性 ,5例 (9 3 % )基质蛋白 (AAC10 )阳性。对照的 17例反应性增生淋巴结中HCMV核酸的PCR检测 ,以及三种HCMV抗原的CSA检测 ,均为阴性。表明HD组织的H/RS细胞中存在HCMV核酸和抗原 ,而反应性增生淋巴结中不存在 ,提示HCMV可能参与了何杰金病的发病过程。