大鼠体内气管损伤修复过程及气管干细胞的定位研究

目的观察大鼠体内气管损伤修复过程,进行气管干细胞的定位.方法应用氟尿嘧啶(5-FU)诱发在体气管上皮损伤,动态观察修复过程;对损伤后气管上皮细胞行Hoechst33342荧光染色,并用RT-PCR法检测ABC转运蛋白ABCG2/bcrp1基因.结果1.5-FU作用30min后大鼠气管上皮细胞绝大部分脱落,可见少量间隔分布的类似裸核的细胞呈钉状位于基底膜上,免疫组化检测增殖细胞核抗原阴性,证明为G0期细胞.其中部分细胞Hoechst33342染色阴性,为侧群(side population,SP)细胞.2.将5-FU 去除3-6h后,上皮细胞形态变为扁平,9-12h 后细胞变为立方,细胞数目逐渐增多,24h上皮细胞数更多,连接成片,可见纤毛,48h 接近恢复假复层纤毛柱状上皮.3.RT-PCR检测ABCG2/Bcrp1阳性反应产物长度为272bp.结论5-FU打击后,残余的G0期气管上皮细胞中含有干细胞.     

胎儿胰岛样细胞团源上皮样细胞分离、纯化和鉴定

旨在优化胰腺干细胞分离、鉴定的方法和体系,为糖尿病研究和治疗提供种子细胞。采用胶原酶消化法,分离培养出胰岛样细胞团(ICCs),对其进行贴壁培养,从中纯化出上皮样细胞。采用MTT法测定其生长情况并绘制生长曲线。采用免疫组织化学染色检测分离得到细胞的PDX-1、PCNA、CK-7、CK-19、Nestin、Glut2、Vimentin、Insulin表达情况。应用流式细胞仪检测其表面标志。由分离培养的ICCs成功纯化出上皮样细胞;传40代,每代冻存106~108个细胞;生长曲线显示其传代第3天进入对数生长期,第5天进入平台期;免疫组织化学染色显示其表达PDX-1、PCNA、CK-7、CK-19、Nestin、Glut2、Vimentin;不表达Insulin;流式细胞仪分析表明其表达CD29、CD44、CD166,不表达CD11a、CD14、CD34、CD45、CD90、CD105、CD117。由胎儿胰腺能分离出具有自我更新能力的上皮样细胞,为导管来源,具干细胞特性。     

小鼠角膜上皮祖细胞系TKE2的表型研究

目的：观察小鼠角膜上皮祖细胞系TKE2在扩增以及分化状态下的角蛋白及干细胞标志物的表达情况。方法小鼠角膜上皮祖细胞系TKE2在无血清培养基Keratinocyte-SFM （KSFM）以及含10﹪胎牛血清（FBS）的DMEM培养基中培养,约70﹪融合时进行角蛋白10、12、14、15、16（K10、K12、K14、K15、K16）以及Connexin43、ABCG2的免疫荧光染色,以及Ki67、P63、PCNA的免疫细胞化学染色。结果无血清培养状态下的TKE2细胞呈克隆样生长,克隆内所有细胞呈ABCG2、K14、Ki67、PCNA以及P63阳性,K15阳性细胞散在分布,K16阳性细胞呈片状分布于克隆中央区,K10、K12以及Connexin43染色为阴性。在含有10﹪胎牛血清的DMEM中培养2 d后,细胞明显增大, ABCG2、K15、P63、Ki67以及PCNA转为阴性,克隆内只有少量细胞呈K16、K14阳性染色, K10、K12、Connexin43仍为阴性。结论 TKE2细胞具有角膜上皮干细胞特性,可以作为角膜缘上皮干细胞表型维持和分化诱导研究的良好工具。     

过表达细胞周期蛋白的Dl对成熟表皮细胞去分化为表皮干细胞的作用

目的：观察过表达细胞周期蛋白D1（CCND1）对成熟表皮细胞去分化为表皮干细胞的调控作用。方法：构建携带CCND1基因的真核表达载体PEGFP-N1-CCND1,将PEGFP-N1-CCND1转染人成熟表皮细胞,5 d后,倒置显微镜下观察细胞形态;细胞计数法观察细胞的增殖情况;免疫荧光法检测表皮干细胞标志抗原β1整合素和成熟表皮细胞标志抗原CK10的表达变化。结果：转染PEGFP-N1-CCND1后,细胞体积变小,核浆比例增大;细胞增殖较快,细胞数量比对照组增加了4倍（P<0.01）;表型检测结果显示,转染PEGFP-N1-CCND1组,表达干细胞标志性蛋白β1整合素表达阳性,成熟表皮细胞标志性蛋白CK10表达阴性,而转染空载体组则相反。结论：CCND1过表达能够诱导成熟表皮细胞去分化为表皮干细胞。     

小鼠受精卵、卵裂球和桑椹胚细胞无SP表型

SP(side population)表型的概念在干细胞研究中用来表示某些细胞具有的将进入细胞的荧光染料如Hoechst 33342排出细胞的特性, 这种表型的形成与ABCG2蛋白有关. 近年研究报告某些干细胞及某些前体细胞具有SP表型, 并提出SP表型可能是干细胞或前体细胞的筛选标志. 在本研究中通过分离了小鼠受精卵、2细胞期及8细胞期卵裂球、桑椹胚和囊胚并直接进行Hoechst 33342染色, 结果发现小鼠受精卵、卵裂球、桑椹胚细胞都不具有SP表型, 但是处于其分化下游的囊胚中的内细胞团细胞却具有明显的SP表型, 而同一囊胚中的滋养层细胞却不具有SP表型. 该结果表明来源于内细胞团的胚胎干细胞具有的SP表型是内在的, 与体外培养条件无关; 另一方面该结果也提示SP表型至少是多能干细胞所具有的独特表型之一, 但并不存在于更早期的全能干细胞. 当在培养液中加入ABCG2蛋白抑制剂后直接导致囊胚中的内细胞团细胞SP表型消失, 提示囊胚内细胞团细胞SP表型的形成与ABCG2蛋白具有密切相关性. 以上结果表明并不是所有的干细胞都具有SP表型, SP表型可能可以作为某些种类的干细胞, 如胚胎干细胞及某些成体组织干细胞的分选标志, 但并不具有普遍性.     

阿尔巴斯绒山羊胎儿皮肤干细胞的分离培养及鉴定

该研究旨在体外分离培养和鉴定阿尔巴斯绒山羊胎儿皮肤干细胞,为绒毛生长相关研究提供实验材料。以阿尔巴斯绒山羊胎儿皮肤为样本,酶消化和IV型胶原黏附法获得较纯的皮肤干细胞。通过形态学观察、生长曲线、细胞免疫组化、实时定量PCR和体外分化等方法探讨皮肤干细胞体外培养方法和生物学特性。结果发现,皮肤干细胞形态较小,铺路状生长,折光度高且黏附能力强,在体外培养至20代未出现明显细胞形态变化。免疫组化染色显示,胎儿皮肤干细胞阳性表达Krt15、CD34和Itgβ1。Krt15、CD34和Itgβ1 m RNA相对水平分别为绒山羊角质细胞的5.56、24.37和7.22倍(P0.01)。体外成骨诱导Von Kossa染色呈阳性;成软骨诱导阿尔新蓝染色呈阳性;成肌诱导后,Hoechst 33342染色观察到细胞融合的发生,Myo G免疫组化染色呈阳性。结果表明,成功建立了阿尔巴斯绒山羊胎儿皮肤干细胞系。     

大鼠骨髓基质干细胞的分离培养与向神经元样细胞诱导分化的实验研究

目的 探讨大鼠骨髓基质干细胞的提取、分离培养和体外扩增的最佳条件,研究其在体外培养中定向诱导分化为神经元样细胞的可能。方法 通过密度梯度离心和贴壁培养法从成年大鼠骨髓中分离骨髓基质干细胞,进行培养扩增,观察其生长特性;用2-巯基乙醇(β-mercaptoethanol,β-ME)对传代细胞诱导分化,并通过免疫细胞化学染色鉴定分化细胞的类型。结果 原代培养时形成由基质干细胞组成的细胞集落,细胞集落14d时接近融合,传代后,细胞体积变大,约5～7d传代一次。β-ME诱导后,70％以上的细胞在形态上呈神经元样,免疫细胞化学染色呈NSE阳性,GFAP阴性,说明诱导分化的细胞为神经元,而不是星形胶质细胞。结论 骨髓基质干细胞在体外培养条件下生长良好,并可连续传代;在β-ME作用下可被诱导分化为神经元样细胞。     

整合素—配体结合反应上调兔支气管上皮细胞抗氧化能力

支气管上皮细胞（BECs）的抗氧化活性对于改善上皮的抗损伤能力、维持上皮结构和功能的完整性具有重要意义。BEC表达的整合素分子是细胞外基质成分如纤维连接蛋白（Fn）的受体,与细胞的生长、分化、代谢调控有关,为论证整合素－配体结合反应对细胞抗氧化活性的影响,本实验用臭氧攻击培养的兔BEC,观察用EFn或其特异性识别域片段RGD肽处理后细胞内谷胱苷肽过氧化物酶（GSH－Px）、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（catalase）三种抗氧化酶活性变化和谷胱苷肽（GSH）含量的变化。结果：（1）Fn及RGD肽均呈剂量依赖性地提高GSH－Px活性（分别为r=0.93和r=0.73),Fn的上调作用可被钙调素抑制剂W7逆转;（2)Fn可提高SOD活性,但能被W7阻断;（3）Fn增加细胞的catalase活性,W7可取消这一效应;（4）Fn和RGD肽处理增加细胞内GSH含量,且有量－效关系（相关系数r分别为0.82和0.84）。以上结果提示,细胞外基质与整合素结合可增强细胞的抗氧化酶活性,增加GSH含量,以及提高抗氧化损伤能力。     

紫花牡荆素诱导人肝癌HepG2细胞凋亡的研究

目的：研究紫花牡荆素（Casticin）对肝癌HepG2细胞增殖抑制和凋亡诱导的作用,并探讨其作用机制。方法：用终浓度为0、0.5、1.0、2.0umol/L的Casticin作用于HepG2细胞,于12、24、48h后采用MTT法检测细胞增殖抑制率;Hoechst33342核染色,观察细胞形态学变化;24h后收集各组肝癌HepG2细胞,流式细胞术检测细胞周期及凋亡率;RT-PCR检测survivin mRNA表达。结果：MTT法检测显示,Casticin对肝癌HepG2细胞有增殖抑制作用,并存在浓度和时间依赖关系;Hoechst33342染色后,可见核染色质凝集,凋亡细胞呈致密浓染,与对照组相比,Casticin处理后凋亡细胞比例增加;Casticin作用24h后,细胞被阻滞于G2/M期,随药物质量浓度的增加,细胞凋亡率逐渐增加;RT-PCR结果显示,Casticin下调肝癌HepG2细胞survivin mRNA表达。结论：Casticin在体外对肝癌HepG2细胞有明显的增殖抑制和凋亡诱导作用,初步推断Casticin诱发肝癌细胞凋亡与其对survivin基因表达的抑制有关。     

诱导胚胎干细胞向角膜上皮细胞分化的实验研究

探索胚胎干细胞在表层角膜缘基质诱导下向角膜上皮细胞分化的可能性. 体外培养带GFP标记的 ES-D3细胞, 并利用视黄酸进行预诱导, 然后将预诱导后的细胞接种在表层角膜缘基质上, 细胞融合形成单层后, 随机分为3组进行研究: 第1组传代后直接进行检测; 第2组在 气-液界面上培养10天, 然后植入裸鼠皮下以进行体内诱导; 第3组作为对照组, 不给予GFP-ES-D3细胞特殊诱导条件, 细胞自由分化. 诱导分化的细胞植入裸鼠皮下体2周后没有畸胎瘤形成. 诱导分化的细胞呈现上皮样外观, 体内诱导组和体外诱导组免疫组织化学染色均检测到CK3, P63和PCNA表达阳性, 电子显微镜检查可见两组细胞表面都有微绒毛和细胞间紧密连接形成. 实验对照组部分细胞脱落和死亡, 大部分表现神经样细胞的树突样外观, 小部分未死亡的贴壁细胞呈多态性, 这些结果表明胚胎干细胞在特定条件下经表层角膜基质诱导能够分化为角膜上皮细胞. 胚胎干细胞诱导分化有可能为眼表重建和组织工程化角膜的构建提供上皮种子细胞.     

植酸酶固体发酵条件的研究

黑曲霉Ｇ２.１．１．１．４菌株在产生植酸酶时受无机磷的反馈阻遏,并且植酸酶的产生与淀粉酶的产生存在相互抑制。对植酸酶固体发酵进行调控和通过响应面分析优化发酵条件,提高了植酸酶产量。最适发酵条件下,植酸酶（ＰｈｙｔＡ）的产量可达６２．１ｕ／ｇ．干基。     

中国球子蕨科植物化学分类研究

本文对中国球子蕨科2属4种植物的乙醇提取物进行纸层和薄层析分析。发现其主要化学成分黄酮类化合物的分布与科、属、种的分类有一定相应性,为进一步研究分类问题提供化学证据。     

论Paracarinachitids

研究证明Paracarinachitids的外骨骼都不是由8个骨板组成,骨片具有清楚的微层构造,表明它们是由叠覆的生长层组成,每个生长节上有一个小刺,在顶端下侧面前端都有肾形缺凹。同一标本上存在顶端部的融合和远顶端部的分节彼此递交的现象表明这种表象上的差异是后期次生磷灰石包裹或腐蚀的结果;其下侧缘融合和下侧面无缝隙的现象说明将Paracarinachites spinus的骨片分成头板、中间板和尾板是没有根据的。骨片表面存在的针状体是成岩作用的产物,它是粘土矿物和磷酸盐针状结晶体而不是多板纲的骨针。凡此强有力地说明Yangtzechiton是Paracarinachites的晚出同义名。根据形态功能、组织结构,特别是叠覆状排列的骨片和孤立的生长节等特征,paracarinachitids 可能与zhijinitids有密切关系,但两者是否同源尚缺少进一步的证据、据此,笔者认为将paracarinachitids 暂置于分类位置未定的具骨片后生动物较妥。     

雄蚤阳茎体的研究：角叶蚤科三种雄蚤阳茎体的观察

用光镜和扫描电镜观察鞋形共系蚤Syngenopsyllus calceatus (Rothochild)、无值大锥蚤Macrostylophora euteles (Jordan et Rothschiold)和不等单蚤Monopsyllus anisus(Rothechild)的阳茎体侧面、背面和腹面。其中三种蚤阳茎体的背、腹面和无值大锥蚤阳茎体的侧面形态结构是首次报道。鞋形共系蚤有一对明显的阳茎囊突和一对与其相连的"c-骨片", 首次报道该蚤具有前距。无值大锥蚤具一对“茄形骨片”,阳茎钩突末端分为长而宽的腹叶和短而末端尖的背叶,阳茎内突后半部分特化为“后阳茎内突”。三种蚤的钩突桩略呈牛角形,由后弯向前。三种蚤阳茎体的形态结构差异显著,指出了它们是分类上值得注意的特征。认为交配时阳茎杆只在一定范围内作定向滑动。将阳茎体从蚤体内解剖出来,并且观察其背腹面,有助于清晰、完整和准确地观察其形态结构。