农抗5102产生菌原生质体融合育种的研究Ⅳ．融合子FR—008的验证及其产生新活性物质的分离和鉴别

本文在探索5102－l号抗生素液相色谱HPLc)分析法的基础上,从出发菌株10—22和融合子FR-008的发酵物中均分离出5102—1号抗生素的主要组分,进一步证实融合子FR·008为吸水链霉菌应城变种种内融合的重组子。实验还从融合子FR一008的发酵物中分离和纯化了出发菌株不能产生的活性物质,通过与浓硫酸和浓盐酸反应呈深兰色,紫外可见光谱在403,380,360,340nm处有吸收峰等特征,表明它是一种七烯大环内酯类抗生素。在建立该抗生素中芳香残基的液相色谱分析法时,证明其中含有对氨基苯乙酮残基。用氨基酸分析仪测定经硫酸甲醇醇解和醇解产物再水解后的抗生素样品,表明它含有与已知七烯大环内酯类抗生素不同的氨基糖残基,其详细结构有待进一步研究确定。     

吸水链霉菌应城变种和庆丰链霉菌种间原生质体融合及其融合子的生物学特性

本文报道利用抗生素产生菌吸水链霉菌应城变种Leu^-Sm^R。90-11菌株(Leu’smr)和庆丰链霉菌A_553-1菌株(Pro^-Sm^R)为亲株,以42％的PEG4000为助融剂,进行了种问原生质体融合,用间接法检出融合重组子38株,其重组频率约为4．5×10^-4。重组子除孢子丝形态外,孢子堆颜色、抗药性、抗菌活性和抗生素生物合成能力方面与亲株均有一定差别,而且不同重组子之间也不相同,特别在抗菌活性方面,其中重组子FL-42和FL-48不仅具有两个亲株所产生的4种抗生素的活性,而且还产生两个亲株不具有的活性物质。通过纸层析谱表明,这种活性物质,两个重组子之间也不相同。     

用原生质体融合技术选育2—酮基—L—古龙酸高产菌株的研究

对革兰氏阳性的地衣芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）Ｈ１９和革兰氏阴性的２－酮基－Ｌ－古龙酸产生菌Ｓ１９的原生质体的制备条件进行了研究,并采用聚乙二醇作诱导剂进行了两菌株的原生质体融合,用链霉素作为抗性标记对融合子进行了选择。从１７株产生２－酮基－Ｌ－古龙酸的融合子中选出了一株连续传代八次产酸高且产量稳定的融合子１５号。融合子１５号具有两个亲本菌株所具有的一些特性。     

原生质体融合提高农抗武夷菌素的效价

从农抗武夷菌素产生菌不吸水链霉菌武夷变种菌株Co-N-31诱变获得两个突变株M35(Leu^-,孢子颜色灰色)和M46(ser^-.孢子颜色灰白色),并以此两突变株为直接亲本在25％ PEG1000诱导下进行种内原生质体融合。M35和M46原生质体再生率分别为3.72％和0.248％,重组频率为55.20％。采用间接法选择营养标记互补的稳定的原养型重组子,并从中获得一株高产菌株F31-24;其效价比原始亲本Co-N-31提高了82％。薄层层析结果表明,菌株F31-24和Co-N-31的发效产物在Rf值为0.50和0.26处均有斑点,但含量有异。测定斑点生物活性证明其均有抑菌活性。温室试验表明,菌株F31-24发酵产物对小麦白粉病的防治效果优于菌株Co-N-31。     

构建直接发酵淀粉产生酒精的酵母融合菌株的研究

以酒精酵母和热带假丝酵母为亲本,通过单亲灭活原生质体融合技术,获得了既具有糖化酶活性又能高产酒精的稳定的酵母融合株,并测定和比较了融合子的细胞大小、DNA含量以及比增长率μ、淀粉利用能力、乙醇耐受性、α-淀粉酶和糖化酶活力等生产性能。属间原生质体融合率为9.2×10^-6。F1和F5两株融合子性状较好,酒精发酵产量可达8.8%和11.5%,具有良好的应用前景。     

多杀菌素生产菌原生质体的制备条件及其再生菌株生理特性

为了改良多杀菌素生产菌种,提高多杀菌素产量,研究了甘氨酸添加浓度、溶菌酶作用时间、温度和浓度对多杀菌素生产菌刺糖多胞菌Saccharopolyspora spinosaSP06081菌株原生质体制备和再生的影响,并考察了不同再生培养基和渗透压稳定剂对其再生的影响,确定了该菌株原生质体制备和再生的最佳条件。同时,对原生质体再生菌株的形态与多杀菌素产量变化进行了比较研究。结果表明:菌体在添加0.2%的甘氨酸的TSB培养基中培养48h收集,0.1mg/mL溶菌酶,28oC作用20min制备原生质体,将原生质体涂布于以蔗糖为渗透压稳定剂的R2YE培养基中,原生质体再生数目最多,达108个/mL以上;原生质体再生菌株在形态和抗生素产量上产生分化,29.3%的再生菌株形态上保持与亲本菌株一致,具有菌丝松散,断裂分枝多的特点,其中53.2%的再生菌株多杀菌素产量变异向正方向移动,最高产量达到582.0mg/L,比亲本菌株提高85.6%。原生质体再生菌株的形态分化与多杀菌素产量具有重要相关性。     

诺卡氏菌原生质体融合重组研究

本文报道Nocardia sp.48(Str^r Rif^s)和Nocardia sp．189(Str^sRif^r)原生质体融合结果。42％PEG6000获最高融合频率。经一定时间的表型延迟后检出抗性互补的融合子。用电子显微镜观察了原生质体融合过程。融合子形态多样,耐双药性状稳定。有四株融合子产生亲本没有的甾体转化中间休．三株融合子产生亲本没有的抗生物质,还得到一株甾体转化活力明显高于亲本的融合子。     

凤尾菇和盖囊侧耳原生质体非对称融合的研究

盖囊侧耳的双核体原生质体经过灭活处理作为供体与带有营养缺陷型标记的凤尾菇单核体原生质体受体融合,得到大量生长速度和菌落形态差异较大的融合子,这些融合子主要显示了供体菌株的特性,数次转接和进行原生质体再分离后,有的融合子再生菌株恢复了供体亲本的遗传特性,同时获得了一些新的生理特证。结果表明原生质体非对称融合可以作为食用菌原生质体融合育种的一种有效方式。     

凤尾菇和盖囊侧耳原生质体非对称融合的研究

盖囊侧耳的双核本原生质体经过灭活处理作为供体与带有营养缺陷型标记的凤尾菇单核体原生质体受体融合,得以大量生长速度和菌落形态差交大的融合子,这些融合子主要显示了供体菌株的特性,数次转接和进行原生质体再分离后,有的融合子再生菌株恢复了供体亲本的遗传特性,同时获得了一些新的生理特证。结果表明原生质体非对称融合可以作为食用菌原生质体融合育种的一种有效方式。     

双亲灭活制备粘质沙雷氏菌和红曲霉的跨界产色素融合子

目的:采用双亲灭活原生质体技术制备粘质沙雷氏菌和红曲霉的跨界产色素融合子,并测定其抑菌活性。方法:经0.2%溶菌酶处理获得粘质沙雷氏菌的原生质体并热灭活;经混合酶(0.8%溶菌酶+1.2%蜗牛酶+1.6%纤维素酶)处理获得红曲霉的原生质体并紫外灭活;用含25%PEG的原生质体融合剂进行促融合与再生。观察融合子的菌落形态和色素合成能力,测定融合子色素提取物对金黄色葡萄球菌的抑制活性。结果:在优化条件下,粘质沙雷氏菌原生质体的形成率为92.58%,红曲霉原生质体形成数约为106个/mL,两菌原生质体灭活率均为100%。共获得13个融合子,9个能产红色素,融合率为1×10-5%。其中8个融合子的95%乙醇提取物对金黄色葡萄球菌表现出不同程度的抑制。结论:采用双亲灭活原生质体技术,能够制备具有抑菌活性的粘质沙雷氏菌和红曲霉的跨界产色素融合子。     

双亲灭活制备粘质沙雷氏菌和红曲霉的跨界产色素融合子

目的：采用双亲灭活原生质体技术制备粘质沙雷氏菌和红曲霉的跨界产色素融合子,并测定其抑菌活性。方法：经0.2%溶菌酶处理获得粘质沙雷氏菌的原生质体并热灭活;经混合酶（0.8%溶菌酶＋1.2%蜗牛酶＋1.6%纤维素酶）处理获得红曲霉的原生质体并紫外灭活;用含25%PEG的原生质体融合剂进行促融合与再生。观察融合子的菌落形态和色素合成能力,测定融合子色素提取物对金黄色葡萄球菌的抑制活性。结果：在优化条件下,粘质沙雷氏菌原生质体的形成率为92.58%,红曲霉原生质体形成数约为106个/mL,两菌原生质体灭活率均为100%。共获得13个融合子,9个能产红色素,融合率为1×10-5%。其中8个融合子的95%乙醇提取物对金黄色葡萄球菌表现出不同程度的抑制。结论：采用双亲灭活原生质体技术,能够制备具有抑菌活性的粘质沙雷氏菌和红曲霉的跨界产色素融合子。     

棒状杆菌原生质体的形成、再生以及融合的初步探讨

Corynebacterium 属中的一些种是生产氨基酸的重要菌株。它们对蛋清I容菌酶和其他几种酶均不敏感。作者用0.4—0.8u／ml青霉素G处理对数期菌令菌体,可明显增加对蛋清溶菌酶的敏感性。继而用0.5—1.0mg／ml的蛋清溶菌酶,于37℃,12—15小时保温,渗透压敏感细胞可达99％以上。在丁二酸钠高渗完全培养平皿上,原生质体再生率可达20％。C. pekinenseAS 1.563与C. crenutum 82原生质体融合率为3×10-4 每对原生质体。融合菌株不稳定呈现出不同程度的分离现象。对融合菌株发酵产物——氨基酸进行了纸层析,70％的融合株同时产生两亲株所产的氨基酸,10％菌株不产生两亲株所产的氨基酸。通过光学显微镜和电镜技术,观察了原生质体的形成、再生和原生质体聚集现象。     

庆大霉素产生菌棘孢小单孢菌原生质体形成、再生及融合重组的研究

在含0．3％甘氨酸的液体培养基中培养庆大霉素产生菌——棘孢小单孢菌,其菌丝形态有明显的改变,易被溶菌酶消化细胞壁而释放大量原生质体。菌丝的培养龄影响其相应原生质体的再生活性(即再生成菌落的能力)。以72h为最佳,48及120h菌龄的原生质体再生频率依次相当于72h的40％和10％左右。以PEG4000为融合剂。用直接法检出重组子,重组频率约为10～6,融合重组子中有一些菌株庆大霉素的摇瓶发酵效价在1900u／m1左右,比对照菌株有很大的提高。     

5种光合细菌种间原生质体融合及优良农用融合子的筛选鉴定

处于对数生长期的光合细菌球形红假单胞菌(Rhodopseudomonassphaeroides)、沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)、嗜酸红假单胞菌(Rhodopseudomdnasacidophila)、深红红螺菌(Rhodospirarubrum)、万尼氏红微菌(Rhodomocrobiumvannielii),经溶菌酶(3mg/L)处理50min后,获得了它们的菌体形成的原生质体,其再生率分别为80%、71%、82%、61%、74%.取等量的亲本菌株在35%的PEG(MW6000)诱导下两两融合5min,共10种组合.其融合率为球×沼2.5×10-4、球×嗜2.1×10-4、球×深2.0×10-4、球×万2.1×10-4、沼×嗜2.8×10-4、沼×深2.4×10-4、沼×万2.6×10-4、嗜×深2.0×10-4、嗜×万2.3×10-4、深×万2.4×10-4.经影印法鉴定:形成的融合子可以分别生长于以相应的有机物为唯一碳源的培养基上,所有融合子体积均相当于两亲本株体积之和,融合子菌落形态特征介于两亲本株之间.从中随机挑选100个融合子,以辣椒苗作为靶标植物,从上述融合子中筛选到了1株具有显著促进作物生长、提高抗病性的融合子.     

克鲁维酵母种间原生质体融合的研究

乳酸克鲁维酵母(Kluyueromyces lactis Y12—1)和脆壁克鲁维酵母(K.fragilis8554)是乳糖酶生产菌株。应用原生质体融合技术进行了两菌株种问融合的研究。通过试验．原生质体形成及再生的最佳条件为：对数期的细胞,2％的蜗牛酶．30℃酶解30分钟．原生质体形成率90％以上,再生率20%左右。原生质体融合由聚乙二醇(PEG)诱导。K.lactisY12-l不能旋酵菊糖;K.fragilis 8554不能同化D－松三糖和麦芽糖;利用二菌株自身的营养缺陷性质获得融合子。融合子既能发酵菊糖又能同化D－松三糖和麦芽糖;融合子的DNA含量约为二亲株之和;融合子的菌落形态与亲株相比有一定差别．在以乳糖为碳源的培养基中,融合子的乳糖酶产量提高14一l6％;连续15次传代,融合子稳定。     

链霉菌耐温型种间融合重组子淀粉酶热稳定性的比较研究

通过庆丰链霉菌M15S与吸水链霉菌井冈变种^#75菌株的原生质体种间融合,得到稳定的耐温型重组子F1-38和F6-6等,其生长的上限温度分别为53℃和63℃,而亲株Ml5s和~#75则分别为39℃和50℃。将这两个重组子产生的淀粉酶的耐温性与双亲株的淀粉酶相比较表明,这两个耐温型重组子淀粉酶的热稳定性均高于亲株;随着菌体培养温度的提高,淀粉酶的热稳定性增加,一些重组子的淀粉酶活力大大提高。     

啤酒酵母原生质体的制备、融合及再生

本文以16号(his~-)啤酒酵母和STA(ade~-)啤酒酵母作出发菌株进行原生质体融合,并探讨了菌龄、酶解时间,菌体分散程度和培养基种类等对原生质体融合的影响。     

天然无抗菌活性链霉菌种间原生质体融合与活性重组体的分离

天然无抗菌活性的变青链霉菌1326与链霉菌1254的营养缺陷型变株进行种间原生质体融合,获得了原养型融合体,频率为10^-6—10^-5。融合前双亲株原生质体经52℃水浴处理4min,融台频率有所提高,约有一半的融合体菌株在琼脂平板上培养后显示有不同程度的抗菌活性,但绝大多数皆不稳定。从755株融合体中筛选到5株抗菌活性较稳定的菌株,并对其中三株所产生的抗生素作了初步鉴别。发现一株产生中性脂溶性抗生素,其余两株所产生的抗生素皆为碱性非典型脂溶性物质。尽管此等产物的理化性质还有待进一步鉴别,从中发现新化合物的几率是否大于传统的筛选途径,也还需要更多的筛选实践才能说明,但为了进一步开发利用微生物资源,这一途径似值得探讨。     

芽孢杆菌原生质体的形成,再生及种间融合的研究

原生质体融合技术不仅能使遗传基因高频率重组,而且可以集双亲优良遗传性状为一体.自Schaeffer等人成功地进行了微生物原生质体融合以来,这项技术便广为人们所接受.枯草芽孢杆菌分泌的抗菌蛋白能抑制多种植物病原菌的生长,苏云金芽孢杆菌生成的伴孢晶体蛋白可毒杀植物害虫.利用原生质体融合技术将这两种芽孢杆菌抑菌杀虫的遗传特性融为一体,选育出防治植物病虫害的新一代生防菌株成为可能,有关这方面的研究国内外尚未见报道.本文报道了抗菌蛋白产生菌TG26-10和晶体蛋白产生菌AS1.904-17原生质体的形成,再生及种间融合的影响因素,为进一步筛选目的融合子提供基础.     

芽孢杆菌原生质体的形成、再生及种间融合的研究

原生质体融合技术不仅能使遗传基因高频率重组,而且可以集双亲优良遗传性状为一体.自Schaeffer等人成功地进行了微生物原生质体融合以来,这项技术便广为人们所接受.枯草芽孢杆菌分泌的抗菌蛋白能抑制多种植物病原菌的生长,苏云金芽孢杆菌生成的伴孢晶体蛋白可毒杀植物害虫.利用原生质体融合技术将这两种芽孢杆菌抑菌杀虫的遗传特性融为一体,选育出防治植物病虫害的新一代生防菌株成为可能,有关这方面的研究国内外尚未见报道.本文报道了抗菌蛋白产生菌TG26-10和晶体蛋白产生菌AS1.904-17原生质体的形成,再生及种间融合的影响因素,为进一步筛选目的融合子提供基础.