重楼皂苷Ⅰ对肝癌细胞的增殖及凋亡的影响

探讨重楼皂苷Ⅰ(paris saponinⅠ,PSⅠ)在体外对人肝癌SMMC-7721细胞株增殖和凋亡的影响及相关机制.MTT法检测PSⅠ对肝癌SMM-C7721细胞株的增殖抑制作用,Hoechst 33528染色法观察细胞核的形态学变化,流式细胞术Propidium iodide(PI)染色检测细胞周期及凋亡的情况,免疫印迹的方法检测Fas、Bcl-2、Bax、细胞周期素D1(cell cycle regulatory factor D1,Cyclin D1)和细胞周期素E(cell cycle regulatory factor E,Cy-clin E)的表达情况.PSⅠ能时间和浓度依赖性的抑制肝癌SMMC-7721细胞的增殖,与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05).干预后的SMMC-7721细胞染色质浓缩,核碎裂,凋亡小体形成,呈典型的凋亡变化.细胞周期阻滞于G1期,并且有凋亡峰形成,呈浓度依赖性.PSⅠ能浓度依赖性地上调Fas和Bax的表达,下调Bcl-2、Cyclin D1和Cyclin E蛋白的表达水平.PSⅠ可能是通过阻滞肿瘤细胞的生长及诱导细胞凋亡等机制,从而抑制肝癌细胞的增殖.     

HMBA诱导人肝癌SMMC-7721细胞分化的观察

本文研究HMBA对人肝癌SMMC-7721细胞的诱导分化作用.细胞生长曲线测定和细胞分裂指数观察显示HMBA可明显抑制细胞增殖,细胞生长抑制率达64.14%,分裂指数抑制率为53.88%.光镜和透射电镜观察可见HMBA能诱导人肝癌SMMG-7721细胞形态和超微结构发生恢复性改变.生化检测或免疫细胞化学方法观察显示,HM-BA处理后细胞γ.谷氨酸转肽酶(γ-GT)活性和甲胎蛋白(AFP)、增殖细胞核抗原(PCNA)表达均降低,而酪氨酸.酮戊二酸转氨酶(TAT)活性增强.流式细胞仪分析表明HMBA引起细胞发生G0/G1期阻滞.以上结果表明HMBA能有效抑制人肝癌细胞恶性增殖活性,逆转肝癌细胞恶性形态与超微结构特征,改变肝癌细胞相关酶活性和抗原表达,引发G0/G1期阻滞,从而对肝癌细胞具有明显的诱导分化作用.     

罗格列酮对裸鼠移植性人肝癌细胞生长的抑制作用

目的:研究罗格列酮(rosiiglitazone,ROZ)对裸鼠体内人肝癌SMMC7721细胞增殖的影响.方法:建立人肝癌裸鼠移植瘤模型,实验动物分为罗格列酮治疗组及对照组.观察罗格列酮对移植瘤体积和重量的变化,采用光镜观察移植瘤细胞形态学变化,流式细胞术检测移植瘤细胞周期分布,免疫组织化学和蛋白印迹检测瘤组织内增殖细胞核抗原(proliferating cellnuclear antigen,PCNA)蛋白表达变化.结果:罗格列酮在体内能明显抑制移植瘤的生长,抑瘤率为50.81%;组织学显示治疗组瘤细胞异型性降低,核质比下降;流式细胞术分析显示,对照组移植瘤细胞处于G2/M期细胞为13.1%,与对照组比较,治疗组处于G2/M期细胞显著增多(29.1%).免疫组织化学和蛋白印迹检测均显示检测显示,经罗格列酮处理后,裸鼠移植瘤组织PCNA蛋白表达明显下调(P＜0.05).结论:罗格列酮可体内抑制人肝癌SMMC7721细胞增殖,并使癌细胞阻滞于G2/M期.     

TGFα对肝癌细胞SMMC-7721增殖和ERK蛋白的影响

目的观察TGFα诱导肝癌细胞增殖和对信号传导因子ERK蛋白表达的影响.方法应用MTT比色法观察不同浓度TGFα对肝癌细胞SMMC-7721的增殖作用.用流式细胞术检测TGFα对肝癌细胞凋亡和细胞周期的影响.用免疫组化方法检测TGFα对ERK蛋白表达影响.结果 1μg/L TGFα作用24h SMMC-7721细胞增殖率为3%(P>0.05);作用48h后增殖率达16%(P<0.05).5μg/L TGFα作用24h增殖率达18%(P<0.05);作用48h增殖率达24%(P<0.01),增殖效应呈时间、剂量依赖性.5μg/L TGFα作用肝癌细胞48h能抑制肝癌细胞凋亡,使细胞滞留于G2M期,增加PI.5μg/L TGFα能促进ERK蛋白在细胞核中的表达.结论 TGFα能促进肝癌细胞增殖,增加ERK蛋白在细胞核中的表达.     

沉默EVL表达抑制肝癌细胞SMMC-7721的增殖和迁移能力

Ena/VASP 样蛋白（Ena/VASP like protein,EVL）是Ena/VASP家族成员之一,它参与肌动蛋白细胞骨架重组,以及细胞迁移、收缩环形成和细胞间附着.EVL在肝癌SMMC-7721细胞中高表达. 抑制EVL蛋白表达后,SMMC-7721细胞的增殖与迁移能力降低.为研究EVL在肝癌细胞的功能,构建了靶向shRNA干扰表达载体,稳定转染肝癌SMMC-7721细胞. MTT实验和细胞集落形成实验显示,与转染对照比较,沉默EVL蛋白表达可明显抑制SMMC-7721肝癌细胞的增殖、集落形成能力. Transwell实验证明,沉默EVL表达导致SMMC-7721细胞迁移能力降低. 进而,流式细胞术揭示,沉默EVL表达的SMMC-7721细胞G0/G1期细胞比例增多.研究结果提示,EVL蛋白可促进肝癌细胞的增殖与迁移;该结果可解释EVL在肝癌细胞中高表达的意义.     

蚕蛹复合氨基酸对人肝癌细胞SMMC-7721的抑制作用

本实验探讨蚕蛹复合氨基酸对人肝癌细胞株SMMC-7721的抑制作用.实验经MTT法检测药物对人正常肝脏细胞株QSG-7701的毒性后,计算药物安全浓度.将不同浓度的蚕蛹复合氨基酸与人肝癌细胞SMMC-7721共培养,采用MTT法测定OD值,评定蚕蛹蛋白复合氨基酸对肝癌细胞株的增殖抑制作用;经Hoechst33258染色和倒置显微镜进行形态学观察以检测细胞凋亡率;流式细胞法测定细胞周期和Annexin V/PI双染色法检测细胞凋亡.细胞毒性实验表明:蚕蛹蛋白复合氨基酸的最大无毒浓度为10 mg/mL.不同浓度的蚕蛹蛋白复合氨基酸对SMMC-7721细胞均有抑制作用,各组与对照组相比差异有显著性(P＜0.05),并呈剂量和时间依赖性.Hoechst33258染色和流式细胞术结果亦证实,蚕蛹复合氨基酸能显著促进SMMC-7721细胞的凋亡.     

BIX-01294对肝癌细胞周期、凋亡及移植瘤的影响

目的:探究组蛋白甲基转移酶G9a抑制剂(BIX-01294)对肝癌细胞周期、凋亡及移植瘤的影响。方法:将SMMC-7721、BEL-7402、HL-7702原始细胞株传代培养后,分为空白对照组和不同浓度(1μM、5μM、10μM、20μM)BIX-01294处理组。应用Western-blot法检测G9a及肝癌细胞内凋亡蛋白CC3、C-PARP、Bax、Bcl-2表达水平;应用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测不同浓度BIX-01294处理SMMC-7721、BEL-7402细胞24、48、72、96 h后的细胞增殖情况;应用流式细胞术检测不同浓度的BIX-01294处理肝癌细胞96h后细胞周期分布情况;移植瘤试验21 d后测量裸鼠体内肿瘤体积及重量,并检测瘤体内H3K9me2的蛋白水平。结果:G9a在肝癌细胞SMMC-7721、BEL-7402中表达水平高于HL-7702细胞(P<0.05)。不同浓度的BIX-01294对SMMC-7721细胞和BEL-7402细胞增殖具有抑制作用,且具有时间依赖性和剂量依赖性(均P<0.05)。不同浓度BIX-01294处理细胞96h后,SMMC-7721细胞和BEL-7402细胞G0/G1期细胞比例增加,S和G₂/M期的细胞比例降低(P<0.05)。5μM BIX-01294处理细胞96h后能明显增加CC3、Bax、C-PARP表达水平,并降低Bcl-2的表达水平(P<0.05),与空白对照组相比,BIX-01294处理组裸鼠肿瘤体积减小,重量较低,且肿瘤组织内H3K9me2的表达水平下降(P<0.05)。结论:BIX-01294导致SMMC-7721、BEL-7402细胞发生周期阻滞和凋亡,且对肿瘤的生长具有明显的抑制作用,其可能是通过抑制G9a的表达从而降低H3K9me2的表达来抑制肿瘤的生长。     

抑癌基因NDRG2对人结肠癌细胞系Caco-2增殖的影响

目的:采用重组慢病毒系统,在过表达和抑制NDRG2 (N-myc downstream regulated gene 2)基因后,检测人结肠癌细胞系Caco-2的增殖情况.方法:分别采用NDRG2过表达慢病毒载体pLenti6-NDRG2和NDRG2干涉慢病毒载体pLKO.1-shNDRG2制备病毒并感染Caco-2细胞,经14天耐药的筛选,获得稳定感染的细胞株;采用Real time RT-PCR和Western blot方法明确NDRG2在稳转细胞株中的表达情况,同时采用MTT方法检测细胞的增殖能力,通过流式细胞仪检测细胞周期变化情况.结果:Real time RT-PCR和Western blot结果表明,在慢病毒pLenti6-NDRG2稳定感染的Caco-2细胞中,NDRG2表达上调;pLKO.1-shNDRG2稳定感染的Caco-2细胞中,NDRG2的表达下调.MTT实验结果表明,NDRG2过表达细胞株中细胞的增殖能力下降,而pLKO.1-shNDRG2慢病毒感染Caco-2后细胞的增殖能力明显增加;流式细胞术结果显示,过表达NDRG2使Caco-2细胞在G0/G1期细胞增多而S期的细胞减少,抑制细胞内源性NDRG2后G0/G1期细胞减少而S期细胞增多.结论:通过过表达和抑制NDRG2基因,验证了NDRG2作为抑癌候选基因能够有效抑制结肠癌细胞Caco-2的增殖.     

HMBA对人肝癌SMMC—7721细胞周期相关基因表达的影响

本文研究HMBA对人肝癌SMMC－7721细胞周期G0／G1期阻滞相关基因表达的影响。免疫细胞化学和核酸原位杂交检测结果显示,HMBA可明显上调p21^WAF1/CIP1、p16蛋白表达并增强p21^WAF1/CIP1基因转录,同时对CDK4、Cyclin D1蛋白表达以及c-myc基因转录均具有明显的下调作用。结果表明,HMBA可通过增强p21^WAF1/CIP1、p16基因表达而抑制Cyclin D1-CDK4活性,最终导致细胞进入S期所需的c-myc等基因转录活性下降,从而将细胞周期阻滞于G0／G1期,诱导人肝癌细胞分化。     

USP9X低表达通过下调Mcl-1促进肝癌细胞凋亡

研究抑制泛素特异性蛋白酶9X（ubiquitin-specific protease 9X,USP9X）对人肝癌（primary hepatocellular carcinoma,HCC）细胞SMMC7721和HepG2中髓细胞白血病-1（myeloid cell leukemia-1,Mcl-1）蛋白的表达调控及对细胞凋亡和生长活力的影响。实验分为USP9X-siRNA组和阴性对照NC组两组进行分析。通过Western blot技术分别检测USP9X在肝癌细胞SMMC7721、HepG2和正常人肝细胞株L02中的蛋白表达情况;应用化学合成USP9X-siRNA转染肝癌细胞SMMC7721和HepG2,通过Western blot、流式细胞仪和MTT检测转染前后Mcl-1的蛋白表达差异以及细胞凋亡和生长活力变化。结果表明,USP9X在肝癌细胞SMMC7721和HepG2中的蛋白表达水平均高于正常肝细胞L02（t=15.155,P=0.000;t=9.171,P=0.001）;SMMC7721和HepG2细胞中抑制USP9X能明显下调Mcl-1的蛋白表达,并导致细胞凋亡增加和生长活力降低。提示,肝癌细胞SMMC7721和HepG2中USP9X表达上调;USP9X表达降低可能通过下调Mcl-1的蛋白表达进而诱导人肝癌细胞SMMC7721和HepG2的凋亡。     

RTN4-C基因在肝癌组织中的表达及其对SMMC7721细胞生长和凋亡的影响

RTN4-C属于编码内质网蛋白的基因家族(RTNs)。为研究RTN4-C在肝癌及其癌旁组织中的表达情况及其对SMMC7721肝癌细胞株的影响,利用RT-PCR检测RTN4-C在肝癌及其癌旁组织中的表达。构建RTN4-C-pcDNA3.1真核表达重组质粒,用脂质体介导转染SMMC7721肝癌细胞,通过G418稳定筛选,建立转染RTN4-C/SMMC7721稳定细胞株。MTT法测定转染前后细胞生长改变、吖啶橙染色检测细胞凋亡改变、免疫细胞化学检测肿瘤相关蛋白p53、Hsp70和c-Fos表达改变。结果表明,RTN4-C/SMMC7721细胞生长减慢,与对照组相比,第2、3、4d细胞生长抑制率分别为33·8%±0·026、56·2%±0·094、34·8%±0·077;凋亡明显增多。突变型p53蛋白从核内转移到细胞质且表达减弱,c-Fos、Hsp70蛋白表达量明显减弱。提示RTN4-C基因在肝癌组织中存在表达差异,促进突变型p53的核转移并减少其表达量、抑制癌基因c-Fos和Hsp70的表达,从而抑制SMMC7721细胞的生长,促进其凋亡。     

肝癌细胞雌激素受体显性阴性突变体ERδ5基因的分离及生物学功能分析

临床流行病学研究显示,ERα基因第5外显子缺失突变体ERδ5在原发性肝细胞癌特异性高表达,它被认为是判断肝癌预后的最重要的新型分子标志.本研究从肝癌细胞分离雌激素受体突变体ERδ5基因,并对其进行克隆、表达,探讨其分子生物学特性及生物学功能. 通过反转录PCR,从肝细胞分离出ERδ5基因并将其克隆到真核表达载体,通过体外翻译及Western 印迹验证该基因成功表达;通过细胞荧光技术检测了ERδ5在肝细胞中的定位;利用荧光素酶报告基因检测技术确证ERδ5对ERα转录活性的影响.结果发现,从肝癌细胞分离出长1 113bp的ERδ5基因,该基因编码蛋白在体外不稳定,易于降解.在肝癌细胞中,ERδ5蛋白主要定位在细胞核,与ERα定位极为相似,但在生物学功能上,ERδ5能够明显干扰ERα的转录活性.研究结果表明,ERδ5作为显性阴性突变体,在肝癌细胞中直接抑制ERα的转录活性.     

肝癌细胞67kD层粘连蛋白受体N-糖链结构与功能的变化

探讨肝癌细胞与正常肝细胞 6 7kD层粘连蛋白受体 (6 7LR)N 糖链结构与功能的差异 .采用流式细胞术检测SMMC 772 1肝癌细胞和L 0 2正常肝细胞膜表面 6 7LR的表达 ,并分别从这 2株细胞分离纯化到高亲和力的 6 7LR ,利用凝集素结合分析其糖链结构 ,并用肽 N 糖苷酶水解N 糖链 ,观察糖链在与层粘连蛋白结合过程中的作用 .结果发现 ,L 0 2细胞膜表面 6 7LR表达的阳性率为5 5 3% ,而SMMC 772 1细胞为 34.7% ,这两株细胞 6 7LR与伴刀豆素 (ConA)的结合能力无显著差异 ,但SMMC 772 1细胞的 6 7LR与麦胚凝集素的结合能力明显高于L 0 2细胞的 6 7LR ,说明 2株细胞 6 7LR的糖链结构存在显著差异 .当N 糖链被切除后 ,SMMC 772 1细胞的 6 7LR与层粘连蛋白的结合能力明显下降 ,而L 0 2细胞则没有变化 .这些资料表明 ,SMMC 772 1肝癌细胞和L 0 2正常肝细胞与层粘连蛋白结合能力的差别 ,以及两株细胞的 6 7LR与层粘连蛋白结合能力的不同 ,很可能是由于这两株细胞的层粘连蛋白受体的N 糖链结构不同所引起     

蝎毒对人肝癌细胞（SMMC7721）和宫颈癌（Hela）细胞抑制作用的研究

目的：探讨蝎毒粗粉及经初步纯化的蝎毒对人肝癌细胞（SMMC7721）和Hela细胞株的抑制作用。方法：以四甲基偶氮唑盐法（MTT）,Western Blotting,免疫细胞化学以及荧光标记的方法,对人肝癌细胞（SMMC7721）和Hela细胞株的凋亡相关蛋白进行检测。结果：蝎毒粗毒及经初步纯化的蝎毒具有诱导SMMC7721和Hela凋亡的作用。结论：蝎毒粗毒及经初步纯化的蝎毒对人肝癌细胞（SMMC7721）及Hela细胞的生长具有明显的抑制作用。     

VEGF siRNA降低人肝癌细胞株SMMC7721的致瘤性

本研究应用RNA干扰（RNAi）技术高效抑制VEGF的表达,明显降低了人肝癌细胞株SMMC7721的致瘤性。化学合成针对人VEGF基因的siRNA,体外瞬时转染人肝癌细胞株SMMC7721,RT-PCR和Elisa法检测表明VEGFsiRNA实验组与对照组相比,细胞内VEGFmRNA表达下降了76．16％,VEGF分泌蛋白表达则下降了96．28％,而MTT法结果显示VEGFsiRNA对SMMC7721细胞增殖没有明显作用。体内实验中,不同时间对荷SMMC7721细胞瘤裸小鼠进行siRNA直接瘤内注射,同时测量瘤体积,最后取瘤块进行组织切片观察并进行分子生物学分析,结果显示,与对照组相比,VEGFsiRNA实验组肿瘤体积明显缩小,瘤内出现细胞坏死,同时肿瘤组织中VEGFmRNA和蛋白表达水平均明显降低。     

B4GALT3促进肝癌细胞增殖和侵袭

β-1,4-半乳糖基转移酶III（β-1,4-galactosyltransferase III,B4GALT3）在肿瘤的作用正受到关注,但其在肝癌中的表达模式及其作用有待阐明。基于TCGA肿瘤组织数据库和GTEx正常组织数据库进行的生物信息学分析,发现相比于人正常肝组织,B4GALT3在人肝癌组织中的表达显著上调。实时荧光定量PCR结果发现肝癌细胞中B4GALT3的mRNA和Western 印迹检测蛋白质表达水平显著上调。其中肝癌细胞SMMC7721中B4GALT3的mRNA表达水平是正常肝细胞L-02的9.85倍。对TCGA数据库进行分析发现,B4GALT3表达水平与肝癌患者的生存率呈负相关。在内源性高表达B4GALT3的SMMC7721肝癌细胞中,干扰B4GALT3表达,可显著抑制该细胞的增殖能力和侵袭能力。干扰B4GALT3表达能显著上调SMMC7721细胞中p27和E-cadherin的蛋白质表达水平,干扰B4GALT3表达后SMMC7721细胞中,p27和E-cadherin的mRNA水平较对照组上调6.15倍和7.83倍。总之,B4GALT3在肝癌中表达上调,且促进肝癌细胞的增殖和侵袭。     

人IL-17F对裸鼠人肝癌移植瘤生长的影响

利用RT-PCR方法从PHA活化的人外周血单个核细胞(PBMCs)中克隆hIL-17F基因,亚克隆至逆转录病毒载体pSIV-1,与辅助病毒载体pHIT456和pHIT60脂质体法共转染293T包装细胞,获得的成熟重组逆转录病毒(RV-hIL-17F)再感染SMMC-7721人肝癌细胞,并经G418筛选建立hIL-17F转基因肝癌细胞。PCR、RT-PCR和Westernblot结果表明hIL-17F基因在肝癌细胞中能成功整合、转录和表达。MTT和FCM结果表明hIL-17F不能改变SMMC-7721肝癌细胞的增殖活力和细胞周期,但ELISA结果表明其能明显下调肝癌细胞IL-6、IL-8和VEGF的表达。转基因肝癌细胞rhIL-17F表达上清具有抑制ECV304人脐静脉内皮细胞生长的作用。裸鼠皮下成瘤试验结果表明hIL-17F转基因肝癌细胞裸鼠致瘤能力明显减弱,VEGF和CD34表达降低,血管形成显著减少。hIL-17F可通过减少肿瘤血管形成显著抑制裸鼠人肝癌移植瘤的生长,为其进一步开展肿瘤血管靶向基因治疗和开发抗血管新药提供了一定的实验依据。     

Mechanism of Arctigenin-Induced Specific Cytotoxicity against Human Hepatocellular Carcinoma Cell Lines: Hep G2 and SMMC7721

Arctigenin (ARG) has been previously reported to exert high biological activities including anti-inflammatory, antiviral and anticancer. In this study, the anti-tumor mechanism of ARG towards human hepatocellular carcinoma (HCC) was firstly investigated. We demonstrated that ARG could induce apoptosis in Hep G2 and SMMC7721 cells but not in normal hepatic cells, and its apoptotic effect on Hep G2 was stronger than that on SMMC7721. Furthermore, the following study showed that ARG treatment led to a loss in the mitochondrial out membrane potential, up-regulation of Bax, down-regulation of Bcl-2, a release of cytochrome c, caspase-9 and caspase-3 activation and a cleavage of poly (ADP-ribose) polymerase in both Hep G2 and SMMC7721 cells, suggesting ARG-induced apoptosis was associated with the mitochondria mediated pathway. Moreover, the activation of caspase-8 and the increased expression levels of Fas/FasL and TNF-α revealed that the Fas/FasL-related pathway was also involved in this process. Additionally, ARG induced apoptosis was accompanied by a deactivation of PI3K/p-Akt pathway, an accumulation of p53 protein and an inhibition of NF-κB nuclear translocation especially in Hep G2 cells, which might be the reason that Hep G2 was more sensitive than SMMC7721 cells to ARG treatment.