造血干细胞全标记红色和绿色荧光转基因小鼠的筛选

目的对五种荧光转基因小鼠造血干细胞中的荧光标记细胞进行分析,筛选造血干细胞全标记红色和绿色荧光转基因小鼠,为造血干细胞分化机制体内示踪研究提供理想的动物模型。方法采用活体荧光影像系统对两种红色荧光转基因小鼠品系C57BL/6J-TgN（CAG-DsRed-1和CAG-DsRed-2）ZLFILAS和三种绿色荧光转基因小鼠品系C57BL/6J-TgN（CAG-EGFP-1、CAG-EGFP-2和CAG-EGFP-3）ZLFILAS的荧光标记进行比较;采用流式细胞术检测各转基因小鼠的骨髓lin（-）c-kit（＋）Sca-1＋（LSK）造血干细胞荧光标记细胞比率,根据标记比率筛选造血干细胞全标记红色和绿色荧光转基因小鼠。结果活体荧光影像分析表明转基因小鼠均系统性表达红色或绿色荧光。流式细胞术检测表明LSK造血干细胞中高度表达红色和绿色荧光,其中,C57BL/6J-TgN（CAG-DsRed-1）ZLFILAS和C57BL/6J-TgN（CAG-EGFP-1）ZLFILAS的造血干细胞全部为荧光标记细胞。结论筛选获得在造血干细胞中全标记的红色和绿色荧光转基因小鼠,可为造血干细胞体内研究提供有效示踪工具。     

红色荧光和绿色荧光转基因小鼠模型的建立

目的建立红色荧光和绿色荧光转基因小鼠,为活体荧光影像系统建立重要的实验动物模型。方法把DsRed-Express和EGFP基因插入chicken-βactin强启动子下游构建转基因载体,建立红色荧光和绿色荧光转基因C57BL/6J小鼠。PCR鉴定红色荧光和绿色荧光转基因小鼠的基因表型,活体荧光影像系统分析红色荧光和绿色荧光转基因小鼠,荧光显微镜检测红色荧光和绿色荧光转基因小鼠全身组织器官的组织形态。结果分别建立了3个系的红色荧光和3个系的绿色荧光转基因小鼠。活体荧光影像系统分析转基因小鼠分别呈现红色荧光和绿色荧光。经荧光显微镜观察,DsRed-Express转基因小鼠的红色荧光蛋白在多个组织器官中表达,尤其在胰腺、肝脏、肾脏和脾脏等器官表达量较高。EGFP转基因小鼠绿色荧光蛋白在全身各个组织器官中表达,尤其在胰腺、心脏、小肠、外周血细胞和脑组织等器官组织中表达量较高。结论DsRed-Express和EGFP基因在转基因小鼠中系统性高表达,成功建立了红色荧光和绿色荧光转基因小鼠。DsRed-Express和EGFP转基因小鼠将成为活体荧光影像系统的重要实验动物模型。     

应用小动物活体成像追踪观察EGFP标记的间充质干细胞

为探讨干细胞移植治疗过程中干细胞在体内的存活和迁移能力,利用非细胞损伤性的EGFP(enhanced green fl uorescence protein)标记间充质干细胞进行了实验研究。该研究用电穿孔方法将加强的绿色荧光蛋白表达质粒p CMV-EGFP(cytomegalovirus-EGFP plasmid)转染细胞产生具有EGFP标记的牙髓干细胞、皮肤成纤维细胞(skin fi broblast cells,SFCs)和脐带间充质干细胞。将EGFP标记的脐带间充质干细胞注射到裸鼠皮下,用小动物活体成像系统观察了EGFP标记细胞在体内移植后细胞存活能力和荧光强度随时间的变化情况。结果表明,电穿孔转染能够在体外产生高效表达EGFP的标记细胞,EGFP在牙髓干细胞、SFCs和脐带间充质干细胞中的表达率分别为80%、85%和80%。通过小动物活体成像系统检测表明,EGFP标记的脐带间充质干细胞注射到裸鼠皮下后EGFP荧光表达在7 d后逐渐下降,但免疫组化分析表明,移植细胞可存活6个月以上。该研究提示,EGFP标记的干细胞可用于体内追踪其存活、迁移及分化,为探讨干细胞移植治疗作用提供了实验证据。     

慢病毒介导EGFP转染骨髓间充质干细胞在胶质瘤模型中迁移分布的研究

目的:如何证实骨髓间充质干细胞(BMSCs)是胶质瘤基因治疗中最好的药物载体?将增强型绿色荧光蛋白(EGFP)标记的大鼠骨髓间充质干细胞移植入大鼠C6胶质瘤模型脑内,观察骨髓间充质干细胞在肿瘤内的迁徙与定位。方法:贴壁法培养大鼠骨髓细胞获取纯化的BMSCs。慢病毒介导EGFP转染BMSCs,于荧光显微镜下观察EGFP的表达,并行流式细胞仪检测EGFP阳性转染率。利用立体定向仪将培养好的C6细胞注入大鼠脑内,建立大鼠脑内胶质瘤模型。将标记EGFP的BMSCs利用微量注射器注入模型鼠脑内;移植后第1,7天处死大鼠,用荧光显微镜观察BMSCs在肿瘤内的迁移分布。结果:实验成功建立了大鼠脑内胶质瘤模型。以EGFP标记的BMSCs在模型鼠脑内主动迁移分布于肿瘤内部及肿瘤与正常脑组织交界侧。结论:骨髓间充质干细胞可以作为肿瘤基因治疗的良好载体。     

EGFP转基因小鼠建系及其脊髓源神经干细胞应用前景的探讨

目的构建EGFP转基因小鼠及建系,并观察转基因小鼠的细胞及组织荧光发出状况。方法使用Gateway clone技术构建eEGFP载体,通过DNA显微注射法将构建好的EGFP载体注入受精卵内,转移至假孕母鼠内生出转基因小鼠。将转基因小鼠后代中的阳性小鼠互交,逐步淘汰杂合子小鼠。饲养过程测量小鼠的基本数据。培养转基因小鼠的脊髓源神经干细胞,并取部分常用组织石蜡切边,在荧光显微镜下观察。结果成功构建了EGFP转基因小鼠,并在屏障环境下饲养繁殖至7代。与野生型小鼠相比,EGFP转基因小鼠基本数据无明显差异。各常用组织切片在荧光显微镜下均可观察到绿色荧光,从脊髓中培养获得的神经干细胞也可观察到绿色荧光。结论 EGFP小鼠组织在常规处理后可观察到发出绿色荧光的细胞;小鼠脊髓源神经干细胞在体外培养3代仍可观察到绿色荧光,可利用这种自然标记的细胞研究神经干细胞在脊髓损伤修复中所产生的作用。     

PD-1/PD-L1参与骨髓间充质干细胞归巢修复慢阻肺大鼠的肺损伤

目的 研究程序性死亡蛋白1(programmed death-1, PD-1)/程序性死亡蛋白配体1(programmed death ligand-1,PD-L1)在间充质干细胞（mesenchymal stem cells, MSCs）归巢修复慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease,COPD）中的影响。方法 分离纯化骨髓来源MSCs,流式细胞术检测细胞表面分子表达,油红O染色、碱性磷酸酶染色分别观察MSCs成脂及成骨分化情况。采用烟气暴露法构建COPD大鼠模型,造模完成后将绿色荧光蛋白（GFP）标记的MSCs经尾静脉分别注射入正常及COPD大鼠模型中,通过观察肺部荧光评价MSCs的归巢效果;经尾静脉向COPD模型大鼠注射MSCs作为MSCs治疗组,模型组和正常对照组注射等体积生理盐水,HE染色观察各组大鼠肺脏组织病理改变,qRT-PCR比较各组大鼠肺脏组织PD-1的表达情况;体外qRT-PCR检测PD-L1在MSCs的表达,Transwell实验法观察PD-1及PD-L1抗体对MSCs定向迁移（归巢）的影响。结果 大鼠骨髓来源M...     

一种简便高效的人胚胎干细胞转染方法

目的 :利用Fugene 6基因转染试剂建立一种简便高效的人胚胎干细胞转染方法 ,并建立稳定表达增强型绿色荧光蛋白 (enhancedgreenfluorescentprotein ,EGFP)报告基因的人胚胎干细胞系 ,为人胚胎干细胞研究提供一个非常有用的细胞模型。方法 :通过Fugene 6基因转染试剂成功地将EGFP基因转入无饲养层培养的人胚胎干细胞中 ,嘌呤霉素筛选得到稳定表达EGFP的克隆 ;利用倒置荧光显微镜和流式细胞仪检测EGFP在人胚胎干细胞中的表达情况。结果 :EGFP瞬时转染效率为 30 %～ 40 % ,稳定转染效率约 1/10^4～5,且稳定转染的人胚胎干细胞均表达EGFP。结论 :Fugene 6是一种良好的基因转染试剂 ,它可以有效地将外源基因转入人胚胎干细胞中 ,为人胚胎干细胞的转基因研究提供新的实验手段。     

荧光标记技术在肿瘤模型研究中的应用

目的利用绿色荧光小鼠和红色荧光蛋白标记肿瘤细胞,建立荧光标记的小鼠肿瘤模型,并建立活体荧光成像和荧光显微镜成像在整体和细胞水平直接观察肿瘤的技术。方法将小鼠B16黑色素瘤细胞接种到绿色荧光蛋白转基因小鼠皮下,建立GFP小鼠肿瘤模型。以红色荧光蛋白作为标记基因导入小鼠黑色素瘤细胞B16细胞,建立稳定表达红色荧光蛋白的细胞株。将表达红色荧光蛋白B16细胞接种到绿色荧光转基因小鼠皮下,建立双荧光小鼠肿瘤模型。用荧光显微镜和活体荧光成像系统检测小鼠肿瘤的发生发展。结果分别建立了GFP小鼠肿瘤模型和双色荧光小鼠肿瘤模型。利用活体荧光影像仪可以观察双色荧光小鼠模型中受体绿色荧光组织和红色荧光移植肿瘤相互融合。利用荧光显微镜,可以观察到肿瘤内绿色荧光标记的来源于受体小鼠的血管和免疫细胞。经香菇多糖刺激的GFP小鼠肿瘤模型的移植瘤组织中,来源于受体小鼠绿色荧光标记的免疫细胞明显多于经生理盐水刺激的对照小鼠。结论利用绿色荧光小鼠和红色荧光RFP标记肿瘤细胞建立荧光标记的小鼠肿瘤模型,采用活体荧光成像仪和荧光显微镜可在整体和细胞水平直接观察肿瘤的生长以及肿瘤与宿主的相互作用。     

建立绿色荧光蛋白标记的小鼠胚胎干细胞系及向心肌样细胞的分化

带有GFP基因的ESD3细胞系是一个良好的可以用于研究体内和体外细胞分化和组织产生的模型。用磷酸钙共沉淀法将质粒pEGFP-N2导入小鼠胚胎干细胞D3细胞系中 ,在荧光显微镜下以 488nm激发光检查阳性克隆 ,并进行初步扩增。经G4 18筛选后 ,机械挑取EGFP强阳性表达的克隆 ,并在丝裂霉素C处理的小鼠胚胎成纤维细胞的饲养层上 ,在无选择性压力的条件下 ,进一步扩大培养 ,获得纯化的转染细胞系。20代以后 ,转染细胞仍然表达绿色荧光蛋白。PCR检测表明 8代和 18代转染细胞均携带有GFP标志基因。对稳定表达EGFP的干细胞系进行碱性磷酸酶染色、拟胚体和畸胎瘤形成的检测 ,证明这些细胞具有干细胞的特征。经拟胚体 ,可进一步分化成具有搏动能力的心肌细胞 ,分化百分率为 30 %～ 4 0 % ,较未转染细胞 60 %～ 70 %的分化率低 ,造成低分化率机制还不清楚。这些细胞在激光共聚焦显微镜下呈绿色荧光 ,免疫组化染色显示具心肌细胞特异的cTnT分子标志。该EGFP标记的干细胞系带有可进行原位、实时检测的绿色荧光 ,可应用于细胞移植和体内分化的研究.     

流式细胞仪分选转基因斑马鱼胚胎荧光标记细胞的一种快速方法

荧光蛋白在特异组织和器官表达的转基因斑马鱼已经在发育生物学和疾病模型研究中得到了广泛的应用。这些转基因系有助于追踪和分析数量较少的细胞群。但是如果要分离得到这些细胞来定量分析mRNA或蛋白质的表达情况比较困难。利用流式细胞仪分选这些荧光标记细胞是一种解决办法。此方法在不同的实验室中被广泛地应用。也有相关流程的介绍。但是流程一般较为繁琐,操作比较困难。该文以从转基因斑马鱼Tg（Kdrl：EGFP）中分选绿色荧光蛋白阳性的血管内皮细胞为例,介绍利用流式细胞仪分选转基因斑马鱼荧光标记细胞的实验流程和技术要点。该文作者在前人工作的基础上结合大量的实验经验．发展并优化了一套操作简便、效率较高的流程来分选这些细胞,在此做详细的介绍给大家以供参考。     

Transgenic mice with pancellular enhanced green fluorescent protein expression in primitive hematopoietic cells and all blood cell progeny

Transgenic mice homogeneously expressing enhanced green fluorescence protein (EGFP) in primitive hematopoietic cells and all blood cell progeny, including erythrocytes and platelets, have not been reported. Given previous data indicating H2Kb promoter activity in murine hematopoietic stem cells (HSCs), bone marrow (BM), and lymphocytes, an H2Kb enhancer/promoter EGFP construct was used to generate transgenic mice. These mice demonstrated pancellular EGFP expression in both primitive BM Sca-1+Lin-Kit+ cells and side population (SP) cells. Additionally, all peripheral blood leukocytes subsets, erythrocytes, and platelets uniformly expressed EGFP strongly. Competitive BM transplantation assays established that transgenic H2Kb-EGFP HSCs had activity equivalent to wildtype HSCs in their ability to reconstitute hematopoiesis in lethally irradiated mice. In addition, immunohistochemistry revealed EGFP transgene expression in all tissues examined. This transgenic strain should be a useful reagent for both murine hematopoiesis studies and functional studies of specific cell types from particular tissues.     

Notch信号在盐酸法舒地尔诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经元分化过程中的作用

目的:探讨Notch信号通路在盐酸法舒地尔诱导大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)向神经元分化中的作用。方法:实验分为未转染组、转染组(转染Rn-Notch1-siRNA)、阳性对照组(转染Rn-MAPK-1 Control siRNA)及阴性对照组(转染Negative Control siRNA)等4组。采用盐酸法舒地尔诱导大鼠MSCs分化为神经元。倒置荧光显微镜下观察MSCs转染后荧光表达情况;RT-PCR检测Notch1、Hes1和MAPK1 mRNA的表达变化;免疫细胞化学法检测Notch1、神经元烯醇化酶(NSE)、神经微丝蛋白亚单位(NF-M)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达变化;MTT方法检测细胞存活率。结果:①siRNA转染72h,MSCs荧光表达最强,转染率可达91.3%±4.2%;同时,转染组MSCs的Notch1和Hes1 mRNA转录下降(P0.05);MTT提示转染组细胞存活率也显著减少(P0.05)。②盐酸法舒地尔可以诱导MSCs向神经元分化,其中以转染组诱导效果最佳,NSE、NF-M的表达率显著的高于其它各组(P0.05)。结论:盐酸法舒地尔在诱导大鼠MSCs向神经元分化过程中,可能存在Notch信号通路与RhoA/Rho激酶通路信号的协同作用,共同促进MSCs向神经元分化。     

绿色荧光裸鼠的建立和验证

目的建立系统性表达绿色荧光蛋白的裸鼠,接种人源肺癌细胞验证该模型是否具有免疫缺陷性,并观察双色荧光的成像效果。方法利用系统性表达绿色荧光蛋白的C57BL/6J小鼠与BALB/C裸小鼠多代杂交和互交,建立稳定表达绿色荧光蛋白的裸鼠。大体解剖观察胸腺生长情况,整体和器官荧光成像验证绿色荧光蛋白的表达情况。以2×106/只的剂量对其皮下腋下接种表达红色荧光蛋白的人类A549肺癌细胞（RFP-A549）,通过观测肿瘤生长来验证模型的免疫缺陷性。同时,利用红色荧光标记的肿瘤和绿色宿主鼠,对双色的整体成像效果进行观测。结果构建出系统性表达绿色荧光蛋白的裸鼠,大体解剖可见胸腺缺失。在激发光的激发下,绿色荧光裸鼠全身发出清晰的绿色荧光,脑、心脏、肺脏、肝脏、肾脏,肠胃及胰腺等主要器官可见明显绿色荧光。接种RFP-A549细胞后,成瘤率达到100%,整体动物荧光成像表现出清晰的双色。结论本研究构建出的绿色荧光裸鼠,动物整体可以清晰地表达绿色荧光并具有免疫缺陷性     

骨髓间质干细胞移植对大鼠脑缺血再灌注凋亡蛋白Caspase-3的影响

目的研究静脉移植骨髓间充质干细胞（MSCs）对脑缺血再灌注模型大鼠神经功能及凋亡相关蛋白caspase-3的影响。方法体外培养及扩增MSCs后,用绿色荧光染料羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂（CFSE）标记,通过静脉途径移植给大脑中动脉缺血2 h再灌注的SD大鼠,按不同时间点取材,荧光显微镜观察BMSCs在脑内的分布,免疫组织化学染色及RT-PCR检测大鼠脑内caspase-3蛋白表达情况。结果移植组在移植后第6天神经功能明显好于对照组（P〈0.05）。移植组移植后3、12、24、48、72 h caspase 3免疫组化阳性目标面密度分别为（1.34±0.31）%、（3.98±0.67）%、（5.58±0.92）%、（4.65±0.69）%、（3.51±0.63）%,对照组分别为（2.09±0.19）%、（5.23±0.30）%、（6.89±0.57）%、（5.93±0.56）%、（4.39±0.57）%,移植组和对照组比较均（P〈0.05）。6h及7 d移植组caspase 3阳性目标面密度分别为（2.81±0.35）%、（1.64±0.29）%,与对照组（3.92±0.44）%,（2.29±0.21）%比较差异显著（P〈0.01）。移植组相应时间点caspase-3的表达明显低于对照组（P〈0.05,P〈0.01）;移植组大鼠缺血侧皮层的caspase-3 mRNA相对量明显低于对照组（P〈0.01）。结论经静脉注射骨髓间充质干细胞可明显改善神经功能。其可能通过下调caspase-3表达方式对脑缺血再灌注损伤起保护作用。     

Cramp过表达对小鼠骨髓造血干细胞功能的影响

目的研究Cramp蛋白过表达对小鼠骨髓造血干细胞自我更新和分化能力的影响。方法应用流式细胞仪分析Cramp过表达转基因小鼠及同龄野生型小鼠的骨髓、脾脏、胸腺等组织器官中各种细胞的比例;分选骨髓造血干细胞,体外培养,观察其克隆形成能力。结果与野生型小鼠相比,Cramp过表达转基因小鼠的骨髓、脾脏、胸腺等组织器官中各种细胞的比例、骨髓造血干细胞的克隆形成能力等均无明显变化。结论本研究中,Cramp过表达转基因小鼠骨髓造血干细胞的分化能力、克隆形成能力无明显变化。     

骨髓动员对骨髓造血干细胞在心肌梗死后心脏中定植及分化的影响

目的观察小鼠心肌梗死后骨髓造血干细胞在心脏内的分化及细胞因子的影响。方法C57/BL6小鼠60只分为骨髓动员组和对照组,先后行脾切除、骨髓移植（骨髓供体为增强绿色荧光蛋白转基因小鼠）、骨髓动员及建立心肌梗死模型。心肌梗死后3周将小鼠心脏取出并切片行组织学及激光共聚焦显微镜免疫荧光检查。结果骨髓动员可以增加EGFP阳性细胞在心脏中梗死区和边缘区的定植,但绝大多数EGFP阳性细胞都同时表达CD45。仅发现有极少数骨髓来源的心肌细胞、成纤维细胞及血管内皮细胞,且与骨髓动员无相关性。结论骨髓动员能够明显促进骨髓来源细胞定植入小鼠心脏的梗死区;极少数骨髓造血干细胞可以分化为心肌细胞,其数量远不足以修复梗死心肌及改善心功能;骨髓造血干细胞不参与梗死区疤痕形成的病理过程。     

粒细胞集落刺激因子对失代偿期肝硬化患者骨髓干细胞的动员效果及安全性观察

目的观察失代偿期肝硬化患者行自体骨髓干细胞移植前粒细胞集落刺激因子（G-CSF）对骨髓干细胞的动员效果及安全性。方法在51例失代偿期肝硬化患者行自体骨髓干细胞经肝动脉移植术前,连续2 d给予G-CSF 4μg/（kg·d）动员骨髓干细胞。抽取骨髓的当日化验血常规、肝肾功等指标;从患者髂后上棘抽取骨髓150-200 ml,分离收集骨髓单个核细胞并计数,应用流式细胞仪检测CD34＋细胞并计数,观察应用G-CSF期间不良反应的类型和发生率。患者治疗前后比较采用配对t检验进行统计学分析。结果G-CSF皮下注射后,外周血白细胞由术前（3.31±0.96）×10^9/L升至（11.35±1.92）×10^9/L（P〈0.01）,骨髓单个核细胞数（1.91±0.83）×10^9/kg,CD34＋细胞为（2.02±1.29）×10^7/kg;患者皮下注射后,发热率17.6﹪,体温最高38℃,停药后降至正常;腹部胀痛3例,四肢皮肤散发皮疹2例,均未给予特殊处理,2-3 d后恢复正常。结论给予G-CSF皮下注射后提取骨髓干细胞移植治疗失代偿期肝硬化的是一种临床确切有效的、安全的干细胞动员方法。     

小鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养及鉴定

目的建立一种从小鼠骨髓中分离培养间充质干细胞（MSCs）的高效方法。方法采取贴壁细胞分离法分离和纯化小鼠骨髓间充质干细胞（mMSCs）,检测mMSCs在不同诱导条件下向成骨细胞及脂肪细胞分化能力,用流式细胞术及显微镜分别检测mMSCs纯度和形态特征。结果mMSCs贴壁生长后形态较均一,细胞形态呈成纤维细胞样,流式细胞术检测：CD45、CD11b、CD44及CD29分别为（3.34）%、（2.41）%、（98.46）%及（99.36）%。第4代mMSCs经诱导后可向成骨细胞和脂肪细胞分化。结论通过贴壁培养可以从小鼠骨髓中分离培养出高纯度mMSCs,该方法效率高,稳定性好。