链脲佐菌素诱导糖尿病恒河猴胰岛细胞数量的变化

目的观察链脲佐菌素（STZ）诱导恒河猴糖尿病动物模型胰岛细胞数量变化和激素表达情况。方法健康恒河猴5只,小剂量（30 mg/kg）多次静脉注射STZ,濒死状态时将动物安乐死。取胰腺制成石蜡切片,用免疫组化染色法显示胰岛A、B、D和PP细胞,并对结果进行图像分析和统计学处理。结果与对照组比较,模型组B细胞数量减少,胰岛素表达降低（P〈0.01）。A细胞增生,胰高血糖素表达增加（P〈0.01）。PP细胞增生,胰多肽表达增加（P〈0.05）。D细胞数量与对照组比较无显著性差异。结论恒河猴糖尿病动物模型胰岛各种细胞的数量和激素表达情况与人类糖尿病类似。     

实验性Ⅰ型糖尿病恒河猴的组织病理学观察

目的　观察实验性Ⅰ型糖尿病恒河猴的组织病理学变化。方法　 7只恒河猴分别静脉注射不同剂量的链脲佐菌素 (streptozotocin ,STZ) ,建立STZ性Ⅰ型糖尿病恒河猴模型 ,观察其心脏、肾脏、胰脏、脾脏等组织病理学变化。结果　动物胰岛数量明显减少 ,分布稀疏 ,残存胰岛萎缩 ,胰岛大小不等 ,成纤维细胞增生。肾小球增大 ,毛细血管壁增厚、僵硬 ,肾小管内膜细胞玻璃样变性 ,肾小球球囊内皮细胞增生。心肌变性、坏死、淤血 ,心肌细胞肥大 ,中、小血管壁增厚 ,血管壁纤维组织增加 ,冠状动脉内膜局部增厚 ,内皮细胞增生。脾脏小动脉硬化。结论　通过对STZ诱发的Ⅰ型糖尿病模型胰岛、肾脏和心脏等结构病理观察说明 ,该动物模型可用于糖尿病组织病理研究和药物疗效的评价。     

纤维蛋白的两种特殊染色效果比较

目的 比较分析显示纤维蛋白的两种特殊染色方法 ,旨在选择一种更适合于显示纤维蛋白的特殊染色方法。方法对富含纤维蛋白的石蜡包埋组织进行改良Masson染色、PTAH染色,光学显微镜下观察染色效果。结果 HE染色见纤维蛋白多数呈红染的细丝、相互连接成网状,也可相互融合。改良Masson染色显示纤维蛋白呈红色,PTAH染色显示纤维蛋白呈深蓝色。结论 改良Masson染色和PTAH染色均可用于显示纤维蛋白,但改良Masson染色时间短,结构清晰、对比明显,是观察纤维蛋白染色效果最佳的染色方法。     

不同剂量链脲佐菌素腹腔注射制备大鼠糖尿病心肌病模型的病理学观察

建立糖尿病性心肌病（DCM）大鼠模型,观察不同剂量链脲佐菌素（STZ）单次腹腔注射后大鼠心肌和胰腺的病理学变化。用STZ 50 mg/kg、55 mg/kg、60 mg/kg 3种剂量单次腹腔注射,制备糖尿病大鼠模型;以柠檬酸三钠-柠檬酸缓冲液腹腔注射,作为对照。72 h后,测空腹血糖及做口服葡萄糖耐量实验（OGTT）;3周后,HE染色观察各组大鼠胰腺和心肌形态学变化,Masson三色染色观察心肌纤维化改变。OGTT和空腹血糖显示3组存活大鼠糖尿病均成模;3周末,50 mg/kg和55 mg/kg剂量死亡率为25%;60 mg/kg剂量高,达到75%;HE染色显示55 mg/kg剂量组大鼠胰岛明显萎缩,轮廓不清晰,胰岛细胞数量少,心肌细胞肥大、排列紊乱,细胞间隙增大,并有炎症细胞浸润;50 mg/kg组胰岛和心肌也有变化,但无55 mg/kg组明显。心肌Masson染色显示55 mg/kg组心肌内胶原组织明显增多,排列紊乱,分布不均。55 mg/kg剂量的STZ单次注射大鼠腹腔,造模3周可以建立较明显的DCM模型,可为DCM的组织病理学和实验研究提供一个较好的动物模型。     

不同剂量链脲菌素对恒河猴某些常规生理指标的影响

目的　研究链脲菌素 (STZ)对恒河猴摄食、饮水、排尿、体重、血糖及尿糖等生理指标的影响 ,为建立糖尿病动物模型积累资料。方法　通过静脉给 7只恒河猴注射不同剂量的STZ。结果　使用不同剂量STZ后 ,7只恒河猴均在不同时间、不同程度出现与人糖尿病相类似的“三多一少”症状 ,同时对糖尿病猴使用不同剂量胰岛素可使其症状减轻。尤其是中、高剂量组的动物症状较为明显 ,而低剂量组体重有一个短时间的增加后又迅速下降。实验组中血糖和尿糖均出现不同程度的升高 ,以中、高 2个剂量组的动物变化较大。结论　采用中、高剂量组的STZ可诱导类似人类糖尿病的急性动物模型 ,而使用胰岛素治疗或低剂量STZ可使该动物模型疾病病程延长 ,有利于进行其并发症的研究。     

1型糖尿病小鼠模型中MZB和FoB细胞的检测

目的:探究脾脏边缘区B细胞(marginal zone B cell,MZB)和滤泡状B细胞(folicular B cell,FoB)在链脲佐菌素(streptozocin,STZ)诱导的1型糖尿病小鼠模型中的频率变化。方法:以C57BL/6小鼠为研究模型,腹腔注射STZ 55 mg/kg,连续注射5天,建立1型糖尿病模小鼠模型。选取随机血糖水平≥200 mg/dL(11.1 mmol/L)的小鼠视为造模成功。期间观察并记录小鼠摄食、饮水情况,监测小鼠体重、空腹血糖情况。造模第4周处死小鼠,随后测定小鼠的糖化血红蛋白(glycated hemoglobin, HbA1c)、谷氨酸脱羧酶抗体(GAD65)、胰岛素自身抗体(IAA)水平。通过对各组小鼠胰腺进行苏木精-伊红(hematoxylin-eosin, HE)染色、免疫组化(immunohistochemistry,IHC)观察胰岛形态变化及胰岛素含量。通过流式细胞术,比较各组小鼠脾脏中MZB和FoB细胞的频数和表型。结果:与正常对照组小鼠比较,STZ糖尿病模型组小鼠摄食量、饮水量明显增加,体重减轻,随机血糖显著升高,同时HbA1c水平明显增加(P0.0001),模型组小鼠血浆GAD65和IAA水平也明显升高。HE、IHC结果显示,与正常对照小鼠比较,STZ糖尿病小鼠胰岛萎缩、呈不规则;胰岛素颗粒数减少。与正常对照组小鼠相比,模型组小鼠脾脏MZB细胞频数增加,差异有统计学意义(P0.05);与正常对照组小鼠相比,模型组小鼠脾脏FoB细胞频数无统计学差异。结论:STZ诱导的1型糖尿病小鼠脾脏中MZB细胞频数升高,FoB细胞频数变化无统计学差异。这些B淋巴细胞亚群频率失衡可能与1型糖尿病的发生有关。     

恒河猴糖尿病动物模型血清及组织中细胞因子的变化

目的探讨恒河猴糖尿模型病细胞因子的水平和变化规律。方法健康恒河猴5只,小剂量(30mg/kg)多次静脉注射链脲佐菌素(STZ),血糖稳定后3、9、12和19个月检测血清中白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-10(IL-10)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的含量。安乐濒死状态的动物,取胰腺、肝脏、肾脏制成石蜡切片,用免疫组化染色法显示组织中IL-6、IL-10、TNF-α的表达,并对结果进行图像分析和统计学处理。结果造模后9个月动物血清中IL-10浓度显著降低(P<0.01)。IL-6、TNF-α水平在采样的各个时间点均显著高于造模前(P<0.01)。胰腺组织中IL-6中等强度着色,对照组弱阳性表达(P<0.05)。对照组IL-10强阳性表达,模型组弱阳性(P<0.01)。模型组TNF-α中等强度表达,对照组弱阳性(P<0.05)。模型组肝脏组织TNF-α中等阳性表达,对照组弱阳性(P<0.05)。结论小剂量多次注射STZ后恒河猴细胞因子的含量及变化与临床类似,可作为相关研究的动物模型。     

油红O染色鉴定胰腺星状细胞

目的胰腺星状细胞(pancreatic stellate cells,PSCs)是一类胞浆内含有Vitamin A脂滴的特殊类型的细胞。油红O能够使脂肪组织及细胞内的脂滴着色。本研究的目的是采用油红O染色的方法对分离培养的PSCs进行鉴定。方法采用Histodenz密度梯度离心分离提取PSCs。异丙醇配制油红O染液,培养的PSCs应用油红O染液染色。结果油红O染色后可清晰显示PSCs内的脂滴。结论油红O染色可以特异性地显示脂滴,是鉴别PSCs的有效方法。     

油红O染色原代未活化胰腺星状细胞脂肪滴的实验观察

目的观察油红O染色原代培养的未活化胰腺星状细胞脂肪滴,并予鉴定。方法选取接种于6孔板中培养4天的原代未活化胰腺星状细胞,予100g/L甲醛液固定,磷酸盐缓冲液漂洗后,加入5g/L油红O饱和液染色,镜下动态观察。胞浆内的脂肪滴一旦着色,即可洗去油红,苏木素衬染胞核,漂洗分化脱色后镜下成像。结果未活化的胰腺星状细胞脂肪滴被油红0染成鲜艳的红色,大小不一的串珠样"油珠子"分散于胞质中,簇集成"环状",呈戒环样包绕在细胞核周围。结论油红染色原代未活化胰星状细胞脂肪滴是鉴定该细胞的重要方法之一。     

胰腺导管单克隆上皮样干细胞的多分化潜能

体外诱导源于成年大鼠的胰腺导管单克隆上皮样干细胞分化形成胰岛、神经、脂肪及成骨细胞,探讨干细胞的多分化潜能。扩增培养源于成年大鼠的胰腺导管单克隆上皮样干细胞,采用不同的诱导液体外诱导其向胰岛、神经、脂肪及成骨细胞分化,并通过DTZ染色、糖刺激试验、免疫荧光反应、油红O染色、茜素红染色或Vonkossa染色的方法对分化细胞进行检测。结果显示,体外诱导培养干细胞分化形成类胰岛,DTZ染色阳性,糖刺激分泌胰岛素、C-肽;分化形成类神经细胞,表达神经元特异性烯醇化酶;分化形成类脂肪细胞,油红O染色阳性;分化形成类成骨细胞,其分泌物呈岛状矿化结节,茜素红和Vonkossa染色阳性。这表明,该源于成年大鼠的胰腺导管上皮样干细胞系具有多分化潜能。     

2型糖尿病模型小鼠造模时间的选择

目的:分析不同时期的2型糖尿病小鼠血生化指标及心肌和肾脏的病理变化情况,为选择2型糖尿病模型小鼠造模时间提供依据。方法:32只健康雄性ICR小鼠高脂饲料喂养6周后,腹腔注射链脲佐菌素(STZ,30mg/kg),连续5d,制备糖尿病模型。9d后测空腹血糖(FBG),高于11.1mmol/L视为糖尿病模型。分别于成模后第4、6、8周处死一组小鼠。另取8只雄性ICR小鼠作为对照组,常规饲料喂养,于糖尿病组小鼠成模后第8周处死。分析小鼠生化及病理情况:①心脏、肾脏脏器系数计算;②血清乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶(CK)、肌酐(Cr)和尿素氮(BUN)含量测定;③HE染色观察心肌和肾脏组织病变的整体情况;Masson染色观察心肌组织纤维化情况;PAS染色观察肾脏组织病理变化。结果:与对照组小鼠进行比较,第4、6、8周的糖尿病小鼠心脏器系数升高,血清LDH、CK升高,病理组织学见心肌细胞肥大,纤维化;肾脏脏器系数升高,肾功能肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)显著升高,病理组织学见肾小球肥大,肾小管基底膜增厚,管腔萎缩。结论:第6周糖尿病小鼠相关生化病理指标改变相对明显且饲养时间相对较短,故2型糖尿病模型小鼠造模后第6周是进行药物干预和病理、生理、生化等研究的最佳时间。     

冻融联合灌注法优化大鼠肾脏脱细胞支架的制备

本研究旨在探索优化肾脏脱细胞支架的制备方法,为肾脏组织工程及肾脏体外病理、毒理研究提供实验基础。取大鼠肾脏灌注PBS作为对照组 (Control组),在不同流速下分别以十二烷基磺酸钠 (Sodium dodecyl sulfate,SDS) 灌注 (S组),Triton X-100联合SDS灌注 (TS组),反复冻融后Triton X-100联合SDS灌注(FTS组),制备肾脏脱细胞支架,并测定其流体分布及脉管阻力。HE染色、DAPI染色、DNA定量检测脱细胞支架脱细胞程度,Masson染色、PAS染色、免疫组织化学染色检测脱细胞支架主要成分的保留和结构的完整,扫描电镜检测支架的超微结构,MTT法检测支架的细胞毒性,ELISA检测支架中生长因子的含量。结果显示,FTS组脱细胞用时较S组、TS组少,10 mL/min组支架脉管阻力较低,S组、TS组、FTS组流体分布与Control组存在差异。HE染色和DAPI染色显示各组支架未见细胞成分残留,DNA含量＜50 ng/mg。Masson染色和PAS染色可见细胞外网状胶原及多糖,免疫组织化学染色见Ⅰ型胶原 (CollagenⅠ)、Ⅳ型胶原蛋白 (Collagen Ⅳ)、纤维连接蛋白 (Fibronectin)、层粘连蛋白 (Laminin) 表达。扫描电镜见支架呈蜂窝状结构。MTT法检测支架细胞毒性分级在0–1级之间。ELISA检测提示FTS组VEGF、EGF、IGF-1、PDGF含量明显高于S组和TS组。综上,联合冻融和灌注法能够制备更为理想且有效的大鼠肾脏整器官脱细胞支架,为肾脏组织工程及肾脏体外病理、毒理学研究奠定基础。     

口服AdipoRon对2型糖尿病小鼠脾脏和胰腺功能的影响

目的:观察口服AdipoRon对2型糖尿病小鼠脾脏和胰腺功能的影响,为AdipoRon的临床应用提供基础资料。方法:将40只C57/BL6雄性小鼠随机分为正常对照组(NC,n=10)和造模组(n=30),并分别给予普通饲料和高脂高糖饲料喂养。4周后,造模组小鼠腹腔注射链脲佐菌素(STZ,40 mg/kg)以诱导建立2型糖尿病模型。造模成功后将糖尿病模型小鼠随机分为糖尿病模型组(DM)、高剂量AdipoRon(50 mg/kg)(DM+H)组、低剂量AdipoRon(20 mg/kg)(DM+L)组,每组10只。DM+L组和DM+H组灌胃相应浓度的AdipoRon(使用去离子水溶解AdipoRon),NC组和DM组灌胃等体积去离子水,每日灌胃1次,灌胃10 d。末次干预后禁食12 h,处死小鼠取血液、胰腺和脾脏。HE染色光镜下观察胰腺的病理改变; ELISA法检测小鼠胰腺和脾脏组织中胰岛素受体(INSR)、胰岛素受体底物1(IRS-1)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)蛋白质含量;小鼠脾脏系数; Western blot法检测胰腺组织中pIRS-1蛋白质水平;实时荧光定量PCR检测胰腺组织中insulin mRNA表达。结果:光镜下可见正常组小鼠胰腺组织排列紧密、饱满、胰岛体积大,DM组小鼠胰腺组织排列较为疏散、胰岛体积较小,口服AdipoRon组小鼠胰腺组织基本紧密、饱满、胰岛体积略小。与NC比较,DM组小鼠胰腺和脾脏TNF-α水平明显升高,INSR、IRS-1水平均降低,脾脏系数、胰腺p-IRS-1蛋白质水平和insulin mRNA表达均降低,均具有统计学意义(P<0.05);与DM组比较,口服AdipoRon组小鼠胰腺和脾脏TNF-α水平明显下降,INSR和IRS-1水平均升高,脾脏系数升高,DM+H组胰腺p-IRS-1蛋白质水平和insulin mRNA表达均升高(P<0.05);与DM+L组比较,DM+H组小鼠TNF-α水平明显下降,INSR和IRS-1水平均升高(P<0.05)。结论:口服AdipoRon可通过减弱糖尿病小鼠炎症反应,上调INSR表达、提高p-IRS-1水平,从而对糖尿病小鼠脾脏和胰腺组织有一定的保护作用。     

Nicotinamide reduces renal interstitial fibrosis by suppressing tubular injury and inflammation

Renal interstitial fibrosis is a common pathological feature in progressive kidney diseases currently lacking effective treatment. Nicotinamide (NAM), a member of water‐soluble vitamin B family, was recently suggested to have a therapeutic potential for acute kidney injury (AKI) in mice and humans. The effect of NAM on chronic kidney pathologies, including renal fibrosis, is unknown. Here we have tested the effects of NAM on renal interstitial fibrosis using in vivo and in vitro models. In vivo, unilateral urethral obstruction (UUO) induced renal interstitial fibrosis as indicated Masson trichrome staining and expression of pro‐fibrotic proteins, which was inhibited by NAM. In UUO, NAM suppressed tubular atrophy and apoptosis. In addition, NAM suppressed UUO‐associated T cell and macrophage infiltration and induction of pro‐inflammatory cytokines, such as TNF‐α and IL‐1β. In cultured mouse proximal tubule cells, NAM blocked TGF–β‐induced expression of fibrotic proteins, while it marginally suppressed the morphological changes induced by TGF‐β. NAM also suppressed the expression of pro‐inflammatory cytokines (eg MCP‐1 and IL‐1β) during TGF‐β treatment of these cells. Collectively, the results demonstrate an anti‐fibrotic effect of NAM in kidneys, which may involve the suppression of tubular injury and inflammation.     

结缔组织生长因子在胰腺组织纤维化中的作用及机制探讨

目的 观察胰腺纤维化后结缔组织生长因子(Connective tissue growth factor,CTGF)在胰腺组织内的表达;进一步研究参与CTGF作用于胰腺星状细胞(pancreatic stellate cells,PSCs)的分子信号调控通路.方法 建立大鼠胰腺纤维化动物模型,HE染色、天狼猩红染色和免疫组织化学染色等方法观察胰腺纤维化后PSCs的活化情况及CTGF在胰腺组织的表达.Real-time RT PCR检测CTGF的基因表达.Western Blot检测PSCa内α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)及胶原蛋白Ⅰ(CollagenⅠ)水平.结果 胰腺组织纤维化后,PSCs大量活化,并显著表达CTGF.CTGF作用后,PSCs内CTGF mRNA、α-SMA和Collagen Ⅰ的合成均有显著增加,在给予不同的细胞信号通路阻断剂后,PSCs内α-SMA的合成有显著下降,而Collagen Ⅰ的降低没有表现出统计学差异.结论 CTGF参与了胰腺纤维化的调控,MAPK和PI3-K信号通路均参与了CTGF的调控作用.     

巨噬细胞在小鼠肾纤维化恢复期的研究

目的:观察巨噬细胞在小鼠肾纤维化进展期和恢复期的作用。方法:采用单侧输尿管结扎(UUO)肾纤维化模型和输尿管再通模型(RUUO)进行试验研究;用Masson染色和HE染色观察肾脏纤维化程度和炎症变化趋势;流式分析肾脏中巨噬细胞细胞群的比例变化。结果:Masson染色显示肾脏纤维化程度在梗阻解除后胶原沉积面积减轻从80%降到46%,差异有统计学意义(P0.05)。HE染色显示梗阻解除后肾间质炎症减轻,且有新生小管形成。流式结果显示梗阻解除后巨噬细胞细胞群比例由19%降到2.6%,差异有统计学意义(P0.05)。结论:巨噬细胞可能在肾纤维化恢复期发挥一定作用。     

Immunohistochemical localization of D-alanine to beta-cells in rat pancreas

A mouse monoclonal antibody against D-alanine (D-Ala) has been raised and the immunohistochemical localization of this D-amino acids in the rat pancreas is visualized. The obtained anti-D-Ala monoclonal antibody has no significant cross-reactivity to all proteinogenic L-amino acids and their D-enantiomers. Using this antibody, immunohistochemical staining was performed on the pancreas, and specific staining for d-Ala has been observed only in the Langerhans islets. To identify the types of D-Ala-immunopositive cells, double staining was carried out with antibodies against D-Ala and pancreatic hormones. Similar immunostaining patterns have been observed for D-Ala and insulin, while D-Ala is hardly co-localized with other hormones (glucagon, somatostatin, and pancreatic polypeptide). These results indicate for the first time that D-Ala is localized to insulin producing beta-cells in mammalian pancreas, suggesting that this D-amino acid would be involved in the regulation of the blood glucose level.     

慢性肾衰竭大鼠模型的建立

目的 建立两种慢性肾衰竭大鼠模型,观察瘦素蛋白在大鼠组织、器官中的表达.方法 建立两种慢性肾衰竭CRF动物模型:(1)大鼠肾大部分切除诱发肾衰(Platt法).(2)腺嘌呤诱发大鼠慢性肾衰竭的动物模型(Yokozawa法).分别测定血清中血尿素氮(BUN),血肌酐(Scr)Ca2+、P5+等含量.取肾脏组织,HE染色,行免疫荧光,检测瘦素蛋白在两种慢性肾衰竭大鼠模型中的表达情况.结果 模型组大鼠血清中血尿素氮(BUN),血肌酐(Scr)等含量明显升高,免疫荧光检测显示两种模型大鼠肾脏组织瘦素蛋白的表达.结论 成功建立两种慢性肾衰竭CRF动物模型,显示不同模型组织部位的瘦素蛋白的表达.为进一步探讨瘦素蛋白在动物体内的生物学作用提供实验基础.     

黑苦荞茎叶对2型糖尿病小鼠的治疗作用及其对其胰腺、脾脏的影响

目的:观察黑苦荞茎叶(BBL)对2型糖尿病小鼠治疗作用及其对胰腺、脾脏的影响。方法:将40只SPF级雄性C57/B16小鼠随机分为正常对照组(n=10)和实验组(n=30),实验组给予高糖高脂饲料喂养1个月后,每只小鼠在禁食12h后腹腔注射链脲佐菌素35mg/kg,注射后72h取尾血测血糖≥13.8mmol/L为糖尿病小鼠。成功建立2型糖尿病(T2DM)模型的30只小鼠随机分为3组(n=10):模型对照组(DM组)、低剂量黑苦荞茎叶治疗组(DM+L)组、高剂量黑苦荞茎叶治疗(DM+H)组。对照组和模型组小鼠每日给予生理盐水灌胃,两个黑苦荞茎叶组分别给予0.21g/kg·d-1和0.42g/kg·d-1的黑苦荞茎叶灌胃,14d后杀死小鼠,取血和胰腺、脾脏,检测血清中葡萄糖(FBG)、甘油三酯(TG)、总胆固醇(TCH)、胰岛素和脾脏组织中TNF-α蛋白的含量,观察胰腺组织形态学,称量小鼠体重和脾脏重量、计算脾脏系数,检测胰腺组织中IRS-1mRNA的表达和胰腺组织内胰岛素受体底物IRS-1蛋白表达。结果:与对照组相比,模型组小鼠血清FBG、TC、TCH水平明显升高,使血胰岛素水平明显下降,脾脏组织TNF-α蛋白表达水平显著升高,胰腺组织中IRS-1mRNA表达和IRS-1的蛋白表达水平显著降低(P<0.05);与模型组相比,治疗组小鼠的血清FBG、TC、TCH水平明显降低,血胰岛素水平显著升高,小鼠脾脏系数、脾脏组织TNF-α蛋白表达水平、胰腺组织IRS-1mRNA表达和IRS-1的蛋白表达水平显著升高(P<0.05)。高剂量黑苦荞茎叶(0.42g/kg·d-1)治疗作用更加明显。结论:黑苦荞茎叶对2型糖尿病小鼠具有显著的降血糖、降血脂的治疗效果,对糖尿病小鼠胰腺、脾脏具有一定的保护作用。