高灵敏显色降解试剂4-N，N-二甲氨基偶氮苯-4′-异硫氰酸酯(DABITC)在蛋白质顺序分析中的应用

一、序言 Edman降解是蛋白质顺序分析最有效的方法。它由三步反应组成,首先,异硫氰酸苯酯(PITC)在碱性pH下与肽或蛋白质的N-端氨基酸反应生成苯基氨荒酰(PTC)衍生物,然后在酸性pH下生成比原先的肽少一个氨基酸的肽与苯基噻唑啉酮(PTZ)衍生物,后者在酸性     

液质联用多反应监测法定量目标多肽或蛋白质

为建立优化的血浆内源性多肽提取方法,并且构建目标多肽和蛋白质的质谱定量方 法,本研究考察了超滤法、有机溶剂沉淀法和固相萃取法对血浆内源性多肽的提取效果 ,并通过Tricine-SDS-PAGE对提取效果进行比较.通过液相色谱串联质谱多反应监测 （MRM）分析,建立了多肽标准品ESAT-6定量方法,并将ESAT-6定量建立的液相色谱和质谱条件应用于蛋白质的定量,对多肽和蛋白质MRM定量的标准曲线进行了考 察.Tricine-SDS-PAGE结果表明,乙腈沉淀法是最佳的血浆内源性多肽提取方法,低分子量的多肽可以得到很好的富集,且能有效地去除高分子蛋白质的污染.液相色谱串联 质谱MRM法检测血浆内提取的多肽,标准曲线的线性较好,相关系数为0.999.另外,采 用MRM法对胶内分离的蛋白质进行定量,标准曲线的线性相关系数为0.995.综上所述, 本研究构建了一种简单有效的血浆多肽提取方法,通过液质联用MRM法成功地实现了目标多肽和蛋白质定量测定.该定量方法可以推广应用于复杂样品中的多肽和蛋白质的定 量分析.     

多肽、蛋白质的固相序列分析

本文综述了多肽、蛋白质固相序列分析的原理及目前的研究状况。讨论了各类载体在该方法中的使用及存在问题、载体与肽的偶联方式以及对Edman降解产物的分析鉴定等。着重说明了新型载体的研制及其应用。     

固相抗体放射免疫分析法测尿中微量白蛋白

将抗人白蛋白抗体(或第二抗体)与纤维素偶联,建立了固相放免法。其剂量反应曲线在20—540ng/ml范围内呈一直线,灵敏度为20ng/ml。20例正常人尿中微量白蛋白测定值为5.71±1.39 mg/24 h尿,与液相放免法的7.17±3.70mg/24 h尿的结果相接近。固相一抗放免法和液相或固相二抗放免法均有很好相关。     

用化学方法降解肽链N-末端被封闭的残基及其鉴定

在测定蛋白质或多肽的一级结构时,常会遇到N-末端被封闭的情况,使Edman降解试剂失去作用,无法用正常的降解程序进行蛋白质或多肽的一级结构的测定。N-末端受封闭的种类很多,其中主要是乙(甲)酰化和焦谷氨酰环化。它们大量存在于自然界的蛋白质或活性多肽中,也有部分是在处理过程中通过化学反应形成的。目前对N-末端酰化的肽链结构除了用质谱法等物化方法测定外,几乎没有别的更好的方法,至于焦谷氨酰残基环化的肽     

用化学方法降解肽链N-末端被封闭的残基及其鉴定

在测定蛋白质或多肽的一级结构时,常会遇到N-末端被封闭的情况,使Edman降解试剂失去作用,无法用正常的降解程序进行蛋白质或多肽的一级结构的测定.N-末端受封闭的种类很多,其中主要是乙(甲)酰化和焦谷氨酰环化.它们大量存在于自然界的蛋白质或活性多肽中,也有部分是在处理过程中通过化学反应形成的.目前对N-末端酰化的肽链结构除了用质谱法等物化方法测定外,几乎没有别的更好的方法,至于焦谷氨酰残基环化的肽     

多肽固相合成的研究进展

多肽固相化学合成法是蛋白质研究领域非常重要的研究方法之一,主要可以分为Boc方法和Fmoc方法,在生物药物、蛋白质工程、免疫学等研究中得到了广泛的应用。该文论述了多肽固相合成法的原理,比较了两种典型合成方法的优缺点,介绍了适用于该方法的多肽种类,提出了多肽合成过程中存在的问题与解决策略,最后展望了多肽合成法的应用前景,以供相关领域的研究人员参考。     

虎纹捕鸟蛛毒素-Ⅰ突变体A1Y-HWTX-Ⅰ的固相合成和生物学活性测定

用芴甲氧羰基 (Fmoc)固相多肽合成的方法在自制自动蛋白质化学工作站上合成了用酪氨酸 (Y)替代虎纹捕鸟蛛毒素 - (HWTX- )第一位丙氨酸 (A1 )的突变体 A1 Y- HWTX- .合成的突变体用 Edman降解和电喷雾质谱法进行鉴定 .活性分析结果证明 ,合成的 A1 Y- HWTX- 在含有谷胱甘肽的缓冲体系中氧化折叠后显示出与天然 HWTX- 完全相同的生物学活性 ,提示 Y替代 HWTX- 的 A1后并不明显影响 HWTX- 的活性部位和空间构象 ;A1与 HWTX- 生物学活性无关 .此外 ,将 Y引入 HWTX- 分子有助于利用碘标记方法研究 HWTX- 的作用机制     

串联质谱在多肽测序中的应用

采用纳升喷雾(Nano)技术和碰撞诱导解离(CID collision inducd dissociation)方法,在电喷雾-四极杆-飞行时间质谱(ESI-Q-TOF electrspectrometry ionization-quadrupole-time of flight)上,对两种序列部分未知的天然多肽进行从头测序(de novo sequence),结果证明质谱的de novo sequence可以方便有效的解决传统的Edman降解法测序中常见的实际问题,如末位残基的丢失,赖氨酸和亮氨酸难鉴定等,此方法的建立是对Edman降解测序法很好的补充．     

反相C18固相萃取小柱用于蛋白质组分析中少量样品预处理

针对少量且复杂蛋白质组样品,开发一种耗时短、操作简便的分离方法。以人的脑海马组织蛋白样品为研究对象,采用反相C18固相萃取小柱,采用不同乙腈浓度对酶切后样品进行梯度洗脱,与反相高效液相色谱法对比分离效果。通过比较不同乙腈梯度洗脱方案所鉴定到的谱图数、非冗余多肽数、蛋白数和各洗脱组分间重复率分析,确定一种样品量少、简单易行、分离效果好的实验方案。虽然反相C18固相萃取小柱法鉴定蛋白总数占高效液相色谱法的85.5%,但其操作简单,耗时少。通过4种不同乙腈浓度方案比较,确定乙腈洗脱浓度优化为5%、15%、20%和90%时,分离30μg人的海马多肽混合物可以得到较优的分离效果。其蛋白鉴定数为反相液相色谱法的67.0%,且重复性良好。该结果证实反相C18固相萃取小柱分离效果比反相高效液相色谱法稍差,但此方法可以分离少量复杂蛋白质组样品。该方法分离样品充分,操作易行,耗时短,是进行蛋白质组学分析中少量样品的一个简便预处理方法。     

免疫吸附亲和层析法提纯抗原、抗体——甲种胎儿蛋白的純化

亲和层析法是利用生物高分子化合物特有的功能专一性,使可逆地与其相对应的固相配基结合,而将生物高分子从其它杂质中分离出来的一种方法。目前已应用于蛋白质、酶、核酸、病毒、抗原和抗体等的提纯。把抗原或抗体用共价键联结到固相载体上,用以分离和纯化相应的抗体或抗原的方法称为免疫吸附法。例如,血清甲种胎儿蛋白(AFP)与白蛋白     

大疣蛛毒素-Ⅵ的分离纯化及部分生物学活性鉴定

从雷氏大疣蛛(Macrothele raveni)粗毒中,结合阳离子交换和反相高效液相色谱分离到一种多肽神经毒素,命名为大疣蛛毒素-VI(Raventoxin-VI).经MALDI-TOF质谱分析,它的分子量为(5 371.6±0.5) Da.利用Edman降解气相蛋白质测序仪测得其氨基酸序列是NH2-NIIKGRVVKLCGGCAQKCCDREPRCDPCRTCVENVGT-GGGYLSSNKKCNGS-COOH,其中8个Cys形成4对二硫键.Raventoxin-Ⅵ能阻断小鼠膈神经膈肌标本神经肌肉接头传递,脑室注射能使小鼠瘫软.从一级结构上没有发现与该毒素有较高相似性的其他蜘蛛毒素.     

4-羟基壬烯醛修饰蛋白质组富集方法进展

4-羟基壬烯醛(HNE)修饰是一种重要的翻译后修饰,具有很重要的生物学意义和临床意义.由于HNE修饰蛋白质在生物体内丰度普遍较低,在质谱分析前要先进行富集.本文介绍了目前富集HNE修饰蛋白质组的研究现状及其相关原理(主要富集方法:免疫亲和法、凝集素-亲和素富集法、氟固相萃取法和固相肼化学法),并总结了它们的优缺点;在此基础上,探讨了研究HNE修饰蛋白质组未来的研究方向.     

大疣蛛毒素-VI的分离纯化及部分生物学活性鉴定

从雷氏大疣蛛(Macrotheleraveni)粗毒中,结合阳离子交换和反相高效液相色谱分离到一种多肽神经毒素,命名为大疣蛛毒素 VI(Raventoxin VI).经MALDI TOF质谱分析,它的分子量为(5371.6±0.5)Da.利用Edman降解气相蛋白质测序仪测得其氨基酸序列是NH2 NIIKGRVVKLCGGCAQKCCDREPRCDPCRTCVENVGT GGGYLSSNKKCNGS COOH,其中8个Cys形成4对二硫键.Raventoxin Ⅵ能阻断小鼠膈神经膈肌标本神经肌肉接头传递,脑室注射能使小鼠瘫软.从一级结构上没有发现与该毒素有较高相似性的其他蜘蛛毒素.     

大肠杆菌热稳定性肠毒素的分离纯化和氨基酸顺序测定

上海市儿童医院婴儿腹泻病患中分离到产肠毒素的菌株,该菌株只产热稳定性肠毒素,经CAD-44树脂吸附,SephadexG-25凝胶过泸,DEAE-Seharose CL-6B离子交换层析,反相高压液相层析分离纯化后,用手工固相DABITC/PITC双偶合Edman降解法测定其氨基酸顺序为:Asn·Ser·Ser·Asn·Tyr·Cys·Cys·Gly·Leu·Cys·Cys·Asn·Pro·Ala·Cys·Thr·Gly·Cys·Tyr。     

分散固相萃取剂-液相色谱串联质谱法测定鸡肉和鸡蛋中氟苯尼考和氟苯尼考胺残留

建立分散固相萃取剂-液相色谱串联质谱法(HPLC-MS/MS)同时检测鸡肉及鸡蛋中氟苯尼考和氟苯尼考胺的方法.样品用乙腈提取,C18分散固相萃取填料净化,乙腈饱和的正己烷脱脂,电喷雾离子源正负模式切换,HPLC-MS/MS多反应监测(MRM),同位素内标法定量.氟苯尼考和氟苯尼考胺线性范围分别为0.1 ng/mL～2....     

mRNA展示技术

mRNA展示技术是一种新兴的体外筛选多肽和蛋白质的有力工具.在筛选过程中,mRNA与其编码的多肽或蛋白质共价结合,形成mRNA-蛋白质融合体,能在大容量的多肽文库(1013～1015)中筛选具有特定生物学功能的多肽和蛋白质.目前,mRNA展示技术主要应用于各种靶分子的多肽和蛋白质适体的发现以及蛋白质相互作用机制的阐明和分析.由于其自身的巨大发展潜力,mRNA展示技术具有更为广阔的应用前景.     

蛋白质固相序列分析技术新进展

综述了近年来蛋白质与多肽固相序列测定技术的主要进展。对衍生PVDF膜载体,CPG毛细管柱,SDS与双相凝脘电泳分离的蛋白质的固相序列分析,TNBS的应用和磷酸化修饰位点的确定,以及第二代固相蛋白质序列分析仪等作了扼要的介绍。     

基于等电聚焦-反相HPLC的虎纹捕鸟蛛毒素组学的初步研究

虎纹捕鸟蛛(Ornithoctonus huwena)是中国最毒的蜘蛛之一.已有研究表明,其粗毒中含有丰富的低分子量(<10 kD)多肽活性成分.为分析这些成分, 利用目标蛋白快速分离系统(ProteomeLab PF 2D)建立了一种新的二维液相色谱分离方法.该方法包括一维的基于蛋白质等电点(pI)的色谱聚焦分离和二维利用无孔硅胶反相柱的基于疏水性的高效液相色谱分离.得到的反相图谱通过仪器配套的ProteoVue软件转换成与凝胶电泳图像相似的pI/UV图,以更直观地显示多肽成分的数量、分布规律及相对丰度等.洗脱的多肽自动收集后用基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱进行分析.从一维分离的11个馏分(pH 4.53-8.59)中共检测到大约600个多肽条带.通过质谱分析测得130个多肽的精确分子量,同时通过De novo测序得到26种多肽(其中包括12种已知多肽)的部分序列信息,并利用这些序列信息对未知多肽进行了生物信息学分析.     

基因工程

核酸及蛋白质合成、提取、纯化931888ONA侧序反应纯化的固相方法〔英〕/Tong,X.…/Anal。Chem一1992,6魂(22)。一2672~2677〔译自DBA,1993,12(i),。3一00002〕 在酶促延伸反应中采用了5尸末端用吕:P标记、中间位置含生物素类的引物寡核昔酸,形成的产物与抗生蛋白链菌素包被的磁性珠拉结合。通过变性并洗涤珠粒除去模板链和其它反应污染物,通过在EDTA/甲酞胺混和物中加热,洗脱残留的纯单链片段。将珠粒固定于具固定磁铁的样品管之后,洗涤珠粒以除去各种污染物(如蛋白、盐类、模板DNA及未掺入或降解的三礴酸脱氧和双脱氧核昔。通过在9…