原癌蛋白c-Cbl促进受体酪氨酸激酶EphA2的降解

c Cbl最近被证明是泛素 蛋白酶体 (ubiquitin proteasome)通路中的一个新的RINGFinger型泛素连接酶 (ubiquitinligase ,E3) .c Cbl可以介导受体酪氨酸激酶和非受体酪氨酸受体激酶的降解 .利用内源性表达较高EphA2的大肠癌细胞株HCT1 1 6 ,通过转染野生型c Cbl和显性负变异体(dominantnegativemutant)c Cbl 70Z ,探讨c Cbl在EphA2降解中的作用 .结果显示 ,c Cbl可促进磷酸化EphA2的降解 ,EphA2的降解必须依赖其配体ephrin A1的刺激 ;利用蛋白酶体 (proteasome)抑制剂MG1 32可抑制磷酸化的EphA2降解 ,提示EphA2的最终降解部位是在蛋白酶体 .研究的结果提示 ,c Cbl作为泛素连接酶诱导磷酸化后的EphA2在蛋白酶体中降解     

EphA3促进胃癌细胞BGC823的增殖

目的:初步探索EphA3与胃癌细胞BGC823增殖的关系。方法:用T_4DNA连接酶将EphA3的全长cDNA片段连接到酶切后的慢病毒载体pCDH-EF1-MCS-T2A-Puro中制备慢病毒,感染胃癌BGC823细胞建立过表达EphA3细胞系,Western印迹检测目的蛋白的表达,CCK8细胞生长实验和裸鼠成瘤实验检测EphA3对BGC823细胞增殖的影响。结果:双酶切鉴定与基因测序表明过表达EphA3慢病毒载体构建成功;Western印迹表明建立了过表达EphA3的BGC823细胞系,高表达EphA3对BGC823细胞的增殖和成瘤后生长有明显的促进作用。结论:EphA3促进BGC823胃癌细胞增殖,为胃癌的靶向性治疗及个性化治疗提供了线索。     

EphA2对神经胶质瘤细胞系U251的凋亡﹑增殖﹑迁移和侵袭的研究

为了研究EphA2对神经胶质瘤细胞系U251在增殖、凋亡、迁移和侵袭方面所起的作用,用RT-PCR方法检测正常脑组织标本与两种恶性胶质瘤细胞系中EphA2 mRNA表达水平,然后用化学合成的针对EphA2基因的小干扰RNA(siRNA)下调该基因的表达,以检测其在U251中的生物学功能．证实了EphA2基因在正常脑组织标本中的表达水平远低于两种恶性胶质瘤细胞系．把体外化学合成针对EphA2基因的小干扰RNA(siRNA- EphA2)转染入U251细胞后,Western blot, 实时定量 RT-PCR检测到U251细胞中EphA2蛋白及mRNA表达水平都明显降低,并且细胞增殖受到显著抑制,同时出现了明显的细胞凋亡．伤口愈合实验(检测细胞迁移能力),Transwell小室实验(检测细胞侵袭能力)均表明,下调EphA2的表达后,细胞的迁移和侵袭能力较阴性对照组显著减弱．上述结果表明,在神经胶质瘤U251细胞中,EphA2与其恶性增殖及高度侵染性相关,可作为分子治疗的有效靶点．     

PC-1增强受体酪氨酸激酶家族成员EphA3在前列腺癌细胞中的转录

为了研究前列腺癌相关基因(prostate and colon gene 1, PC-1）对受体酪氨酸激酶家族分子EphA3表达的影响,用RT-PCR、实时PCR和Western印迹检测表达不同水平PC-1的前列腺癌细胞系LNCaP和C4-2中EphA3的表达情况. 发现PC-1可诱导EphA3基因表达上调. 采用荧光素酶实验检测PC-1对于EphA3启动子转录活性的影响,结果显示,PC-1对转录起始位点上游916 bp的启动子活性没有影响,而可增强转录起始位点上游2011 bp启动子的活性.对EphA3启动子－916 bp～－2　011 bp区域进行生物信息学分析,结果显示,此区域包含HSF、NF-1、Nkx-2、SP1和GATA-1等多种转录因子结合位点.实验结果表明,PC-1可通过影响EphA3启动子诱导EphA3基因高表达,其调控区域位于转录起始位点上游－2　011　bp至－916 bp之间,提示PC-1可能通过影响一些结合于此区域的转录因子来影响EphA3启动子的转录活性.     

EphA2、E-钙黏素在肿瘤中的研究

Eph受体激酶是受体酪氨酸激酶(RTKs)家族中最大的一个亚族.EphA2是Eph受体中的一员,可以调节细胞生长、迁移和血管生成.EphA2受体广泛过表达于上皮来源的肿瘤细胞,导致正常细胞恶性转化,增强肿瘤细胞的侵袭性、浸润性和转移性.E-cadherin是一种常见的上皮黏附分子,可以介导细胞之间的黏附,细胞向正常及肿瘤组织的移动并定位,同时可以影响其它蛋白的定位和转化,进一步促进肿瘤的恶型性.研究证明:许多上皮性肿瘤中,包括食管癌、宫颈癌、乳腺癌、结肠癌等都发现EphA2和E-cadherin均有异常表达,且与肿瘤的恶性程度和疾病的预后有密切的关系.本文从EphA2、E-cadherin的结构、功能、相互关系以及在肿瘤中的研究加以综述.     

膀胱移行细胞癌中EphA2的表达和肿瘤MVD计数的关系

目的:探讨膀胱移行细胞癌中EphA2的生物学意义以及EphA2与微血管密度(MVD)的关系。方法:应用免疫组织化学技术检测85例膀胱移行细胞癌及10例正常膀胱粘膜中EphA2的表达,采用CD31染色标记微血管,行肿瘤微血管密度计数。结果:膀胱移行细胞癌和正常膀胱粘膜EphA2表达阳性率分别为89.4%(76/85)、40%(4/10),两组间差异有统计学意义(P<0.01);EphA2表达程度与膀胱癌的病理分级、临床分期和淋巴结转移均有相关性(P<0.05);膀胱移行细胞癌EphA2阴性组与EphA2阳性纽间肿瘤微血管密度(MVD)计数差异有统计学意义(P<0.05),EphA2不同阳性程度组之间MVD计数差异没有统计学意义(P>0.05)。结论:EphA2可作为判定膀胱癌恶性程度的参考指标,与肿瘤微血管生成相关,有望成为膀胱癌治疗的新靶向。     

促红细胞生成素产生肝细胞受体A2(EphA2)SAM结构域对激酶结构域的脂质体结合能力与激酶活性的调控研究

促红细胞生成素产生肝细胞受体(Eph receptor) 是受体酪氨酸激酶(RTK)家族中最大的亚家族,其介导的双向信号传导对细胞的形态、黏附、运动、增殖、生存及分化都有重要的调控作用。EphA2是Eph受体家族中一个被广泛研究的重要亚型,在白内障和乳腺癌等病理发生过程中发挥了重要作用。既往研究发现:EphA2受体的激酶结构域可结合细胞膜,其激酶活性受磷脂膜的调控,但是相邻的SAM结构域对激酶结构域与脂膜的相互作用以及激酶活性的影响尚不清楚。在此项研究中,通过与磷酸酶PTP1B1-301活性片段共表达的方式,表达、纯化了EphA2受体的胞内段激酶-SAM串联结构域,通过比较胞内段激酶-SAM串联结构域与单独激酶结构域的脂质体结合能力,以及测定对应的激酶活性,发现:EphA2受体胞内段的SAM结构域使其激酶结构域与脂质体(4 mg/mL)的结合能力增强约6倍(P＜0.001);磷酸化后的EphA2胞内段激酶-SAM串联结构域结合脂质体(4 mg/mL)的能力比非磷酸化的胞内段激酶-SAM串联结构域提高2.5倍(P＜0.05);而结合脂质体后,激酶结构域的激酶活性也被进一步提高,从而形成正反馈。综上所述,本研究的发现提示:EphA2胞内段的酪氨酸激酶结构域与相邻的SAM结构域可形成一个完整的结构功能单位,其激酶活性和脂质体结合能力与单独的激酶结构域相比都形成了明显的差异,我们的这一发现对进一步理解Eph受体家族其他亚型的激酶结构域的活性调控提供了参考与思路。     

EphA3基因启动子区域定位表达及活性分析

目的构建含有不同长度EphA3基因启动子片段的报告基因载体,研究其在293T细胞和MEF细胞中的转录活性。方法以Balb／C小鼠基因组DNA为模板,扩增不同长度的EphA3基因启动子片段,并克隆进入荧光素酶报告基因质粒pGL3-Basic真核表达载体内。酶切鉴定及基因测序无误后,将重组质粒和pRL—CMV内对照质粒共转染293T和MEF细胞,分析不同长度的OhA3基因启动子片段的转录活性。结果酶切和测序鉴定表明表达载体构建成功,EphA3基因的核心启动子区域位于-279bp～＋110bp之间,在293T细胞和MEF细胞中其转录活性相似。结论成功构建了荧光素报告基因重组质粒,并确定了BphA3基因的核心启动子区域。     

基于蛋白质-DNA复合物晶体结构的DNA结构动力学特性研究

依据最新NDB数据库中蛋白质-DNA复合物晶体结构数据,考虑DNA结构的序列依赖特性,对10个二联体和36个约化的四联体计算了DNA动力学结构模型中的关键参数——力常数矩阵,矩阵中的非对角项反映了结构参数间的关联。利用改进的DNA结构动力学模型,可以方便地计算给定序列的结构动力学特性。     

蛋白质与DNA相互作用的结构研究

蛋白质与核酸相互作用是生命体内两类最重要的生物大分子,它们之间的相互作用是行使细胞功能的关键,例如:基因复制、转录以及蛋白质的表达翻译等。目前有很多基于蛋白质与DNA复合物的结构研究,这些研究表明蛋白质-DNA的相互作用有很多种方式,所以并不能采用某一种规则或者算法来预测蛋白质与DNA的相互作用,本文主要综述了蛋白质与DNA的相互作用的常用数据库以及结构的特点。     

EphA2和E-cadherin在乳腺癌中的表达及其与患者预后的关系

目的探讨EphA2和E-cadherin在乳腺癌中的表达并分析两者表达与预后的关系。方法采用免疫组织化学SP法检测EphA2和E-cadherin在90例乳腺癌和20例乳腺良性病变组织中的表达,分析两者的表达情况与疾病的临床病理特征之间的关系及两种蛋白间的相关性。并分析90例乳腺癌患者的随访资料,判断EphA2和E-cadherin的表达与患者预后的关系。结果EphA2与E-cadherin在乳腺癌中阳性表达率分别为83.3%和35.6%,两者表达均与与肿瘤大小无关(P0.05);EphA2蛋白的阳性表达与组织学分级,临床分期,有无淋巴结转移有关(P0.05),而与病理类型无关(P0.05);E-cadherin蛋白的阳性表达与病理类型,组织学分级,临床分期,有无淋巴结转移有关(P0.05)。乳腺癌中EphA2和E-cadherin的蛋白表达呈负相关(r=-0.291,P0.05)。K-M法单因素分析显示EphA2蛋白的阳性表达患者5年生存率低于阴性患者(P0.05);E-cadherin蛋白的阳性表达患者5年生存率高于阴性患者(P0.05)。结论E-phA2和E-cadherin在乳腺癌中分别高表达和低表达,且均与乳腺癌预后密切相关,对判断乳腺癌的预后有重要预测意义。     

EphA3基因稳定表达细胞模型的建立与分析

目的：建立稳定表达外源EphA3基因的小鼠成纤维细胞株模型,初步探讨EphA3基因表达对肿瘤发生、发展的影响。方法：通过脂质体介导的方法,将真核表达载体pcDNA3.1（-）/myc-his-EphA3转染NIH3T3细胞,用Western印迹确定外源EphA3基因表达;通过MTT实验、软琼脂集落形成实验,观察EphA3基因表达对NIH3T3细胞生物学特性的影响。结果：建立了稳定转染EphA3基因的NIH3T3细胞株;EphA3基因表达的小鼠成纤维NIH3T3细胞生长速度没有明显变化,但在软琼脂上锚着非依赖生长的能力加强。结论：建立了稳定表达外源EphA3基因的NIH3T3细胞株,EphA3基因稳定表达具有诱导正常NIH3T3细胞发生恶性转化的重要生物功能。     

DNA光修复酶修复紫外损伤的DNA

DNA光修复酶在蓝光驱动下,利用黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）分子的黄素酶作为催化辅助因子,来修复紫外线诱导的环丁烷嘧啶二聚体（CPD）和嘧啶（6-4）嘧啶酮的DNA损伤产物。通过无根发育树,综述了DNA光修复酶/隐花色素家族的分类;详细地阐述两种DNA光修复酶的结构、光损伤后产生的嘧啶二聚体的结构及光修复过程;最后回顾了DNA光修复酶的研究现状并展望该领域的发展前景。     

EphA3受体截短突变体variant b在前列腺癌细胞中的分泌表达

目的:验证EphA3受体截短突变体variant b是否是一种分泌蛋白,并探索其内源分泌的特点,在细胞水平看其是否有作为前列腺癌血清标志物的潜质。方法:构建EphA3 variant b真核表达载体,应用标签抗体、特异性抗体和Western印迹检测前列腺癌细胞培养液中EphA3 variant b的表达,用RT-PCR方法分析EphA3 variant b在8种细胞系中的表达谱和对雄激素刺激的应答。结果:验证了EphA3 variant b是一种分泌蛋白,在雄激素受体阳性的前列腺癌细胞系中特异性表达,雄激素以剂量依赖方式诱导EphA3 variant b表达。结论:EphA3 variant b是一种分泌蛋白,其表达与雄激素受体信号通路相关,有作为前列腺癌血清标志物的潜质。     

PC-1、EphA3和SGEF蛋白表达的相互影响

目的:在293T和LNCaP细胞中验证PC-1、EphA3和SGEF蛋白表达的相互影响。方法 :采用半定量RT-PCR及Western印迹检测EphA3和SGEF在LNCaP细胞中与PC-1的关系,分别在LNCaP和293T细胞中检测EphA3对SGEF表达的影响。结果:在LNCaP细胞中,EphA3和SGEF在RNA及蛋白水平上均受PC-1高表达诱导,而EphA3的高表达对SGEF的表达无明显影响;但在293T细胞中,SGEF受EphA3表达水平的影响,随EphA3表达量的增加而升高。结论:PC-1、EphA3与SGEF蛋白表达的相互影响与细胞类型相关。     

分子生物学的今天和明天

1983年9月19—21日在美国纽约召开了一次会议,讨论了三十年来DNA研究进展,内容包括以下几个方面:(1)DNA基因与复制。三十年前DNA的螺旋结构还不完全肯定,今天则左螺旋与右螺旋的DNA结构全清楚了。(2)基因表达。基因的结构与表     

基于单链DNA开关调控的多功能生物电路（英文）

合成生物电路在生物传感及生物计算方面成为了广泛应用的工具。工程化生物电路系统具有良好的灵活性,同时也具备模块化的特征。在本文中,研究了基于单链DNA开关调控的多功能生物电路的构建方法。通过将计算机辅助设计的单链DNA开关作为核心控制元件,并利用长度为20 bp的toehold区域来激活单链DNA开关,驱动了简单的单向式、循环式以及级联的多层次的生物电路系统。在级联式电路系统中,通过调整单链DNA开关的结构,使信噪比从2. 996变成5. 274。同时,单链DNA开关作为长单链DNA(784 bp)的一部分,在无细胞蛋白质系统中实现了基因表达调控。因此,本文研究的工程化方法为今后复杂的人工生物电路的构建提供了坚实的技术基础。     

从凝胶中回收DNA——基因研究中的一个重要方法

在基因的结构与功能的研究中,如研究基因的物理图谱,测定DNA序列,DNA杂交,DNA重组等,都必须首先得到高纯度的足量DNA片段。凝胶电泳是按照分子大小分离DNA的好方法,既简便,又分辨率高。但电泳分离以后,如何从凝胶中回收DNA组份则是一个比较困难而又关键的问题。从已发表的     

抗癌药物奥沙利铂与DNA分子相互作用的研究

奥沙利铂被称为第三代铂类药物,特别对胃肠道肿瘤具有较好的疗效.目前大多数的研究表明奥沙利铂的主要作用靶点是DNA分子,但它与DNA分子形成的关键结构和作用机制仍处在探索阶段.本研究运用紫外可见吸收光谱和原子力显微镜观察探索奥沙利铂与DNA在活体外的相互作用过程,从而揭示奥沙利铂产生抗癌作用的主要分子结构基础.首先使用紫外光谱研究了较高浓度奥沙利铂与DNA的作用过程.在此基础上,进一步采用原子力显微镜在高定向热解石墨表面观察了不同浓度奥沙利铂与质粒DNA在37℃条件下作用不同时间后的结构形貌变化,分析了奥沙利铂与DNA相互作用的过程.高分辨原子力显微观察结果表明奥沙利铂与DNA作用后可导致质粒DNA的结构发生显著的变化.随着作用时间的增加,DNA分子逐渐由伸展的链状变化为相互缠绕并带有许多结点的紧密结构,最终变化为更紧密的球状结构.本研究结果表明奥沙利铂可通过化学键合作用和静电作用使质粒DNA逐渐凝集为紧密的球状结构,这种结构可能对奥沙利铂的抗癌活性和毒性产生重要影响.     

染色质免疫沉淀技术——一种研究基因表达调控的工具

染色质结构在基因表达调节中起着重要的调节作用。利用甲醛固定活细胞中的DNA与蛋白质,通过免疫沉淀分离复合物的染色质免疫沉淀法是研究体内DNA和蛋白质相互作用的一种新方法,它不仅可用来研究体内反式因子与DNA的相互作用,也可以用来研究组蛋白修饰与基因表达的关系,从而分析蛋白质及其体内的DNA结合序列。目前,该方法在染色质结构研究中获得了广泛的应用。