半夏蛋白的分离、结晶、生物活力和一些化学性质

从中草药半夏(Pinellia ternata Breit.)的鲜汁中分离出一种植物蛋白质组分,定名为半夏蛋白。它在稀磷酸缓冲液,pH 6.8,28～30℃结晶。它具有抑制早期妊娠的活力。给怀孕七天的小白鼠每只皮下注射250微克半夏蛋白,50%注射过的小白鼠引起流产。半夏蛋白也是一种植物凝集素,它与兔红血球有专一的血凝活力,浓度低至每毫升2微克仍有凝集作用。用凝胶过滤法测定,半夏蛋白分子量为44,000。十二烷基硫酸钠或胍盐存在下,半夏蛋白解聚成亚基。测定了半夏蛋白的氨基酸组成和N-末端氨基酸残基。半夏蛋白不含己糖。有迹象表明半夏蛋白可能是其分子大小、结构与性质极为相近的一组蛋白。     

结晶半夏蛋白在6M 盐酸胍中的可逆变性

前文——“半夏蛋白的分离、结晶、生物活力和一些化学性质”中已报道,半夏蛋白经变性剂处理后解聚成为亚基。结晶半夏蛋白经6M 盐酸胍变性后,用分步透析法,即用缓冲液等体积递减稀释变性剂,最终“恢复半夏蛋白”于生理盐水中平衡,去除变性剂,可以重新天然化。去除胍的“恢复半夏蛋白”,分子大小、亚基结构和肽链构型不变,完全恢复其在小白鼠中抑制早期妊娠的活力,并能在天然半夏蛋白相同的结晶条件下再结晶。     

结晶半夏蛋白在6M盐酸胍中的可逆变性

前文——“半夏蛋白的分离、结晶、生物活力和一些化学性质”中已报道,半夏蛋白经变性剂处理后解聚成为亚基。结晶半夏蛋白经6M盐酸胍变性后,用分步透析法,即用缓冲液等体积递减稀释变性剂,最终“恢复半夏蛋白”于生理盐水中平衡,去除变性剂,可以重新天然化。去除胍的“恢复半夏蛋白”,分子大小、亚基结构和肽链构型不变,完全恢复其在小白鼠中抑制早期妊娠的活力,并能在天然半夏蛋白相同的结晶条件下再结晶。     

脂肪细胞上的半夏蛋白受体

本文对分离的大鼠附睾脂肪细胞与半夏蛋白结合的若干性质进行了探讨。脂肪细胞与半夏蛋白的结合是专一的,非标记半夏蛋白可完全地置换~(125)Ⅰ-半夏蛋白。脂肪细胞上半夏蛋白受体与半夏蛋白的结合对半夏蛋白而言是一饱和过程,饱和曲线呈反曲形,但Scatchard图形则是一不规则的曲线,提示脂肪细胞上可能存在不止一种半夏蛋白受体。根据饱和曲线计算,每个脂肪细胞可结合大约6～7×10~7个分子半夏蛋白。当反应液中~(125)Ⅰ-半夏蛋白浓度对细胞而言足够高时,半夏蛋白与其受体的结合随溶液中细胞浓度的增高而增加。半夏蛋白与其受体的结合随温度的升高而减少,37℃的结合量仅为0℃的10%左右。在24℃时,半夏蛋白与其受体的结合很快达到平衡,但自然解离则极慢。在0℃达到平衡的半夏蛋白-受体复合物,当移置到37℃时,则很快解离,达到新的平衡,提示复合物在0℃比在37℃稳定。反应液中α-甲基甘露糖苷浓度为0.1M或甘露聚糖浓度为2毫克/毫升时,均观察不到它们有促使复合物解离的作用。伴刀豆球蛋白A具有显著的但不完全的抑制半夏蛋白与其受体结合的能力,它也能使半夏蛋白-受体复合物部分解离。胰岛素即使浓度高达2.5×10~(-5)M亦不抑制~(125)Ⅰ-半夏蛋白与其受体的结合。     

脂肪细胞上的半夏蛋白受体

本文对分离的大鼠附睾脂肪细胞与半夏蛋白结合的若干性质进行了探讨。脂肪细胞与半夏蛋白的结合是专一的,非标记半夏蛋白可完全地置换~(125)I-半夏蛋白。脂肪细胞上半夏蛋白受体与半夏蛋白的结合对半夏蛋白而言是一饱和过程,饱和曲线呈反曲形,但Scatchard图形则是一不规则的曲线,提示脂肪细胞上可能存在不止一种半夏蛋白受体。根据饱和曲线计算,每个脂肪细胞可结合大约6～7×10~7个分子半夏蛋白。当反应液中~(125)I-半夏蛋白浓度对细胞而言足够高时,半夏蛋白与其受体的结合随溶液中细胞浓度的增高而增加。半夏蛋白与其受体的结合随温度的升高而减少,37℃的结合量仅为0℃的10%左右。在24℃时,半夏蛋白与其受体的结合很快达到平衡,但自然解离则极慢。在0℃达到平衡的半夏蛋白-受体复合物,当移置到37℃时,则很快解离,达到新的平衡,提示复合物在0℃比在37℃稳定。反应液中α-甲基甘露糖苷浓度为0.1M或甘露聚糖浓度为2毫克/毫升时,均观察不到它们有促使复合物解离的作用。伴刀豆球蛋白A具有显著的但不完全的抑制半夏蛋白与其受体结合的能力,它也能使半夏蛋白-受体复合物部分解离。胰岛素即使浓度高达2.5×10~(-5)M亦不抑制~(125)I-半夏蛋白与其受体的结合。     

半夏蛋白的若干生物学性质

从半夏块茎鲜汁分离的半夏蛋白具有凝集细胞和促使细胞分裂的作用。在已测试的红细胞中凝集羊、狗、猫、兔、豚鼠、大鼠、小鼠和鸽的红细胞,但不凝集人、猴、猪和鸡、鸭、鹅、龟、蟾蜍、鳝的红细胞。半夏蛋白的血凝作用和已知的多种凝集素一样存在供血动物种属专一性。半抗原抑制试验结果,所测各种单糖、双糖、聚糖和糖蛋白中,只有甘露聚糖和含有寡聚甘露糖苷核心的甲状腺球蛋白有抑制作用,表明半夏蛋白只与甘露聚糖结合,且其分子上与糖互补的位置远远大于一个单糖分子的范围。是目前已知的唯一只与甘露糖而不与葡萄糖结合的一种具有凝集素作用的蛋白质。除红细胞外半夏蛋白亦凝集其它细胞,已测细胞中小鼠脾细胞、人肝癌细胞(QGY7703-3和7402)、艾氏腹水癌和腹水型肝癌细胞均被半夏蛋白凝集,但它不凝集大鼠附睾和猪大网膜脂肪细胞,虽然能和这两种细胞结合。提示半夏蛋白的细胞凝集作用不仅具有动物种属专一性并存在细胞类别专一性。半夏蛋白的促细胞分裂作用亦有动物种属专一性,它促使兔外周血淋巴细胞转化,但不促使人外周血淋巴细胞分裂。     

半夏蛋白的若干生物学性质

从半夏块茎鲜汁分离的半夏蛋白具有凝集细胞和促使细胞分裂的作用。在已测试的红细胞中凝集羊、狗、猫、兔、豚鼠、大鼠、小鼠和鸽的红细胞,但不凝集人、猴、猪和鸡、鸭、鹅、龟、蟾蜍、鳝的红细胞。半夏蛋白的血凝作用和已知的多种凝集素一样存在供血动物种属专一性。半抗原抑制试验结果,所测各种单糖、双糖、聚糖和糖蛋白中,只有甘露聚糖和含有寡聚甘露糖苷核心的甲状腺球蛋白有抑制作用,表明半夏蛋白只与甘露聚糖结合,且其分子上与糖互补的位置远远大于一个单糖分子的范围。是目前已知的唯一只与甘露糖而不与葡萄糖结合的一种具有凝集素作用的蛋白质。除红细胞外半夏蛋白亦凝集其它细胞,已测细胞中小鼠脾细胞、人肝癌细胞(QGY 7703-3和7402)、艾氏腹水癌和腹水型肝癌细胞均被半夏蛋白凝集,但它不凝集大鼠附睾和猪大网膜脂肪细胞,虽然能和这两种细胞结合。提示半夏蛋白的细胞凝集作用不仅具有动物种属专一性并存在细胞类别专一性。半夏蛋白的促细胞分裂作用亦有动物种属专一性,它促使兔外周血淋巴细胞转化,但不促使人外周血淋巴细胞分裂。     

鹅胰岛素的免疫交叉反应性、与受体的结合能力及生物活性

本文测定了结晶鹅胰岛素的免疫交叉反应性、与受体的结合能力及生物活性。鹅胰岛素能与豚鼠抗猪胰岛素血清反应,经放射免疫测定,它的交叉反应性是猪胰岛素的38.5%。用人胎盘细胞膜胰岛素受体与鹅胰岛素进行结合实验,鹅胰岛素与胰岛素受体的结合能力是猪胰岛素的56.4%。小白鼠惊厥法测出其生物活力是26.8I.U/毫克。     

半夏蛋白的抗兔胚泡着床作用

半夏蛋白有很强的抗兔胚泡着床作用,子宫内注射500μg,抗着床率达100%。经半夏蛋白作用后的子宫内膜能使被移植的正常胚泡不着床。在子宫内经半夏蛋白孵育的胚泡移植到同步的假孕子宫,着床率随孵育时间延长而降低。用辣根过氧化物酶标记半夏蛋白的定位实验表明该蛋白结合在子宫内膜腺管的上皮细胞膜上。已知半夏蛋白有类似凝集素的活性,能与甘露聚糖结合,它的抗着床作用可能是由于该蛋白结合了母体和(或)子体细胞膜上的某些糖结构,改变了细胞膜的生物学行为所致。     

不同年龄小白鼠全脑细胞质氨酰tRNA合成酶活力的比较

从不同年龄(20天,30天,1年)的小白鼠全脑制得细胞质混合氨酰tRNA合成酶。用异源体系(即用酵母tRNA和小白鼠全脑氨酰tRNA合成酶)测定了氨酰tRNA合成酶分别载运~3H标记的Asp、Gly、Glu、Lys和Ala的活力。结果表明除未检出tRNA~(Glu)的合成酶活力外,对其余四种氨基酸都有明显的活力,特别是年龄20天小白鼠的氨酰tRNA合成酶对~3H-Gly具有高达35％的载运活力。对~3H-Gly、~3H-Lys和~3H-Ala的载运活力有随增龄而下降的趋势,但对~3H-Asp的载运活力则随年龄增长而增高。     

氟化钠对小鼠几种血清酶活性的影响

让刚断奶的小白鼠饮用NaF水溶液一个月后,测定其四种血清酶活性。在高氟条件下,血清中的谷草转氨酶、乳酸脱氢酶、羟丁酸脱氢酶的活力显著增高,而肌酸激酶的活力显著降低。小鼠肝和肾对氟中毒较为敏感,而骨骼肌和心肌对氟有较强的耐受力。对以上几种血清酶活性的测定可作为诊断氟中毒的一个辅助手段。为利用血清酶诊断氟中毒提供理论和实验依据     

中华鳖和小白鼠正常血清洁菌酶的初步测定和比较

本实验采用平板法对中华鳖和小白鼠两种动物的正常血清溶菌酶的活力进行了平板扩散法测定。从结果中发现,中华鳖的血清溶菌酶活力稍低于小白鼠,但两者均在１００Ｕ／ｍｌ以上,没有发现与个体大小、年龄及性别联系。     

放射免疫测定法

放射免疫测定(Radioimmunoassay,简称RIA)是六十年代发展起来的一种体外分析新技术。它综合了放射性同位素的灵敏性与抗原-抗体反应的特异性两大优点,因此样品(如血、尿)无需提纯,而且能检出毫微克甚至微微克量的待测物质     

半夏蛋白变性过程的圆二色性研究

测定了半夏蛋白的紫外圆二色谱,远紫外谱显示不常见的单一的226nm负峰,[θ]_(226)=-4.42×10~3度·厘米~2/分克分子;近紫外谱给出295nm 及286nm 的正峰,248nm 的负峰,265～280nm 的宽峰。这些CD 峰的峰值因加入胍而降低,降低过程相互间大体平行,[θ]对胍浓度曲线的转折点都在2.75M 胍左右,与一般蛋白质相同。还测定了6M 胍中变性的半夏蛋白的重天然化过程,发现分两个过程,一快一慢。慢过程的一级反应速度常数是0.144分~(-1),快过程的是3.57分~(-1)。     

半夏蛋白变性过程的圆二色性研究

测定了半夏蛋白的紫外圆二色谱,远紫外谱显示不常见的单一的226nm负峰,[θ]_(220)=-4.42×10~3度·厘米~2/分克分子;近紫外谱给出295nm及286nm的正峰,248nm的负峰,265～280nm的宽蜂。这些CD蜂的蜂值因加入胍而降低,降低过程相互间大体平行,[θ]对胍浓度曲线的转折点都在2.75M胍左右,与一般蛋白质相同。还测定了6M胍中变性的半夏蛋白的重天然化过程,发现分两个过程,一快一慢。慢过程的一级反应速度常数是0.144分~(-1),快过程的是3.57分~(-1)。     

胸腺激素受体的研究

胸腺激素可促进T淋巴细胞的成熟,因此在细胞免疫功能中起着十分重要的作用,本文报道了以~(125)Ⅰ-胸腺激素T_1的放射受体测定法研究猪胸腺激素T_1受体的初步结果。结果指出胸腺淋巴细胞的表面有胸腺激素受体,在pH6.0,37℃条件下,激素与淋巴细胞孵育60～90分钟,特异性结合可达最高。向结合系统中加入胰岛素、皮质激素或甲状腺素,不影响胸腺激素T_1与受体的结合,证明这种结合是专一的。但在胸腺激素各个组分间,这种专一性并不是很严格,例如胸腺激素E_1的性质与T_1有很大差别,但可以和T_1竞争受体。E_1和T_1可以竞争同一受体是否暗示它们作用于同一T细胞亚群,有待证实。胸腺激素与受体的结合能力与它的生物活力是相关的,T_1的活力随胰蛋白酶的消化而逐渐丧失,相应的T_1与受体结合的能力亦逐渐降低至零。所以用放射受体的方法测定的胸腺激素是代表有生物活力的部分,它的测定范围一般在10～1000毫微克之间。     

人参镇静、抗疲劳及抗高温低温的作用

用吉林人参水浸液給小白鼠腹腔注射,以各种实驗方法观察了人参的鎮靜、抗疲劳及抗温度刺激的作用。得出結果为:人参对小白鼠自发活动的鎮靜效应非常显著 (P<0.001),对士的宁、戊四唑等中樞兴奋药引起的惊厥也有显著性不等的拮抗效应。人参的抗疲劳作用表現在显著延长了小白鼠的游泳持續时間,其主要原因經直接测定系由于人参显著降低了氧耗量,故在缺氧条件下能相对延长动物的生命。人参又能提高小白鼠耐受高温、低温的能力(对低温比对高温更显著),但摘除腎上腺后則此效应消失。这暗示此項效应与垂体一腎上腺系統的应激反应有一定关系,但人参本身并不具有腎上腺皮质激素样作用。抑制小白鼠自发活动与提高小白鼠耐受低气压缺氧能力两方法,按其出現的稳定性与差异的显著性,适合于用作人参产品效价的檢定指标。     

胸腺激素受体的研究

胸腺激素可促进T淋巴细胞的成熟,因此在细胞免疫功能中起着十分重要的作用,本文报道了以~(125)Ⅰ-胸腺激素T_1的放射受体测定法研究猪胸腺激素T_1受体的初步结果。结果指出胸腺淋巴细胞的表面有胸腺激素受体,在pH6.0,37℃条件下,激素与淋巴细胞孵育60～90分钟,特异性结合可达最高。向结合系统中加入胰岛素、皮质激素或甲状腺素,不影响胸腺激素T_1与受体的结合,证明这种结合是专一的。但在胸腺激素各个组分间,这种专一性并不是很严格,例如胸腺激素E_1的性质与T_1有很大差别,但可以和T_1竞争受体。E_1和T_1可以竞争同一受体是否暗示它们作用于同一T 细胞亚群,有待证实。胸腺激素与受体的结合能力与它的生物活力是相关的,T_1的活力随胰蛋白酶的消化而逐渐丧失,相应的T_1与受体结合的能力亦逐渐降低至零。所以用放射受体的方法测定的胸腺激素是代表有生物活力的部分,它的测定范围一般在10～1000毫微克之间。     

浙江产眼镜蛇蛇毒胆碱酯酶的研究 Ⅱ.酶学性质与生物毒性

浙江眼镜蛇蛇毒胆碱酯酶具有乙酰胆碱酯酶的特征,有以下几点事实:1.乙酰胆碱酯是酶的最适底物;2.过量底物抑制酶活性;3.BW_(62)C_(47)、BW_(284)C_(51)是典型的真性酶抑制剂,对蛇毒胆碱酯酶也同样具有抑制作用。眼镜蛇蛇毒胆碱酯酶最适pH为7.5(0.1M磷酸缓冲液)。反应5分钟时的最适温度在38～39℃,K_m值是1.25×10~(-4)M。稀酶溶液不稳定,在0.1%白明胶中可保护酶活力。原蛇毒和纯化后的胆碱酯酶的底物抑制图形和K_m值是类似的,这说明纯化过程中酶没有矫变。蛇毒中的胆碱酯酶被多种有机磷化合物如二异丙基磷酰氟、敌敌畏、对氧磷所抑制。一些氨基甲酸酯和含季铵盐的化合物也表现有抑制。浙江眼镜蛇毒有较大的毒性,小白鼠腹腔注射最小致死剂量是0.88微克/克,用亲和层析分离除去胆碱酯酶后仍保留有蛇毒的毒性,最小致死剂量是0.77微克/克,纯化的胆碱酯酶含7.5微克/克蛋白,动物未致死,说明蛇毒的主要毒性并不是胆碱酯酶。     

浙江产眼镜蛇蛇毒胆碱酯酶的研究——Ⅱ.酶学性质与生物毒性

浙江眼镜蛇蛇毒胆碱酯酶具有乙酰胆碱酯酶的特征,有以下几点事实:1.乙酰胆碱酯是酶的最适底物;2.过量底物抑制酶活性;3.BW_(62)C_(47)、BW_(284)C_(51)是典型的真性酶抑制剂,对蛇毒胆碱酯酶也同样具有抑制作用。眼镜蛇蛇毒胆碱酯酶最适pH 为7.5(0.1M 磷酸缓冲液)。反应5分钟时的最适温度在38～39℃,K_m 值是1.25×10~(-4)M。稀酶溶液不稳定,在0.1%白明胶中可保护酶活力。原蛇毒和纯化后的胆碱酯酶的底物抑制图形和K_m 值是类似的,这说明纯化过程中酶没有矫变。蛇毒中的胆碱酯酶被多种有机磷化合物如二异丙基磷酰氟、敌敌畏、对氧磷所抑制。一些氨基甲酸酯和含季铵盐的化合物也表现有抑制。浙江眼镜蛇毒有较大的毒性,小白鼠腹腔注射最小致死剂量是0.88微克/克,用亲和层析分离除去胆碱酯酶后仍保留有蛇毒的毒性,最小致死剂量是0.77微克/克,纯化的胆碱酯酶含7.5微克/克蛋白,动物未致死,说明蛇毒的主要毒性并不是胆碱酯酶。