牛科动物HSL基因序列分析及其分子进化研究

在对牛科中4种动物即牦牛、瘤牛、普通牛和水牛HSL基因外显子Ⅰ部分核苷酸序列进行测定的基础上,与Gen-Bank中其他物种相应基因核苷酸序列、氨基酸序列进行了比对分析,并构建了牦牛与其他物种间分子系统进化树。结果表明:牦牛与普通牛、瘤牛、水牛、猪、人、小鼠、大鼠7个物种HSL基因外显子Ⅰ部分核苷酸序列间保守性较高,同源性大小依次为99.8%、99.6%、97.4%、90.6%、88.4%、83.5%、82.3%。相应氨基酸序列间保守性更高,同源性分别为100%、100%、98.2%、94.0%、92.2%、89.8%、89.8%。牦牛与各物种该基因部分核苷酸序列间碱基变异类型主要表现为碱基转换和颠换,无碱基插入和缺失发生,碱基转换的频率高于颠换的频率;在核苷酸水平上的多数碱基替换都是同义替换;序列间单碱基变异位点大多出现在同一位点,多发生在密码子第3位,其次是第1位,最少发生在第2位,符合分子进化的中性学说。HSL基因外显子Ⅰ部分核苷酸序列进行多序列对位排列构建的各物种间分子系统进化树结果表明,普通牛和瘤牛首先聚为一类,再分别与牦牛、水牛、猪、人聚类,最后与大鼠、小鼠聚为一类。该聚类结果与动物学上的分类结果一致,表明HSL基因外显子Ⅰ部分核苷酸序列适合于构建物种间分子系统进化树。研究表明,牦牛、普通牛和瘤牛3个物种间的遗传距离大小相近,牦牛和水牛间的遗传距离与普通牛、瘤牛和水牛间的遗传距离大小相当。牦牛、普通牛和瘤牛3个物种间的遗传距离远小于它们各自与水牛这一物种的遗传距离,它们三者之间的亲缘关系也相对于它们各自与水牛间的亲缘关系都较近,故将牦牛、普通牛和瘤牛划分在同一个属——牛属(Bos)更为合理。     

黄麂Mhc-DRB 基因多态性及其维持机制

利用牛DRB3 特异性引物(LA31 和LA32),通过聚合酶链式反应(PCR)、单链构象多态性(SSCP)以及克隆测序技术,从12 只黄麂个体中共获得20 个DRB 第二外显子等位基因,其中6 个个体具有3 ～ 4 个等位基因,提示利用该引物从黄麂中至少可以扩增出2 个DRB 位点。所有序列均无插入、缺失和终止密码子。基于序列比对(与牛DRB3 和鹿科DRB 基因同源性非常高),以及所检测到的氨基酸变异位点主要位于抗原结合区,推测本文所获得的黄麂序列为表达的、且具有重要功能的DRB 位点。抗原结合区氨基酸位点的非同义替换(d_N )显著大于同义替换(d_S )(P < 0.01),说明历史上黄麂DRB 基因经历过正选择作用。CODMEL 程序中的模型M7 和M8 似然比检测(Likelihood ratio test,LRT)结果同样支持上述推论。进一步利用经验贝叶斯法准确地检测出6 个受正选择作用的氨基酸位点(位点11、37、61、67、71、86),其中的5 个位点位于PBR 区。因此,正选择作用可能是维持黄麂DRB 基因多态性的主要机制之一。基于DRB 外显子2 序列利用邻接法(NJ)
构建了部分偶蹄动物系统发生关系,在NJ 树上,黄麂DRB 基因与其它鹿科动物DRB 基因呈镶嵌式分布,提示跨物种进化是维持黄麂DRB 基因多态性的另一重要机制。此外,黄麂两个等位基因(Mure-DRB1 和Mure-DRB11)和马鹿的两个等位基因(Ceel-DRB34 和Ceel-DRB46)与牛科的等位基因构成一个独立的进化枝,说明黄麂和马鹿的某些DRB 基因具有非常古老的谱系。     

牛凝乳酶原基因在乳酸乳球菌中的表达

【目的】利用乳酸乳球菌nisin诱导基因表达系统(the NIsin Controlled gene Expression system,NICE)表达牛凝乳酶原。【方法】从克隆载体pS19-PPC中获得牛凝乳酶原基因,将该基因与表达载体pNZ8148连接并电转化乳酸乳球菌NZ9000,转化子经酶切、PCR和测序鉴定后,用nisin进行诱导表达,表达产物利用SDS-PAGE和Western blot鉴定,表达产物纯化后检测凝乳活性。【结果】重组牛凝乳酶原与天然牛凝乳酶原比较,其分子量大小、免疫性质、生物活性和抑制剂敏感性没有发现显著差异,其凝乳活性可达2×103IMCU/mL。【结论】在乳酸乳球菌中表达了具有凝乳活性的牛凝乳酶原,同时乳酸乳球菌作为发酵剂和凝乳酶产生菌双重角色的实现,为奶酪加工提供了新思路和新方法。     

牛DLK1基因的生物信息学分析

DLK1基因是位于DLK1-DIO3印记区域内一个父源表达的印记基因。本研究利用生物信息学方法对牛DLK1基因进行了分子进化分析、基因和蛋白质结构分析并预测了其启动子和CpG岛区域。对7种动物DLK1基因mR NA序列的分子进化分析结果显示,牛与羊的遗传距离最小,亲缘关系最近。蛋白质在线分析软件表明,DLK1蛋白由信号肽、EGF结构域以及跨膜区组成。牛DLK1基因包含5个外显子,且存在多种可变剪切体。启动子在线软件预测,牛DLK1核心启动子可能位于该基因起始密码子上游1 790~1 840 bp处。预测结果表明,人、小鼠和牛三个物种DLK1潜在的核心启动子区所处的位置具有一致性,并且三个物种的启动子区DNA序列具有高度保守性。以上研究结果为进一步阐明牛DLK1基因的生物学功能及其印记调控机理提供了参考依据。     

猪卵泡抑素基因接拼形式克隆、表达及分析

猪卵泡抑素基因（Follistatin,FS）具有调控动物生殖活动和肌肉生长的生物功能,但对猪的研究报道很少。本研究克隆了猪卵泡抑素基因两种接拼形式、比较分析其蛋白结构特征、进化关系和组织表达特性。研究结果表明,通过两对引物成功克隆了猪卵泡抑素基因的1045bp（FS—L）和964bp（FS-L）的两种接拼形式;与Genbank中的序列比对表明FS-L和FS-L的CDS序列与人、牛、家鼠、沟鼠、斑马鱼的卵泡抑素基因序列相似性在80％以上。对两种蛋白质结构域的比较发现,FS-L蛋白相比FS-L蛋白而言缺失了一个FS结构域。同源性分析表明,猪与牛的亲缘关系较近,与人、小鼠、沟鼠和斑马鱼的关系相对较远。组织表达分析表明,两种拼接形式在梅山猪不同组织中的表达存在差异,FS-L基因在梅山猪肌肉及生殖系统等组织中均有表达,而FS-L基因则主要在生殖系统中表达。表明FS-L在肌肉生长中发挥作用,而FS-L主要调控动物的生殖功能。     

哺乳动物抗凝血酶基因的分子特征、微共线性与适应性进化

抗凝血酶(AT)是哺乳动物体内重要的天然抗凝血因子之一,它隶属于丝氨酸蛋白酶抑制物家族,主要参与并调节复杂的血凝过程。基于比较基因组学手段,共挖掘出17个哺乳动物抗凝血酶基因(AT),并剖析了它们的基因结构、微共线性、保守基序、功能结构域、以及系统进化关系。基因结构与微共线分析表明,哺乳动物AT基因具有5-12个外显子,大多数是7个外显子;不同物种AT基因所处区段之间具有较好的共线性。哺乳动物AT蛋白特征分析显示,SERPIN功能结构域与保守基序1、2、3、4、5、8和9存在相互重叠的部分。AT基因进化树揭示基因进化和通常认为的物种进化几乎一致。同时,利用PAML中Codeml的位点特异模型在AT基因中发掘了1个正选择位点328D。     

两种鲤鱼胰凝乳蛋白酶原基因的电子克隆及分析

为研究胰凝乳蛋白酶原在鱼类中的生理功能和作用机制,利用生物信息学的方法,成功获得了鲤鱼两种胰凝乳蛋白酶原的cDNA序列(ccCHTR1和ccCHTR2)并对其进行序列分析。结果显示,ccCHTR1 cDNA含有792 bp的开放阅读框,编码263个氨基酸;ccCHTR2 cDNA含有798 bp的开放阅读框,编码265个氨基酸。二者氨基端均含有18个氨基酸组成的信号肽,同时,在成熟肽的第15和16个氨基酸(R-I)之间存在一个切割位点。氨基酸比对结果显示,ccCHTR1和ccCHTR2具备胰凝乳蛋白酶原的保守结构特征,同时二者有72.8%的同源性,且都与斑马鱼有最高的同源性,分别是93.3%和73.5%。进化分析显示,二者分别与斑马鱼和鳕鱼亲缘关系最近,与哺乳动物的亲缘关系较远。     

犬MC1R基因的分子进化分析

黑素皮质素1型受体 (melanocortin 1 receptor, MC1R)基因具有调节哺乳动物细胞黑色素形成的作用, 因此被认为是影响犬毛色的重要候选基因。基于NCBI数据库上发表的犬等10个动物种MC1R的氨基酸序列和cDNA序列, 利用生物学软件和网络信息资源, 对犬等10种脊椎动物进行了分子进化分析。结果表明: (1) 基于MC1R氨基酸序列的聚类分析显示, 10个物种明显归为2类, 7个哺乳动物种为一紧密类群, 鸡与斑马鱼和河豚为一松散类群, 该聚类结果与公认的动物分类及进化关系密切吻合; (2) PAML的Branch模型预测显示, 犬、猪、猫在与牛的分化过程中MC1R受到正向选择作用(w =90.8177); Site模型预测显示, 犬MC1R的2V、25E、184N、197V、314L为正选择氨基酸位点; (3) 染色体连锁群比较分析显示, “ZFP276-MC1R-GAS8”基因连锁关系在人、黑猩猩、鸡和犬中保持一致。     

牛ASCL2基因生物信息学分析

在人与小鼠中,A SCL2基因是一个母源表达的印记基因,在早期胚胎和胎盘发育中起重要作用。牛A SCL2基因的印记状态和印记的分子机理还没有被研究。本研究采用生物信息学方法对牛A SCL2基因分子进化、启动子和CpG岛区域以及蛋白的高级结构进行分析和预测,为进一步揭示该基因生物学功能和其分子调控机理奠定基础。对21种哺乳动物A SCL2基因的mRNA序列进化分析表明：这21种哺乳动物间的遗传距离小于0.536,且牛与猪遗传距离最小,为0.106,与基因进化树分析结果一致。CpG岛在线软件预测显示,在牛中,该基因上游5 k序列中有三个CpG岛。启动子在线软件预测和转录因子分析相结合显示,启动子最可能位于该基因5'端上游4725~4775 bp处CpG岛区域内,此区域包括大量潜在转录因子结合位点,并在4734 bp处存在一个TATA框。蛋白质在线软件分析表明,A SCL2基因编码一种螺旋-环-螺旋形转录因子,有α-螺旋、β-转角和无规则卷曲3种二级结构。     

双峰驼口蹄疫病毒受体β6亚基基因的分子特征

病毒受体是病毒宿主范围和组织嗜性的一个决定因素。研究表明,四种整联蛋白αvβ1、αvβ3、αvβ6、αvβ8能够介导口蹄疫病毒感染偶蹄动物,且αvβ6是主要的口蹄疫病毒受体。本实验在首次从健康双峰驼肺组织中克隆到了β6亚基基因并进行了比较分析。结果显示,双峰驼β6基因的编码区含有2367个核苷酸,编码788个氨基酸残基,其中信号肽由26个氨基酸组成;胞外域由681个氨基酸组成,含有8个潜在的糖基化位点(NXT/NXS)和58个半胱氨酸（Cys）残基;跨膜区由29个氨基酸组成(708-736aa);胞浆域由52个氨基酸组成,含有一个NPLY核心基序和一个潜在的糖基化位点(NVT),该基因在GenBank中的登录号为EF613220。双峰驼β6基因与牛、猪、羊、人、小鼠、挪威大鼠β6基因的核苷酸序列同源性分别为91.1%、91.8%、90.6%、90.5%、83.7%、84.1%,推导的氨基酸序列同源性分别为94.3%、93.4%、93.4%、93.7%、88.7%、88.6%。偶蹄动物（双峰驼、牛、羊、猪）的β6基因同源性较高,在遗传进化树上同属于一个亚群,表明β6亚基可能与口蹄疫病毒的宿主范围有关。     

Molecular cloning and the nucleotide sequence of cDNA for embryonic chicken pepsinogen: phylogenetic relationship with prochymosin

Embryonic chicken pepsinogen is an aspartyl proteinase that is specifically secreted during the embryonic period in the chicken proventriculus (glandular stomach). To learn the phylogeny of this pepsinogen, we isolated a cDNA clone by screening a lambda gt11 library of embryonic proventricular cDNAs with an antiserum to the embryonic chicken pepsinogen. We obtained a 200-base pair cDNA clone which encoded 18 amino acids that had high sequence homology with the carboxyl termini of other pepsinogens. Northern blot analysis revealed that this cDNA clone hybridized to a mRNA of 1,600 bases in the embryonic proventriculus but not to the mRNA in the adult proventriculus. The almost complete nucleotide sequence of embryonic chicken pepsinogen-cDNA was determined by sequencing longer cDNAs obtained by screening the same library with the 200-base pair cDNA and primer extension with a synthetic primer. The cDNA consisted of 1,281 nucleotides and encoded 383 amino acids for prepepsinogen. The predicted amino acid sequence was compared with the sequences of other aspartyl proteinases: pepsinogen A of human, monkey, pig, and chicken, progastricsin of monkey and rat, and bovine prochymosin. The phylogenetic tree constructed for them indicates the possibility that embryonic chicken pepsinogen diverged from prochymosin, after prochymosin and pepsinogen A had diverged from each other.     

Molecular cloning of neonate/infant-specific pepsinogens from rat stomach mucosa and their expressional change during development

To clarify the nature of rat neonate/infant-specific pepsinogens, we carried out their purification and molecular cloning. Prochymosin was found to be the major neonatal pepsinogen. The general proteolytic activity of its active form, chymosin, was, however, lower than those of pepsins A and C which are predominant in adult animals. Molecular cloning of rat prochymosin cDNA was achieved along with cDNA for another neonate-specific pepsinogen, pepsinogen F, although determination of pepsinogen F in neonatal gastric mucosa was unsuccessful, presumably due to its lack of proteolytic activity or different proteolytic specificity. Northern blot analysis confirmed that genes for prochymosin and pepsinogen F are expressed only at neonatal/infant stages and the switching of gene expression to that of pepsinogen C occurred at late infant stages. A phylogenetic tree based on nucleotide sequences showed clearly that pepsinogens fall into four major groups, namely prochymosin and pepsinogen F of the neonate/infant and pepsinogens A and C of adult animals. Although, to date, prochymosin and pepsinogen F were believed to be expressed in only a limited number of mammals, the present results suggest that they might be expressed at the neonatal/infant stage in a variety of mammals.     

牛凝乳酶基因在毕赤酵母中的重组表达

通过PCR技术从克隆载体pMD18T-Prochy上扩增牛凝乳酶原基因,双酶切后定向插入到酵母表达载体pPICZaA中,构建表达质粒pPICZaA-Prochy,线性化后电转化毕赤酵母GS115,经PCR和测序鉴定凝乳酶原基因成功插入到毕赤酵母的基因组中。在甲醇诱导下进行凝乳酶的表达,SDS-PAGE分析证明重组凝乳酶的分子量约为37 kD,培养基上清液中凝乳酶的活性为12.2 SU/mL。本研究首次应用毕赤酵母表达牛凝乳酶,在培养基中获得分泌表达的重组凝乳酶,为干酪工业提供了新型及优良的凝乳酶来源。     

牛凝乳酶原基因的合成及其在乳酸克鲁维酵母中的表达

凝乳酶在奶酪加工中应用广泛,为获得高活性的凝乳酶制剂,采用乳酸克鲁维酵母为宿主,首次对经密码子优化的牛凝乳酶原基因进行表达。利用DNAWorks3.0软件辅助设计,用两步PCR法合成了小牛凝乳酶原基因(GenBank Accession No.AA30448)。将该基因插入酵母表达载体pKLAC1,构建了重组载体pKLAC1-Prochy,并用电脉冲法将线性化的重组质粒转化到乳酸克鲁维酵母GG799中。通过含1%酪蛋白的YEPD平板活性筛选,PCR鉴定,最后获得了一株多拷贝整合的基因工程菌chy1。该菌株可分泌表达牛凝乳酶原,经SDS-PAGE分析,证明重组牛凝乳酶原的分子量约为41kDa,符合预期大小,酸化处理后为36kDa,证明可以正确自我剪切。液体培养96h后,酶活最高达到99.67SU/mL。分别以半乳糖和葡萄糖为碳源的条件下表达,其酶活性差异不大,说明在发酵期间,可以不经过半乳糖诱导即可产生高水平的牛凝乳酶原产物。该工程菌的获得为进一步优化产酶条件及放大工艺提供了条件,并为凝乳酶的工业化生产奠定了基础。     

Rapid construction of large synthetic genes: total chemical synthesis of two different versions of the bovine prochymosin gene

We have tested several different synthesis designs and assembly methodologies to develop an improved gene synthesis strategy which enables significantly longer nucleotide sequences to be easily constructed. This strategy, based in part upon our ability to synthesize high-quality extended-length oligodeoxynucleotides (over 100-mer in length), together with the use of chemical 5'-phosphorylation, and simplified low-melting-temperature agarose gel purification methods, combines ease, speed and high overall efficiency. We show that it is now feasible to synthesize routinely even long genes (at least 1-2 kb). To demonstrate this capability we have chemically synthesized and assembled two different versions of the gene encoding the bovine enzyme prochymosin (prorennin). One gene is essentially the natural bovine prochymosin gene sequence. In the second gene the codons have been optimized with regard to the codon bias of highly expressed yeast genes. Each synthetic gene was in excess of 1100 bp, yet they were assembled from only 13 or 14 pairs of complementary oligodeoxynucleotides (oligos), the average lengths of which were 87 and 82 bp, respectively. The 'mutation' rate was low enough to assess that more than 75% of all such oligo pairs (160-170 total nt) were error-free.     

Structure of the human genomic region homologous to the bovine prochymosin-encoding gene

Two human genomic libraries were probed with bovine prochymosin (bPC) cDNA. Recombinant clones covering a genomic region homologous to the entire coding region and flanking sequences of the bPC gene were isolated. Human sequences homologous to exons of the bPC gene are distributed in a DNA fragment of 10 kb. Alignment of the human sequences and the exons of bPC reveals that the human 'exons' 1-3, 5 and 7-9 have sizes identical to the corresponding bovine exons, but a nucleotide (nt) has been deleted in the human exon 4 and two nt in the human exon 6. The aligned human sequence and the coding part of bPC gene share 82% nt homology, the value ranging, in separate exons, from 76 (exon 1) to 84% (exons 5 and 6). 150 bp of 5'-flanking sequence of the human gene has 75% homology to the corresponding region of bPC gene and contains a TATA-box in a similar position. A 1-nt deletion in the human exon 4 would shift the translational reading frame of a putative human PC mRNA relative to bPC mRNA, and result in an in-phase terminator spanning codons 163 and 164 in bPC mRNA. Another terminator in-phase with the amino-acid sequence encoded by the bPC gene occurs in the human exon 5 and the second frameshift mutation in exon 6. Thus, the nt sequence analysis of the human genomic region has revealed the presence of mutations that have rendered it unable to produce a full-length protein homologous to bPC and, therefore, we refer to this gene as a human prochymosin pseudogene (hPC psi). Blot-hybridization analysis of human genomic DNA indicates that hPC psi is a single gene in the human genome.     

基于涉案兽类12S rRNA基因的NCBI数据库序列可靠性分析

本研究以常用于动物种属鉴定的12S rRNA基因位点为研究对象,利用所测得的17种常见涉案兽类12S rRNA基因部分片段序列及NCBI数据库中下载的该物种DNA序列及其近缘物种DNA序列,构建系统进化树。根据进化树的聚类情况,判断NCBI数据库中的相关基因序列或物种名称的正确性,并对其中错误序列的登陆号进行标记,以防对后续涉案动物的准确鉴定造成影响。分别从17种常见涉案兽类(共26份样本)中提取线粒体DNA,并利用通用引物扩增线粒体DNA上的12S rRNA基因部分片段并进行测序分析。通过NCBI数据库的Blast比对功能,筛选出与本研究物种同源性由高到低的物种,并从NCBI基因数据库中下载此类近缘物种的12S rRNA基因序列共351条,利用MEGA7.0软件构建该物种及其近缘物种系统进化树。通过比对发现NCBI中登录号为KP202279等3个序列所对应物种拉丁名错误。登录号为AY184436等11个序列所对应物种拉丁名可能存在疑问。GenBank中某些物种拉丁名有同种异名现象。因此,NCBI数据库数据可靠性有待进一步验证,只能作为涉案物种鉴定的参考数据之一,可借助构建系统进化树等方法来确认其结果的准确性。     

Use of ars18 based vectors to increase protein production in Yarrowia lipolytica.

The isolation of ars sequence from the yeast Yarrowia lipolytica has recently been reported (Fournier et al., 1991). Vectors containing ars18 have been used to increase homologous and heterologous protein production. Examples presented are the Yarrowia lipolytica alkaline extracellular protease (AEP), the porcine alpha 1-interferon and the bovine prochymosin. A 2- to 6-fold increase in the corresponding protein production was observed and in several cases it was established that it corresponded to the copy number of plasmid in the cell.