中高温油藏内源微生物好氧激活技术研究

为了掌握中高温油藏内源微生物好氧激活特征,在胜利油田选取12个中高温油藏典型区块开展了好氧激活评价:在所选油藏温度范围分别为55~65℃、65~79℃、79~95℃,通过模拟油藏条件下好氧激活评价发现:在小于79℃油藏区块中,以玉米浆干粉、糖蜜、酵母粉等作为外加营养剂能够有效激活水样中的功能菌株,激活后菌密度最高能够达到3×109个/mL,原油乳化分散作用明显;在大于79℃的油藏区块中,激活效果和原油乳化效果普遍比小于79℃的油藏区块差。各区块中心井激活后的菌密度与乳化效果呈现出一定的正相关性,而表面张力与乳化效果无明显对应关系,好氧激活后的溶液表面张力由65 mN/m降至47 mN/m。好氧激活后形成的优势菌主要以地衣芽胞杆菌(Geobacillus)和热嗜淀粉芽胞杆菌属(Bacillus thermoamylovorans)为主。     

学生食堂餐厨垃圾中淀粉的生物利用菌株筛选

目的探索地衣芽胞杆菌、枯草芽胞杆菌和蜡样芽胞杆菌分解大学生食堂厨余中淀粉的能力,以筛选和研制餐厨垃圾生物降解的使用菌种。方法将各菌种接于淀粉酶试验培养基,培养后滴加碘溶液,观察透明圈,判定产淀粉酶能力;收集大学生食堂的厨余,观察三种细菌在不同接种量（5%、10%、15%、20%、25%）、不同接种时间（24 h、48 h、72 h）及不同菌株配伍方式下发酵淀粉的能力。结果地衣芽胞杆菌、枯草芽胞杆菌、蜡样芽胞杆菌都能产生淀粉酶,以地衣芽胞杆菌产生的淀粉酶较多,其次为枯草芽胞杆菌,蜡样芽胞杆菌较少,三种细菌分解厨余中淀粉的最佳接种量都为15%-20%,最佳发酵时间为48 h,枯草芽胞杆菌和地衣芽胞杆菌各7.5%的接种量混合配伍发酵效果最佳。结论可采用枯草芽胞杆菌和地衣芽胞杆菌各7.5%的接种量混合配伍发酵学生食堂的厨余中的淀粉。     

超低渗油藏微生物吞吐技术的矿场试验

【目的】通过对渭北低渗油藏内源微生物的研究,考察分离纯化的内源解烃菌产生表面活性剂和降解原油的能力、岩心驱替增油效率,同时验证其在超低渗油田单井吞吐矿场实验的应用效果,探讨微生物采油技术在超低渗油田提高采收率的工艺和可行性。【方法】采集超低渗油藏的油水样,应用油平板进行产表面活性剂解烃菌的分离,通过生理生化特性和16S r RNA基因序列分析对菌株进行种属鉴定,评价其油藏环境适应性,利用内源-外源功能微生物复配体系进行原油降解,在填砂管和岩心物模上进行驱油实验,将优化好的微生物复配体系应用于现场实施单井吞吐工艺的实验。【结果】从渭北某区块超低渗油藏的原油样品中分离得到一株铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa),命名为WB-001。该菌株可使发酵液的表面张力降至29.04 m N/m,使渭北原油蜡质含量降至8.48%。填砂管实验表明WB-001与外源枯草芽胞杆菌OPUS-HOB-001(Bacillus subtilis)复配后,驱油效率较单纯水驱提高了9.72%;岩心驱替实验较水驱提高12.54%。微生物单井吞吐措施后,平均日产油由措施前的0.42 t增加到0.89 t,累计增油44.47 t;原油降粘率为11.70%,降凝率为9.41%,采出水表面张力降低幅度为18.93%。【结论】通过详细的室内评估和成功的矿场实验,证明微生物采油技术在超低渗油藏有一定的应用可行性,并为后续规模化应用提供了理论基础和物质基础,为超低渗油田的高效精细开发探索一条新的途径。     

高温高盐油藏内源微生物室内模拟激活

胜利油田永8区块原油黏度高、水驱效果差,而且受该区块高温高盐油藏条件影响,常规化学驱技术难以有效提高水驱效率,针对此类问题,笔者开展内源微生物驱油技术研究。内源菌群分析表明,该区块油藏具备了产生物乳化剂、产甲烷气等几种主要功能菌群的条件。筛选并优化出能有效激活内源菌群的激活剂配方。经过激活后微生物的有效浓度达到10~8个/m L以上,产气压力达到0.088 MPa,最大产气速率达到0.2 L/(g·d)(以1 g激活剂计),柴油乳化指数达到100%,乳化效果48 h内稳定。室内物模驱油评价表明,注入该激活剂配方0.3 PV(孔隙体积)后可提高采收率9%以上,含水率由95.1%下降到81.4%,表现出了良好的应用潜力,为下一步在高温高盐油藏开展微生物驱提供了依据。     

内源微生物驱油及其对油藏微生物活动的影响

【目的】新疆油田六中区为典型水驱普通稠油油藏，水驱效果较差，油藏具有丰富的内源微生物，本研究通过分析内源微生物驱油对油藏微生物活动的影响，确定内源微生物驱油技术在该类油藏的应用潜力。【方法】采用高通量测序及分析化学技术，系统研究实施内源微生物驱油技术后油藏细菌群落结构组成、细菌总数和功能菌群的浓度以及采出液的流体性质，总结内源微生物驱油对油藏微生物活动的影响。【结果】现场试验注入激活剂和空气后，内源微生物被显著激活，细菌群落结构发生明显变化，细菌总数及功能菌群浓度普遍提高了2–3个数量级；各种内源微生物代谢活动显著增强，与地层流体相互作用后，原油明显被乳化，最终石油采收率提高5.2%。【结论】对于内源微生物较为丰富的水驱普通稠油油藏，内源微生物驱油技术对油藏微生物活动的影响显著，具有显著的技术优势和较大的应用潜力，微生物群落结构、功能菌群浓度及其相关代谢产物可以作为评价内源微生物驱油现场激活效果的重要指标，为其他内源微生物驱油现场试验提供技术参考。     

拮抗Bacillus subtilis的筛选及发酵条件对拮抗能力的影响

筛选了3株对大肠埃希菌具有拮抗活性的枯草芽胞杆菌,并对这3个菌株的拮抗能力最强的Bf菌株的发酵条件进行了初步研究。先将不同枯草芽胞杆菌菌株与株大肠埃希菌进行拮抗试验,根据抑菌率,筛选出对大肠埃希菌拮抗效果较好的枯草芽胞杆菌Bf。然后,在不同pH值、温度以及不同的培养时间下观察记录Bf对大肠埃希菌的拮抗作用。根据实验结果分析得到:筛选到的枯草芽胞杆菌在pH值为7.0,37℃下培养40 h后抑菌效果最好。     

中高温油藏微生物单井激活现场试验

针对胜利油田中高温油藏微生物群落结构特点,开展室内模拟试验,对耐高温激活剂进行筛选和性能评价。室内筛选出的激活剂适应温度范围在60℃以上,该激活体系与稠油作用后乳化分散效果显著,激活后菌密度从1.3×10~5个/mL增至3×10~7~4×10~7个/mL,气压达到0.05 MPa以上,原油乳化指数达到90%以上。根据室内模拟条件,对中高温油藏单井进行现场激活试验,开井后,总菌密度由激活前的10~4~10~5个/mL增至3.2×10~7个/mL,在有效期136 d内,单井累计增油超过180 t,含水率降低约15%。试验证明,室内筛选出的激活剂可以激活中高温油藏內源微生物,提高单井产油量,为实施中高温油藏微生物驱油提供理论依据和技术支持。     

温度对枯草芽胞杆菌α-淀粉酶活性的影响

目的：探讨温度对枯草芽胞杆菌分解淀粉的影响,找出α-淀粉酶活性区问。方法：设淀粉实验组及无淀粉对照组。接种枯草芽胞杆菌、大肠埃希菌4组16管,空白对照、实验管4组8管,15℃、25℃、37℃、40℃温箱连续培养,测量不同时间段内pH值及酶活值,观察颜色的变化。结果：在15℃～40℃下温度越高接种管颜色、pH值、透光度变化越明显。结论：温度对枯草芽胞杆菌。一淀粉酶活性影响较大,尤其在25℃～40℃区间内分解淀粉能力很强,这为选择微生物法解决淀粉导致的水源富营养化提供了依据．也是可行的。     

中高温油藏内源微生物厌氧激活

为了明确中高温油藏内源微生物厌氧激活产气的特点,在胜利油田选取了11个区块开展产气研究,温度范围分别为55~65℃、65~79℃、79~95℃。在模拟油藏条件下厌氧激活发现,低于79℃时,油藏内源微生物普遍能被激活并代谢产气;而高于79℃时,无明显甲烷气产生。利用不同碳源激活后发现,H_2/CO_2为碳源时,最大产甲烷速率可达1 500μmol/(g·d),显著高于乙酸钠和淀粉,这表明中高温油藏内产甲烷古菌以氢营养型为主。进一步对正理庄正南区块内源微生物群落组成研究,发现厌氧激活后古菌中Methanobacterium被激活成为优势菌群,有利于在油藏内代谢产甲烷气。厌氧激活前油水样中优势菌都是Pseudomonas,不同激活剂条件下优势菌群发生明显变化,H2/CO2和淀粉以激活Thermotoga为主,而乙酸钠则主要激活了油井中的Deferribacter。此外,该区块不同油井在相同激活条件下,其优势菌群趋向于一致,但油井和水井中优势菌群存在明显差异。通过对中高温油藏内源微生物厌氧激活的研究,为进一步提高微生物采油的效果奠定了基础。     

不同激活剂对油藏内源微生物群落结构的影响

目的筛选大庆油田聚驱后油藏内源微生物采油激活剂的类型。方法在动态物理模拟实验模型基础上,利用基于16S rDNA的基因克隆文库方法,分析了两组激活剂配方激活的微生物群落结构。结果配方1激活的微生物菌群主要有假单胞菌属(75%)、深海弯曲菌属(18%)、陶厄菌属(6%);配方2激活的微生物菌群主要有陶厄菌属(50%)、假单胞菌属(26%)、螺杆菌属(15%)、梭菌属(9%)。结论激活剂配方2更适合大庆油田聚驱后油藏内源微生物采油。     

混菌发酵生产γ-聚谷氨酸的工艺条件优化

采用谷氨酸棒杆菌S9114和枯草芽胞杆菌NTG-4在10 L自控发酵罐上进行混菌发酵,探索混菌发酵生产γ-聚谷氨酸的可行性并进行工艺优化。结果表明:温度、接种量、pH及溶氧对聚谷氨酸发酵有较大影响,发酵前期维持32℃,6 h提温至37℃变温控制,谷氨酸棒杆菌和枯草芽胞杆菌接种量分别为5%和0.5%,pH 7.0,溶氧20%最有利于γ-聚谷氨酸发酵,在此条件下发酵32 hγ-聚谷氨酸最高产量为38.3 g/L。     

枯草芽胞杆菌芽胞表面展示研究进展

枯草芽胞杆菌芽胞表面展示技术是把枯草芽胞杆菌作为芽胞表面展示的宿主来展示目的蛋白的一种技术。该技术不仅具备芽胞表面展示技术可展示分子量较大的目的蛋白、目的蛋白无需跨膜及芽胞的极强抗逆性等特点外,同时由于该技术的宿主菌--枯草芽胞杆菌的分子生物学信息研究得比较清楚、安全性高而被广泛应用。介绍了枯草芽胞杆菌表面展示近10年在生产疫苗和固定化酶方面的进展,并对如何提高表面展示目的蛋白的产量做了简要概述。     

鸡肠源芽胞杆菌的分离、鉴定和抗菌活性

从人工饲养的健康三黄肉鸡的盲肠和大肠中分离出10株芽胞杆菌,对其进行菌落形态观察、革兰染色、芽胞染色和生理生化特性鉴定,确定为枯草芽胞杆菌、地衣芽胞杆菌、蜡状芽胞杆菌、巨大芽胞杆菌、球形芽胞杆菌、短小芽胞杆菌、凝结芽胞杆菌。同时测定了它们对动物病原性大肠埃希菌和链球菌的抑菌活性。其中有9株芽胞杆菌对大肠埃希菌有抑制作用,8株芽胞杆菌对链球菌有抑制作用。结果表明芽胞杆菌分离株Y2、Y3、Y4、Y5、Y6、Y7、Y8具有作为益生菌开发的潜力。     

野生东亚钳蝎消化道可培养细菌的分离鉴定、耐药性及产消化酶活性

目的分离东亚钳蝎消化道中的可培养细菌,并研究其产消化酶活性和耐药性,探讨消化道细菌对东亚钳蝎消化食物的影响。方法野生东亚钳蝎采用传统细菌分离培养方法分离其消化道内可培养细菌,利用16S rRNA序列进行细菌的分子鉴定;利用平板透明圈法测定可培养细菌产淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶和纤维素酶等消化酶的活性;采用药敏纸片扩散法进行消化道可培养细菌的药敏试验。结果在东亚钳蝎消化道中共分离到4个属10种细菌,其中芽胞杆菌属7种,分别为蛋白水解芽胞杆菌、解淀粉芽胞杆菌、巨大芽胞杆菌、枯草芽胞杆菌、蜡样芽胞杆菌、婴儿芽胞杆菌和长形赖氨酸芽胞杆菌;葡萄球菌属、纤维微菌属和短波单胞菌属各1株,分别为松鼠葡萄球菌、纤维化纤维微细菌和泡囊短波单胞菌。对10种细菌的产消化酶活性分析表明,8种细菌有产消化酶活性,占细菌总数的80%;5种细菌有产蛋白酶活性,分别为蛋白水解芽胞杆菌、枯草芽胞杆菌、蜡样芽胞杆菌、松鼠葡萄球菌和纤维化纤维微细菌;7种细菌有产淀粉酶活性,分别为蛋白水解芽胞杆菌、解淀粉芽胞杆菌、巨大芽胞杆菌、枯草芽胞杆菌、蜡样芽胞杆菌、松鼠葡萄球菌和婴儿芽胞杆菌;未筛选到产纤维素酶和脂肪酶活性的细菌;蛋白水解芽胞杆菌、枯草芽胞杆菌、蜡样芽胞杆菌和松鼠葡萄球菌可同时产2种消化酶。在药敏试验中,8种细菌对多粘菌素B耐药,5种细菌对四环素耐药,3种细菌对万古霉素耐药。结论东亚钳蝎消化道中可培养细菌的组成相对单一,多数细菌有分泌淀粉酶和蛋白酶的功能,说明东亚钳蝎消化道中的细菌可能有协助其进行食物消化的功能。消化道细菌对抗生素多表现为敏感,推测其生存环境中抗生素的污染较少,同时在对东亚钳蝎人工饲养的场所进行消毒时,要谨慎选择抗生素,防止抗生素使用不当致使东亚钳蝎肠道菌群紊乱引起疾病。     

蛋白激发子PeaT1在枯草芽胞杆菌中的分泌表达及重组菌株提高小麦抗旱和促生的作用

PeaT1是从极细链格孢菌Alternaria tenuissima中分离的一种蛋白激发子,具有促进植物生长和诱导植物产生系统获得抗性的功能,为了实现peaT1基因在枯草芽胞杆菌Bacillus subtilis中的分泌表达,增加其应用途径,从枯草芽胞杆菌基因组DNA中分别扩增获得P43启动子和nprB基因的信号肽序列,并用SOE (Splicing by over lapping extension) 方法与peaT1基因连接,将连接产物克隆到大肠杆菌-枯草芽胞杆菌穿梭表达载体pHY300-PLK上,构建了重组表达载体pHY43N-peaT1。将重组载体转化枯草芽胞杆菌WB800菌株,SDS-PAGE和Western blotting分析证实,在NprB信号肽的引导下,枯草芽胞杆菌成功分泌表达了PeaT1蛋白。构建的重组菌株能够显著增强幼苗抗旱性,提高小麦株高。     

苏云金芽胞杆菌营养期杀虫蛋白基因vip3A在枯草芽胞杆菌中的表达

枯草芽胞杆菌Bacillus subtilis常被用于表达杀虫和抗菌蛋白.为了探讨苏云金芽胞杆菌B. thuringiensis营养期杀虫蛋白基因（vip3A）在枯草芽胞杆菌中的表达情况,促进杀虫防病工程菌构建,将枯草芽胞杆菌168菌株核糖体小亚基S4蛋白基因的启动子与苏云金芽胞杆菌WB7菌株vip3A基因的编码序列连接,插入大肠杆菌Escherichia coli与枯草芽胞杆菌穿梭载体pAD123,得到重组原核表达质粒pADpvip,将重组质粒转化枯草芽胞杆菌标准菌株168和分离自辣椒体内的生防内生枯草芽胞杆菌BS-2菌株中,获得工程菌株.SDS-PAGE分析表明在枯草芽胞杆菌168菌株的部分工程菌株中有约88 kDa大小的VIP条带,而BS-2的工程菌株中未见相应的条带,表明Vip3A蛋白仅在168菌株中表达.生物测定表明有5株168的工程菌株（168vip1-4,6）表现较高的杀虫活性,工程菌株发酵稀释液（约10⁷CFU/mL）处理的小白菜叶片饲喂斜纹夜蛾2龄幼虫72 h的杀虫效果可达87.64%~92.13%,但vip3A基因转入内生枯草芽胞杆菌BS-2中不表现杀虫作用.毒力测定表明168vip2菌株对斜纹夜蛾2龄幼虫72 h的LC₅₀为0.0194 mL/mL.这些结果为进一步研究基因在枯草芽胞杆菌中的表达构建杀虫防病工程菌打下了基础.     

枯草芽胞杆菌活菌制剂促进烧伤创面愈合的实验研究

目的　探讨枯草芽胞杆菌活菌制剂对烧伤创面愈合的影响。方法　通过大鼠深Ⅱ°烧伤模型,使用枯草芽胞杆菌活菌制剂,观察烧伤创面愈合过程中,成纤维细胞增殖周期的变化,以及测定羟脯氨酸（OHP）的含量,同时记录烧伤创面愈合时间,从而评价该制剂对烧伤创面愈合的影响。结果　应用枯草芽胞杆菌活菌制剂可促进成纤维细胞分裂、增殖,胶原含量提高,创面愈合时间明显缩短。结论　枯草芽胞杆菌活菌制剂具有促进烧伤创面愈合的作用。     

鲤肠道正常菌群的研究

本实验用稀释滴种的定量方法,对淡水养殖地中健康鲤肠道内的１０种菌群进行了定性、定量分析,并对结果进行统计学处理,得到鲤肠菌群的一些生理值。结果表明鲤肠道中需氧、兼性厌氧优势菌是气单胞菌和酵母菌,厌氧优势菌是拟杆菌。对不同时间、不同温度条件下同一养殖池中鲤肠道菌群的测定结果比较表明：葡萄球菌、假单胞菌差异显著（ｐ＜０．０５）,气单胞菌、大肠杆菌、需氧芽胞杆菌、酵母菌、乳酸杆菌、双歧杆菌、拟杆菌、梭状芽胞杆菌差异不显著（ｐ＞０．０５）,表明该８种菌群在鲤肠道中的菌数处于相对稳定状态,属于肠道正常菌群。     

抑制小麦赤霉病生防芽胞杆菌的筛选与相关研究

芽胞杆菌因其具有广谱的抑菌活性,在农业生产上常用于防控植物病害。本研究比较了五种芽胞杆菌发酵上清液对禾谷镰刀菌PH-1的抑制作用,结果发现枯草芽胞杆菌SCK6基本没有抑制效果,地衣芽胞杆菌BSK3和多粘芽胞杆菌BSK4有较弱的抑制作用,解淀粉芽胞杆菌TZ01和贝莱斯芽胞杆菌SH06抑制效果明显,其中贝莱斯芽胞杆菌SH06的抑制作用最为显著。进一步从不同培养基、培养时间及渗透剂对SH06菌株发酵条件进行了优化,结果表明在TB培养基中培养24 h并加入0. 5%TritonX-100的渗透剂时,发酵上清对禾谷镰刀菌PH-1的抑制效果最佳。本文为贝莱斯芽胞杆菌作为一种新型生防菌剂奠定了良好的应用基础,不仅丰富了生物防治菌种的菌库,也为小麦赤霉病的防治提供了一种新的选择,对未来菌种联合防治提供了新的方向。     

罗伊乳杆菌LE16益生特性的研究

目的研究罗伊乳杆菌LE16的益生特性。方法通过体外和动物实验,评价罗伊乳杆菌LE16的益生特性。结果该菌株对p H 2.5的强酸和0.3%高胆盐环境均有良好的耐受性。对引起肠道感染的几种病原菌均有不同程度的拮抗,尤其对枯草芽胞杆菌、伤寒沙门菌、单核细胞增生李斯特菌及蜡样芽胞杆菌的抑制作用最强。对肠道菌群正常和失调的小鼠均具有调节功能。结论罗伊乳杆菌LE16具有良好的益生性能,可作为益生菌菌株开发应用于食品和保健食品中。