飞燕草素通过Wnt/β-catenin信号通路抑制乳腺癌的机制研究

为研究飞燕草素对乳腺癌MDA-MB-231细胞Wnt/β-catenin信号通路的影响。免疫组化检测裸鼠乳腺肿瘤组织和肺组织转移瘤Ki-67及乳腺肿瘤组织蛋白水解酶超家族基质金属蛋白酶-7(matrix metallopeptidase 7,MMP-7)的表达水平;Western blot检测移植瘤Wnt/β-catenin通路β-联蛋白(β-catenin)、磷酸糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β,GSK-3β)及通路下游细胞周期相关蛋白cyclinD1、原癌基因c-myc和MMP-7的蛋白水平表达,体内外实验发现飞燕草素不仅能抑制裸鼠异种移植瘤生长及乳腺癌肿瘤组织和肺组织转移瘤Ki-67表达还可以明显降低乳腺癌MDA-MB-231细胞Wnt/β-catenin信号通路β-catenin和p-GSK-3β下游靶基因c-myc、cyclin D1和MMP-7蛋白的表达。本研究证实飞燕草素能通过抑制Wnt/β-catenin信号通路,发挥抑制乳腺癌的作用。     

DKK-1通过上调nm23表达抑制乳腺癌细胞迁移

Dickkopf-1(DKK-1)作为Wnt/β-连环蛋白(Wnt/β-catenin)经典信号传导通路的拮抗剂而受到关注.为了进一步阐明DKK-1在乳腺癌细胞迁移中的作用及其分子机制,应用我们建立的乳腺癌细胞MCF-7高转移倾向亚克隆LM-MCF-7细胞株,比较了DKK-1在不同转移能力的乳腺癌细胞株中表达水平及其与细胞迁移能力的关系.结果显示,DKK-1在LM-MCF-7细胞中表达明显下调;"伤口愈合"实验结果表明,在MCF-7细胞中,RNA干扰DKK-1可导致细胞迁移能力增强;相反,在LM-MCF-7细胞中过表达DKK-1则可抑制细胞的迁移.进一步研究结果显示,DKK-1为肿瘤转移抑制因子nm23的上游激活因子.因此,我们的研究结果表明,DKK-1表达水平下调导致nm23表达水平下调,解除了对乳腺癌细胞迁移的抑制作用,是LM-MCF-7乳腺癌细胞具有高迁移能力的原因之一;反之,与LM-MCF-7相比,DKK-1在MCF-7细胞中高表达,其通过上调nm23可抑制乳腺癌细胞迁移.这一发现对进一步揭示乳腺癌细胞转移的分子机制具有的重要意义.     

人巨细胞病毒感染通过Wnt/β-catenin通路抑制滋养细胞的增殖及侵袭

人巨细胞病毒(Human cytomegalovirus,HCMV)感染能够影响胎盘绒毛外滋养细胞的增殖、侵袭,进而参与病理妊娠的发生,但具体的机制尚未阐明.在真皮成纤维细胞中的研究表明,HCMV能够抑制Wnt/β-catenin通路.因此,为了观察HCMV感染通过Wnt/β-catenin通路抑制滋养细胞增殖及侵袭的作用,本研究培养了人绒毛外滋养细胞株HTR8/SVneo.研究分为对照组、HCMV组、HCMV+LiCl组细胞.对照组细胞用培养液处理,HCMV组细胞用含有3个感染复数(Multiplicity of infection,MOI)HCMV的培养液处理,HCMV+LiCl组细胞用含有3MOI HCMV及50mmol/L Wnt/β-catenin通路激活剂LiCl的培养液处理.48小时后,采用MTS法检测细胞增殖,采用Transwell检测细胞侵袭,采用western blot检测细胞周期蛋白D1(cyclin D1)、基质金属蛋白酶2(Matrix metalloproteinase 2,MMP2)、基质金属蛋白酶9(Matrix metalloproteinase 9,MMP9)、β-连环蛋白(β-catenin)和磷酸型糖原合酶激酶-3β(p-GSK-3β)的表达量.结果显示,与对照组细胞相比,HCMV组细胞的O.D490水平、侵袭数目及cyyclinD1、MMP2、MMP9、β-catenin、p-GSK-3β的表达量均降低(P＜0.05);与HCMV组细胞比较,HCMV+LiCl组细胞的O.D490水平、侵袭数目及cyclinD1、MMP2、MMP9、β-catenin、p-GSK-3β的表达量均增加(P＜0.05).以上结果表明,HCMV感染抑制人绒毛外滋养细胞的增殖和侵袭,且该作用与抑制Wnt/β-catenin通路有关.本研究阐明了HCMV感染通过抑制Wnt/β-catenin信号通路的激活而抑制滋养细胞增殖及侵袭的分子机制,为最终阐明HCMV先天感染的致病机理积累了有价值的研究资料.     

基于Wnt/β-catenin信号通路探讨miR-613对宫颈癌SiHa细胞增殖、迁移与侵袭的影响

摘要 目的：研究基于Wnt/β-catenin信号通路探讨微小RNA（miR）-613对宫颈癌SiHa细胞增殖、迁移与侵袭的影响。方法：体外培养宫颈癌SiHa细胞和正常宫颈上皮细胞H8,检测细胞中miR-613表达。根据转染miR-613 mimic浓度不同,将SiHa细胞分为0 μmol/L组,100 μmol/L和200 μmol/L组。MTT法检测细胞增殖情况,划痕实验检测细胞迁移能力,Transwell实验检测细胞侵袭能力。蛋白免疫印迹法检测miR-613表达对Wnt/β-catenin信号通路蛋白β-catenin、Vimentin、E-cadherin和MMP9表达的影响。结果：宫颈癌SiHa细胞中miR-613表达水平均显著低于正常宫颈上皮细胞H8,差异有统计学意义(P<0.05)。转染miR-613 mimic后,100 μmol/L、200 μmol/L 组SiHa细胞中miR-613表达水平显著上调,并且具有浓度依赖性(P<0.05)。与0 μmol/L组相比,100 μmol/L、200 μmol/L组的SiHa细胞增殖,迁移,侵袭能力均明显下降,并且具有浓度依赖性(P<0.05)。免疫印迹结果,与0 μmol/L组相比,100 μmol/L、200 μmol/L各浓度组的SiHa细胞Wnt/β-catenin信号通路蛋白β-catenin、Vimentin和MMP9表达显著下调,E-cadherin表达显著上调,并且具有浓度依赖性(P<0.05)。结论：miR-613能通过抑制Wnt/β-catenin信号通路抑制人宫颈癌细胞系SiHa细胞的增殖,迁移和侵袭。     

NUAK1增加乳腺癌细胞的趋化和粘附能力

本课题组先前已证明NUAK1/ARK5可通过影响F-actin的聚合从而促进乳腺癌细胞的侵袭和转移. 但是NUAK1是否还通过其它机制影响乳腺癌的侵袭和转移尚有待于探讨.本文证明NUAK1还可以影响乳腺癌细胞趋化、粘附能力从而在乳腺癌细胞侵袭转移中起重要作用. 应用化学合成的小RNA干扰质粒转染到乳腺癌细胞系MDA MB 231中,用免疫印迹技术检测NUAK1蛋白的表达情况. 结果显示,在敲除NUAK1的细胞（siNUAK1/MDA231）中, NUAK1蛋白表达水平明显降低;趋化运动实验结果显示, siNUAK1/MDA231细胞的趋化运动能力比未处理组（Scr/MDA231）细胞明显降低;细胞粘附实验结果显示, EGF刺激5 min、15 min后,siNUAK1/MDA231细胞比Scr/MDA231细胞粘附细胞数量均明显减少;免疫印迹技术检测integrin β1磷酸化验证NUAK1影响乳腺癌细胞粘附的机制. 结果显示,siNUAK1/MDA231细胞内integrin β1磷酸化比Scr/MDA231细胞不同程度降低. 上述结果表明, NUAK1通过磷酸化integrin β1促进乳腺癌细胞与纤维粘连蛋白的粘附,从而促进乳腺癌的侵袭和转移.     

阳性表达表皮钙粘蛋白增加G0/G1期人乳腺癌细胞比例及其分子机制

表皮钙粘蛋白（E-cadherin）阴性的乳腺癌细胞株MDA-MB-231和MDA-MB-435转染野生型表皮钙粘蛋白基因,通过流式细胞仪测量细胞周期发现表皮钙粘蛋白阳性细胞生长变慢,更多细胞停滞在G0/G1期,蛋白质印迹证实由G0/G1期进入S期的重要调控分子细胞周期蛋白-D1（cyclin D1）下降了,并发现表皮钙粘蛋白还能降低直接激活细胞周期蛋白-D1基因转录的β-连环蛋白的蛋白质浓度.蛋白激酶B（PKB）能通过抑制糖原合成激酶-3β(GSK-3β)的活性来抑制β-连环蛋白降解,并在乳腺癌高转移细胞株中普遍过表达,其表达同样受到了表皮钙粘蛋白的抑制.并且在表皮钙粘蛋白阳性细胞中,作为PKB上游信号分子并能激活PKB的粘着斑激酶 (FAK) 和整联蛋白相关激酶(ILK)蛋白量也发生下降,能抑制PKB激活的PTEN蛋白量却增加了.结果显示,表皮钙粘蛋白能通过降低乳腺癌细胞中的PKB蛋白浓度,并通过上游信号分子抑制PKB的激活,进而降低PKB对β-连环蛋白降解的抑制作用,导致β-连环蛋白直接调控的靶基因细胞周期蛋白D1的表达量下降,引起更多的细胞停止在G0/G1期.     

OPN对卵巢癌Hey细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响

目的:探讨骨桥蛋白(Osteopontin,OPN)对卵巢癌Hey细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响及其可能涉及的分子机制。方法:选择卵巢癌细胞株Hey、HO8910、A2780和正常卵巢上皮细胞IOSE80,采用Western blot检测OPN蛋白的表达情况。对OPN表达量相对较高的Hey细胞株的OPN基因敲减或过表达,运用CCK-8、平板克隆实验、细胞划痕、Transwell侵袭实验等方法研究OPN对细胞增殖、迁移及侵袭能力的影响,采用Western blot检测Wnt/β-catenin通路相关蛋白β-catenin、CyclinD1、c-myc的表达情况。结果:OPN在卵巢癌细胞株Hey、HO8910、A2780内均有表达,且表达量均高于正常卵巢上皮细胞IOSE80。si RNA-OPN转染卵巢癌Hey细胞沉默OPN表达,CCK-8和平板克隆实验显示沉默OPN能够降低Hey细胞的增殖能力,划痕实验和Transwell侵袭实验显示下调OPN可降低Hey细胞的迁移和侵袭能力,Wnt/β-catenin通路相关蛋白β-catenin、CyclinD1、c-myc表达下降。ex-OPN转染Hey细胞使OPN表达升高,与对照组相比,OPN过表达能够增强Hey细胞的增殖、迁移和侵袭能力,并且Wnt/β-catenin通路相关蛋白β-catenin、CyclinD1、c-myc表达升高。结论:OPN能够促进卵巢癌细胞的增殖、迁移及侵袭能力,该作用可能通过促进Wnt/β-catenin信号通路实现。     

红景天苷通过Wnt/β-catenin信号通路影响小鼠骨髓间充质干细胞向神经元细胞定向分化

目的:以小鼠骨髓间充质干细胞系D1细胞为研究对象,探讨Wnt/β-catenin信号通路介导的红景天苷诱导D1细胞向神经细胞的定向分化。方法:实验分为对照组(D/F12完全培养基)和红景天苷诱导组(100μg/mL+D/F12完全培养基).将细胞分别诱导12、24、48和72 h后,采用细胞免疫荧光化学染色方法检测β-catenin和Gsk-3β的阳性细胞率。利用红景天苷分别诱导MSCs 1,2,8,12,24,48和72 h后,利用实时PCR技术检测Wnt/β-catenin信号通路的关键信号分子wnt3a、Axin2、Lrp6和Gsk-3βmRNA的表达;采用Westernblot方法分析D1细胞诱导12、24、48和72 h后,β-catenin和Gsk-3β蛋白的表达;运用Wnt/β-catenin信号通路特异性阻断剂DKK1阻断Wnt/β-catenin信号通路,Western blot方法分析红景天苷对β-catenin和NSE蛋白表达的影响。结果:红景天苷诱导24 h时β-catenin的阳性率可达55.76%,与其他组和对照组比较差异具有统计学意义(P<0.01),诱导24 h后Gsk-3β的阳性率与其他时间和对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。实时PCR检测结果显示,红景天苷诱导MSCs不同时间能促进Wnt/β-catenin信号通路中关键信号分子Wnt3a、Ax-in2、Lrp6和Gsk-3βmRNA的表达,诱导不同时间Wnt3a、Axin2、Lrp6和Gsk-3βmRNA的表达不尽相同。Westernblot结果表明,红景天苷诱导D1细胞12 h和24 h时β-catenin蛋白的表达明显上调,且与其他组比较差异具有统计学意义(P<0.05);随着作用时间的延长,Gsk-3β蛋白的表达增加且差异具有统计学意义(P<0.05),阻断Wnt/β-catenin信号通路后,β-catenin和NSE蛋白的表达水平明显下调。结论:红景天苷能诱导D1细胞定向分化为神经元样细胞,红景天苷通过激活Wnt/β-catenin信号通路实现其诱导MSCs向神经细胞定向分化。     

间充质干细胞释放 Dkk-1 抑制乳腺癌细胞 Wnt/β-catenin 途径的实验研究

研究表明,间充质干细胞具有向肿瘤细胞定向迁移并且抑制肿瘤细胞的特性,然而其分子机理目前尚不清楚.为了探讨间充质干细胞抑制肿瘤细胞作用的分子机制,应用BMMS-03人间充质干细胞的条件培养液作用于MCF-7乳腺癌细胞,通过软琼脂克隆形成实验、MTT实验、免疫印迹和免疫荧光染色等技术观察细胞克隆形成、增殖和基因表达的变化.结果显示:在BMMS-03细胞条件培养液作用下,MCF-7细胞的克隆形成和增殖受到了明显的抑制,β-catenin及其下游靶蛋白c-Myc、Bcl-2、PCNA和survivin的表达被明显下调,MCF-7细胞浆和细胞核内β-catenin的表达被明显抑制.BMMS-03细胞中Dkk-1的表达水平与MCF-7细胞相比较高.利用抗Dkk-1的抗体中和BMMS-03细胞条件培养液中的Dkk-1后,可明显拮抗BMMS-03细胞条件培养液对MCF-7细胞中β-catenin及c-Myc表达的抑制作用,基因转染使MCF-7细胞过表达Dkk-1后,MCF-7细胞的β-catenin及c-Myc的表达明显下调.同样经基因转染使BMMS-03细胞过表达Dkk-1后,其条件培养液可进一步下调MCF-7细胞β-catenin及c-Myc的表达.上述结果表明,间充质干细胞BMMS-03对乳腺癌MCF-7细胞的恶性表型具有明显抑制作用,其分子机制与间充质干细胞释放Dkk-1抑制乳腺癌细胞Wnt/β-catenin信号途径有关.     

二十二碳六烯酸增强MDA-MB-231细胞对5-FU敏感性的研究

目的:探讨二十二碳六烯酸(DHA)对5-FU诱导乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖与凋亡的作用及对Wnt/1β-Catenin信号传导通路的影响.方法:采用四甲基偶氮唑蓝(MTT),测定DHA对5-FU诱导乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖活性的作用;应用流式细胞仪检测细胞周期和凋亡率;RT-PCR检测MDA-MB-231细胞β-catenin、GSK-3β基因的表达情况;Western blot检测MDA-MB-231细胞3-catenin、GSK-3β、磷酸化GSK-3β(Ser9)蛋白的表达情况;细胞免疫组化染色观察DHA及DHA联合Licl对3-Catenin蛋白细胞内表达及定位的影响.结果:20 μg/ml、40μg/ml的DHA分别与5-FU联合应用,可增强5-FU对MDA-MB-231细胞增殖抑制作用.DHA(20 μg/ml)能促进5-FU增强MDA-MB-231细胞G0/G1期阻滞作用、降低细胞增殖指数及诱导细胞的凋亡.DHA作用于MDA-MB-231细胞后,β-catenin基因及蛋白表达水平下降(P＜0.05)、GSK-3β的基因及蛋白表达水平无明显变化(P＞0.05),磷酸化GSK-3β(Ser9)蛋白表达水平下降(P＜o.05).结论:DHA能增强5-FU对MDA-MB-231细胞增殖抑制和诱导凋亡,起化疗增敏作用,可能与其通过抑制GSK-3β磷酸化来阻断Wnt/β-Catenin信号通路有关.     

miR-449a对人乳腺癌细胞MCF-7增殖及迁移能力的影响

目的：通过敲低微小RNA （microRNA,miRNA）-449a的方法研究miR-449a对人乳腺癌细胞MCF-7的增殖和迁移能力的影响。方法：采用miRNA芯片在乳腺癌细胞MCF-7和人正常乳腺细胞MCF-10A筛选具有表达差异的miRNA;化学合成法制备miR-449a的抑制剂（inhibitor）,转染后经real-time PCR验证表达的变化;细胞增殖CCK-8实验对转染后细胞增殖能力进行检测;划痕实验检测细胞转移能力,transwell小室实验检测细胞侵袭的改变;蛋白免疫印迹法（Western blot）实验对MCF-7细胞增殖和迁移相关的β-catenin和E-cadherin蛋白进行检测;通过生物信息学软件预测miR-449a潜在靶基因为Notch 1,荧光素酶实验检测Notch 1是miR-449a的靶基因。结果：分别收集MCF-7和MCF-10A细胞,芯片结果显示miR-449a在MCF-7细胞的表达水平显著高于MCF-10A;本研究将细胞分为未处理组（Mock组）,阴性对照组（negative control组,NC组）和处理组,通过收集不同组MCF-7细胞进行试验,CCK-8结果显示miR-449a下调后MCF-7细胞增殖能力显著降低;划痕实验结果显示miR-449a表达降低导致MCF-7细胞转移能力降低;transwell实验结果显示MCF-7细胞侵袭受到抑制;Western blot结果发现miR-449a敲低后β-catenin表达降低,E-cadherin表达增加;荧光素酶试验结果显示,miR-449a能够显著降低Notch 1-3'-UTR质粒的荧光素活性（P<0.01）。结论：在乳腺癌细胞MCF-7中敲低miR-449a能够显著抑制癌细胞增殖和迁移,而这一变化可能通过降低Notch 1蛋白表达实现的。     

DLX1过表达对骨肉瘤细胞MG63迁移、侵袭、凋亡和增殖的影响

前期经基因芯片筛选发现,同源盒基因1(distal-less homeobox 1,DLX1)低表达是导致骨肉瘤形成的关键基因。该研究在此基础上,拟通过过表达DLX1探讨其对骨肉瘤细胞MG63迁移和侵袭等生物学特征的影响,并初步揭示其作用途径。采用含DLX1基因的重组腺病毒Ad DLX1(adenovirus distal-less homeobox 1)和空载腺病毒Ad RFP(adenovirus red fl uorescence protein)分别感染人骨肉瘤细胞MG63,观察细胞荧光表达情况,并用RT-PCR和Western blot验证DLX1表达水平;Transwell实验检测细胞迁移和侵袭能力;DAPI染色和流式细胞术检测细胞凋亡水平;CCK-8检测细胞增殖能力;RT-PCR和Western blot检测Wnt/β-catenin信号通路中β-catenin的表达。结果显示,与对照组(Ad RFP感染组)相比,Ad DLX1能显著增加MG63细胞中DLX1的表达,并导致细胞迁移和侵袭能力下降,但细胞增殖和凋亡情况无明显改变。DLX1过表达还可以上调Wnt/β-catenin信号通路中β-catenin的表达。该研究表明,DLX1可通过Wnt/β-catenin信号通路抑制骨肉瘤细胞MG63的迁移和侵袭。     

miR-130a靶向G3BP2促进乳腺癌侵袭

目的探讨基因预测软件Targetscan预测到的微小RNA-130a如何调节GTP酶激活蛋白SH3功能区结合蛋白2(GTPase activating protein SH3 binding protein 2,G3BP2)的表达,进而影响乳腺癌细胞的侵袭。方法应用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测正常乳腺上皮及乳腺癌细胞系中miR-130a的表达水平;蛋白质印迹法(Western blot)检测改变miR-130a表达水平对乳腺癌细胞株MCF-7和MDA-MB-231中G3BP2及上皮间质转化(epithelial-to-mesenchymal transition,EMT)相关蛋白的影响;双荧光素酶报告基因实验检测miR-130a是否能与G3BP2靶向结合,以及Transwell侵袭实验检测miR-130a表达水平与MCF-7和MDA-MB-231细胞侵袭能力的关系。结果 qRT-PCR显示miR-130a表达量在高侵袭乳腺癌细胞株明显高于低侵袭乳腺癌细胞株MCF-7及正常乳腺上皮细胞;Western blot检测显示,miR-130a负向调控G3BP2的表达并促进乳腺癌细胞发生EMT;qRT-PCR显示改变乳腺癌细胞内miR-130a表达后G3BP2 mRNA基本没有变化;双荧光素酶报告基因结果显示,miR-130a能与G3BP2 mRNA的3’UTR结合;Transwell侵袭实验显示,miR-130a促进乳腺癌细胞的体外侵袭。结论 miR-130a通过靶向结合G3BP2 mRNA的3’UTR区,在翻译水平抑制G3BP2表达后促进乳腺癌细胞发生EMT,从而促进乳腺癌细胞的侵袭。     

Wnt/β-catenin信号通路对细胞凋亡和坏死的调控研究进展

Wnt信号通路是一条与细胞增殖分化和机体平衡密切相关且高度保守的信号通路,主要包括Wnt/β-catenin信号通路、Wnt-Ca2+信号通路和平面细胞极性信号通路。其中,以经典Wnt/β-catenin信号炎性反应和细胞命运方面的研究最为深入。现已证实,Wnt/β-catenin信号对细胞命运的调控作用具有两面性,不仅通过调节Survivin、Cyclin、C-myc等基因的表达抑制一些肿瘤细胞凋亡,而且可通过上调促凋亡蛋白BIM、Bax和下调抗凋亡蛋白Mcl-1、Bcl-xl的表达量来促进细胞凋亡。同时,该信号还可以通过抑制某些炎性因子的过度分泌,并下调活性氧(reactive oxygen species,ROS)的含量及坏死相关蛋白PARP-1的表达来抑制细胞坏死。该文对Wnt/β-catenin信号对细胞凋亡和坏死的调控研究进展进行综述。     

lncRNA CCAT2调控SIRT1蛋白表达激活Wnt/β-catenin通路影响非小细胞肺癌细胞增殖和转移

该文旨在分析长链非编码RNA(lncRNA) CCAT2通过调控SIRT1蛋白的表达激活Wnt/β-catenin信号通路进而影响非小细胞肺癌细胞增殖和转移的机制。采用qRT-PCR检测肺癌组织及肺癌细胞株中lncRNA CCAT2的表达。利用卡方检验分析lncRNA CCAT2表达与肺癌患者临床病理特征的关系。CCK-8实验、划痕实验及Transwell实验观察敲低lncRNA CCAT2表达对肺癌细胞增殖、迁移及浸润能力的影响。Western blot检测敲低lncRNA CCAT2表达对H1975细胞株中SIRT1蛋白及Wnt/β-catenin信号通路蛋白表达的影响;以及敲低或过表达SIRT1对Wnt/β-catenin信号通路蛋白表达的影响。利用RNA免疫共沉淀(RIP)及RNA pull-down实验验证lncRNA CCAT2与SIRT1之间的相互作用。该研究得出,癌组织及肺癌细胞株中lncRNA CCAT2表达显著较高(P0.05),敲低lncRNA CCAT2表达能够抑制H1975细胞的增殖、迁移及浸润。敲低lncRNA CCAT2表达后,H1975细胞株中SIRT1、β-catenin、Cyclin D1、myc蛋白的表达降低;敲低SIRT1后,细胞核β-catenin蛋白、Cyclin D1、myc蛋白的表达均降低。与非特异性抗体比较,SIRT1抗体呈明显的lncRNA CCAT2富集;lncRNA CCAT2的截短突变组细胞中SIRT1相对表达量明显低于lncRNA CCAT2组。lncRNA CCAT2通过调控SIRT1蛋白表达激活Wnt/β-catenin信号通路进而促进肺癌细胞增殖、迁移及浸润,有望成为新的肿瘤标志物。     

β-catenin基因在人骨肉瘤MG63细胞系的表达变化

目的:观察分析β-catenin基因在人骨肉瘤MG63细胞系的表达变化。方法:培养MG63细胞株,用不同浓度的Wnt3a蛋白或相同浓度、不同时间段的Wnt3a蛋白刺激液MG63细胞生长,用FQ-PCR在m RNA水平检测β-catenin在MG63细胞系的表达变化。培养MG63细胞株,用相同浓度的Wnt3a蛋白刺激,比较刺激组与空白对照组的细胞数目的差别。结果:在细胞生长的第0,1天两组的MG63细胞数量对比没有统计学差异(P0.05);而在第2,3,4天对照组细胞增殖速度较刺激组缓缓,经比较(t=4.109,3.892,5.215,均P0.05)。β-catenin基因表达不会因为Wnt3a的浓度增加而增加。100 ng/m L的Wnt3a蛋白刺激β-catenin基因表达最高,其他几个浓度的β-catenin基因表达对比没有统计学差异(P0.05)。在100 ng/m L的Wnt3a蛋白刺激下,β-catenin基因表达会随时间延长而增加,6 h时β-catenin基因表达最高(P0.05),随后β-catenin基因表达则没有统计学差异(P0.005)。结论:Wnt蛋白对MG63细胞有正向增加增殖作用。激活Wnt/β-catenin信号通路能促进MG63的细胞增殖。     

Wnt/β-catenin信号通路与肝癌

肝细胞癌是常见的恶性肿瘤,其发病机制尚未完全明确。Wnt信号通路与人体内多种病理生理过程相关,其中肝癌的发生、发展可能与经典的Wnt/β-catenin信号通路密切相关。Wnt/β-catein信号通路通过表达癌症相关基因、激活肝星状细胞、调控肝干细胞行为、促进肝癌细胞侵袭转移等方式调控肝癌的发生、发展。Wnt/β-catein信号通路在肝癌发生、发展中的作用有望为肝癌研究提供新的思路。     

DKK4通过负调控Wnt/β-catenin信号通路抑制乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭

Wnt信号通路在机体多种生理过程中均具有重要作用,已证明有多种蛋白质参与其调节,包括DKK(Dickkopf)家族成员。然而,DKK4在乳腺癌中的生物学功能和分子机制尚不清楚。本研究通过在线数据库TCGA(the cancer genome atlas)和UALCAN(ualcan.path.uab.edu/)分析发现,DKK4在乳腺癌中的表达与其甲基化程度负相关,并影响其肿瘤分期和患者生存率。MethHC数据库分析显示,DKK4在多数乳腺癌组织中的表达低于癌旁组织。RT-PCR检测发现,DKK4在8种人乳腺癌细胞株中不表达或低表达,在2种人正常乳腺细胞中表达;qPCR分析发现,13对组织标本中有11对癌组织的表达低于癌旁组织(P0.0001)。构建过表达DKK4的人乳腺癌细胞株MCF7和YCCB1,克隆形成的结果显示,MCF7和YCCB1稳定细胞株形成的细胞集落数量分别为对照组的28.66%和37.26%,增殖能力明显低于对照组细胞(P0.001);Transwell实验结果显示,细胞迁移能力减弱(590 vs. 2 052;1 310 vs. 5 137,P0.001);侵袭能力也明显减弱(220 vs. 872; 2 532 vs. 5 089;P0.001)。流式细胞仪分析发现,DKK4可将乳腺癌细胞周期阻滞于G_0/G_1期((57.06±0.64)%vs.(50.13±1.08)%;(51.94±0.93)%vs.(31.00±1.03)%,P0.001),细胞凋亡率明显增高((31.55±0.77)%vs.(9.85±0.58)%;(28.19±0.99)%vs.(17.92±0.58)%,P0.001)。进一步采用Western印迹检测结果显示,DKK4能够使细胞周期调控蛋白P53、P27、P21和细胞凋亡因子胱天蛋白酶-3、胱天蛋白酶-7、胱天蛋白酶-9表达上调。Western印迹检测过表达DKK4对Wnt/β-catenin信号通路的影响。结果表明,细胞周期蛋白D1(cyclin D1)、C-Myc蛋白、环氧合酶2 (cyclooxygenase 2,Cox 2)、C-Jun蛋白、磷酸化应激活化蛋白激酶(p-JNK)和活化的β-联蛋白(activeβ-catenin)等的表达下调,而上皮型钙黏着蛋白(E-Cadherin)表达上调。综上所述,DKK4通过负调控Wnt/β-catenin信号通路抑制乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭,阻滞细胞周期,并促进其凋亡。     

SB-431542抑制乳腺癌细胞BT-549的增殖和侵袭及其机理研究

肿瘤转移是导致肿瘤患者死亡的最主要原因,TGF-β超家族成员Nodal分子被证实参与肿瘤细胞的增殖和转移,因而基于Nodal信号为靶标开展抗肿瘤研究成为可能。该研究应用Western blot检测乳腺癌细胞株BT-549、T-47D、MCF-7、SK-BR-3和MDA—MB-231中的Nodal和基质金属蛋白酶-2（matrix metalloproteinase-2,MMP-2）的表达水平,发现它们在BT-549细胞中表达量最高。然后采用不同浓度_Nodal信号抑制剂SB．431542（1-50μmol／L）处理BT-549细胞48h,利用MTT法揭示20～50gmol／L的SB-431542抑制该细胞增殖。进一步利用细胞划痕和Transwell实验证明,10μmol／L的SB-431542可抑制乳腺癌细胞的迁移和侵袭。最后,通过明胶酶谱和Westernblot显示,10～30gmol／L的sB．431542可剂量依赖性地抑制MMP-2的表达和活性。上述结果说明,SB-431542通过阻断Nodal信号通路可效抑制乳腺癌细胞BT-549的增殖、迁移和侵袭,其作用机制可能与降低MMP-2的表达和活性有关。     

Wnt/β-catenin信号通路对重度子痫前期患者胎盘滋养层细胞侵袭和增殖的影响

为了阐明Wnt/β-catenin信号通路在子痫前期发生发展中的作用机制,本研究应用RT-PCR检测了子痫前期和正常妊娠妇女胎盘中的Wnt1、β-catenin和cyclinD1的mRNA水平。通过Western blotting检测了Wnt1、β-catenin、Dickkopf-1 (DKK1)和糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)蛋白的表达水平。使用免疫组化定位胎盘中Wnt1、β-catenin和DKK1蛋白的表达。研究显示,与对照组正常胎盘相比,重度子痫前期胎盘中Wnt1、β-catenin和cyclinD1的mRNA表达水平显著降低。Western blotting结果显示,对照组Wnt1、β-catenin和GSK-3β蛋白表达水平显著升高,而DKK1表达水平显著降低。此外,与对照组相比,子痫前期组胎盘中Wnt1和β-catenin的染色强度较弱,而DKK1的染色强度明显增强。说明子痫前期患者胎盘中Wnt/β-catenin信号通路及其下游靶基因被抑制,导致滋养层的侵袭和增殖能力降低,从而促进了子痫前期的发生发展。