MiR-206与ANXA2的3′UTR靶向结合抑制乳腺癌侵袭

膜联蛋白A2（annexin A2,ANXA2）可促进人结直肠癌的侵袭和迁移。然而,ANXA2在乳腺癌中的作用以及调节机制尚缺乏系统的研究。本研究旨在探讨微小RNA-206（microRNA-206,miR-206）如何调节ANXA2基因的表达,进而影响乳腺癌的侵袭。通过基因预测软件TargetScan (TargetScan V5.2)找到与ANXA2的3′UTR区互补结合的miR-206。运用实时定量 PCR（qRT-PCR）检测不同乳腺癌细胞系中miR-206的表达水平,发现低侵袭性乳腺癌MCF-7细胞株miR-206 表达量明显高于高侵袭性乳腺癌细胞株MDA-231、MDA-435和T47D。运用转染技术将 miR-206 质粒及miR-206 抑制剂转入乳腺癌细胞系MDA-231后,qRT-PCR检测转染后各组细胞中miR-206的表达情况,结果显示转染成功。用Western印迹法检测各组细胞中ANXA2的表达情况,结果显示,miR-206负向调控ANXA2蛋白的表达。 qRT-PCR显示,过表达乳腺癌细胞内miR-206 后,ANXA2 mRNA基本没有变化。结果显示,miR-206是在翻译水平上影响ANXA2蛋白的表达。荧光素酶实验显示：miR-206能特异性地与ANXA2 mRNA的3′UTR结合,抑制其荧光素酶活性。Transwell侵袭实验检测各组细胞的侵袭能力。结果显示,过表达miR-206后,乳腺癌细胞体外侵袭能力明显减弱。综上所述,miR-206 通过靶向结合癌基因ANXA2 mRNA的3′UTR区,抑制ANXA2蛋白翻译,从而抑制了乳腺癌细胞的侵袭。因此,miR-206有望成为抑制乳腺癌侵袭与治疗乳腺癌的新靶点和生物学标记物。     

MiR-150-5p通过靶向调控Rab1A抑制乳腺癌细胞MDA-231的上皮-间质转化

先前的研究表明,miR-150-5p发挥抑癌基因的作用,调控肿瘤细胞的侵袭与转移。然而,关于其在乳腺癌细胞侵袭与转移中的机制尚不明确。本实验旨在研究miR-150-5p负向调控Rab1A在乳腺癌细胞上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）中的作用。双荧光素酶的结果显示,miR-150-5p可负向调控Rab1A。荧光定量PCR (qRT-PCR) 结果显示,miR-150-5p在乳腺癌细胞MCF-7及MDA-MB-231（MDA-231）中的表达水平明显低于正常乳腺上皮细胞MCF-10A; 在MDA-231中过表达miR-150-5p后,qRT-PCR结果显示,Rab1A mRNA的表达水平明显降低。Western印迹结果显示,过表达miR-150-5p后,miR-150-5p组细胞中的Rab1A、波形蛋白(vimentin)及N-钙黏着蛋白(N-cadherin)的表达水平相对于对照组（NC）细胞明显降低,而E-钙黏着蛋白(E-cadherin)的表达水平明显增加。Transwell侵袭和划痕实验显示,与miR-150-5p+Con组细胞相比,miR-150-5p+Rab1A组细胞的侵袭和迁移能力明显增加。qRT-PCR结果显示,miR-150-5p+Rab1A组细胞的Rab1A mRNA表达水平明显增加。Western印迹结果显示,miR-150-5p+Rab1A组细胞中的波形蛋白、N-钙黏着蛋白表达水平明显增加, 而E-钙黏着蛋白表达明显降低,过表达Rab1A后显著逆转了miR-150-5p对EMT的影响。综上所述,miR-150-5p可以通过负向调控Rab1A抑制EMT,进而抑制乳腺癌细胞的侵袭和迁移。     

EBP50通过Wnt3a/β-catenin信号通路抑制乳腺癌细胞的侵袭和转移

EBP50通过抑制LIMK/cofilin信号通路和PI3K/Akt/m TOR/MMP信号通路抑制乳腺癌细胞的侵袭和转移。然而,EBP50是否可以通过其他机制抑制乳腺癌细胞的侵袭和转移尚未可知。本研究发现,EBP50能通过Wnt3a/β-catenin信号通路影响乳腺癌细胞的侵袭和转移。Western印迹结果显示,EBP50在低转移细胞株MCF-7和正常乳腺细胞株MCF-10A中高表达,而在高转移细胞株MDA-MB-231低表达。采用RNAi技术将小RNA质粒瞬时转染乳腺癌细胞株MCF-7,同时将质粒pc DNA3.1-EBP50转入乳腺癌细胞株MDA-MB-231。Western印迹结果显示,Si EBP50/MCF-7细胞组的EBP50表达水平明显下调,MDA231/EBP50细胞组的EBP50表达水平明显上调。Transwell侵袭实验和划痕实验结果显示,用Wnt3a刺激后,Si EBP50/MCF-7细胞组体外迁移和侵袭能力明显增强,MDA231/EBP50细胞组体外迁移和侵袭能力明显减弱。Western印迹结果显示,与未用Wnt3a或同时用Wnt3a和抑制剂Dkk1刺激的相比,Si EBP50/MCF-7细胞组上皮-钙粘蛋白(Ecadherin)下调,波形蛋白(vimentin)上调,细胞核中β-联蛋白(β-catenin)的表达水平升高,而MDA231/EBP50细胞组上皮-钙粘蛋白上调,波形蛋白下调,细胞核中β-联蛋白表达下降。上述结果表明,EBP50通过Wnt3a/β-catenin信号通路影响β-联蛋白的转核,抑制EMT的发生,进而抑制乳腺癌细胞的侵袭和转移。     

基于生物信息学分析研究miR-182-5p通过靶向调控EP300促进乳腺癌细胞的侵袭和转移

近期研究表明,miR-182-5p对多种癌症的侵袭和转移具有重要作用,但其在乳腺癌侵袭转移中的研究相对较少。本研究通过网上在线microRNA分析工具下载乳腺癌组织及正常乳腺组织表达比较的数据集,分析发现在GSE4589、GSE38167、GSE61438等3个数据库中,在乳腺癌组织中存在26个相同的microRNA,其中8个上调,而我们实验验证发现hsa-miR-182在8例病理组织中的表达上调差异最显著(P=0.001),选定目的基因hsa-miR-182;qRT-PCR检测细胞中miR-182-5p的表达,结果显示,与MCF-10A相比,miR-182-5p在MDA-MB-231、T47D、MDA-MB-453、MCF-7中表达上调(P<0.05);转染miR-182-5p干扰质粒,qRT-PCR检测细胞中miR-182-5p的表达情况。结果显示,miR-182-5p表达显著降低(P=0.003),提示转染成功;Transwell侵袭结果显示,MDAMB-231细胞敲低miR-182-5p,与对照组相比,体外侵袭能力明显降低(P=0.002);Western印迹检测转染miR-182-5p干扰质粒时,MDA-MB-231中上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)相关标志物的表达情况,结果显示,与对照组相比,敲低miR-182-5p使细胞中上皮-钙黏着蛋白(E-cadherin)表达上调,神经-钙黏着蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(vimentin)表达下调。为研究探讨miR-182-5p的靶蛋白,采用在线预测软件预测可能与miR-182-5p结合的靶蛋白,cytoscape构建蛋白质互作网络图并筛选出hub基因;双荧光素酶结果证实,miR-182-5p可与EP300靶向结合(P=0.001);采用qRT-PCR、Western印迹检测转染miR-182-5p干扰质粒后EP300在mRNA及蛋白质水平的表达,结果显示,与对照组相比,在敲低miR-182-5p组中EP300在mRNA及蛋白质的表达上调(P=0.001)。综上所述,miR-182-5p可靶向调节EP300,促进乳腺癌细胞的侵袭与转移。     

薯蓣皂苷激活p38MAPK/FOXO3a信号抑制三阴性乳腺癌细胞上皮–间质转化及侵袭

该研究探讨了薯蓣皂苷(Dioscin)对三阴性乳腺癌MDA-MB-231、BT549细胞体外侵袭及上皮–间质转化(epithelial to mensenchymal transition,EMT)的影响及其作用机制。以正常人乳腺上皮MCF-10A细胞为对照,通过MTS法、克隆形成实验检测细胞增殖能力;Transwell实验检测细胞侵袭、迁移能力;Western blot法检测p38MAPK、p-p38MAPK、FOXO3a及上皮–间质转化(epithelial to mensenchymal transition,EMT)相关标志物的表达。结果显示,Dioscin能明显抑制MDA-MB-231、BT549细胞的增殖,且具有浓度依赖性,对MCF-10A细胞抑制作用较弱;Dioscin处理后肿瘤细胞的侵袭、迁移能力明显降低,Dioscin可显著下调细胞间质样标志物波形蛋白(vimentin)、N-钙黏蛋白(N-cadherin)并促进上皮样标志物E-钙黏蛋白(E-cadherin)的表达,EMT关键转录因子Snail的表达也受到抑制。进一步研究发现,Dioscin能够上调p38MAPK磷酸化水平并促进转录因子FOXO3a的表达,而干扰FOXO3a能够逆转Dioscin对细胞EMT及侵袭的抑制作用。以上研究表明,Dioscin能够抑制三阴性乳腺癌细胞EMT及体外侵袭、迁移能力,其机制可能与Dioscin调控p38MAPK/FOXO3a信号有关。     

miR-429对乳腺癌干细胞干性维持和体内成瘤能力的影响

目的:探究miR-429在乳腺癌干性维持中所发挥的作用,并探索miR-429对乳腺癌干细胞体内成瘤能力的影响。方法:无血清悬浮培养法用于培养经流式细胞仪分选得到的CD44~+CD24~-表型乳腺癌细胞系干细胞MCF-7-S、SKBR3-S、MDA-MB-231-S及乳腺正常上皮干细胞MCF-10A-S,实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)用于检测miR-429在上述4株干细胞中的表达。将包含miR-429的重组慢病毒质粒及其阴性对照空载体质粒vector分别以病毒:细胞数量为15:1的比例感染MDA-MB-231细胞,经2.0μg/m L嘌呤霉素筛选,成功构建稳定表达miR-429或vector的MDA-MB-231细胞,经流式分选出上述两株稳转细胞株的CD44~+CD24~-表型干细胞MDA-MB-231-Svector和MDA-MB-231-SmiR-429。无血清悬浮培养后,镜下观察过表达miR-429对肿瘤球形成能力的影响,流式细胞术检测过表达miR-429对CD44~+CD24~-表型细胞亚群比例的影响,Western Blot检测过表达miR-429对乳腺癌干细胞干性相关因子ALDH1、SOX2和Bmi1蛋白表达的影响,将MDA-MB-231-Svector和MDA-MB-231-SmiR-429干细胞分别注射到BALB/c裸鼠右侧胸壁第二对乳腺脂肪垫中,构建乳腺癌干细胞裸鼠移植瘤模型,观察过表达miR-429对裸鼠体内成瘤能力的影响。结果:与MCF-10A-S相比,miR-429在MCF-7-S、SKBR3-S和MDA-MB-231-S细胞系中的表达水平均异常降低,其中,miR-429在MDA-MB-231-S细胞中表达最低(P0.05)。与MDA-MB-231-Svector细胞相比,经流式分选后的CD44~+CD24~-表型MDA-MB-231-SmiR-429干细胞形成的肿瘤球的大小和数量、分选时CD44~+CD24~-表型细胞亚群的比例、ALDH1、SOX2和Bmi1的蛋白表达水平以及裸鼠体内成瘤的体积和重量均显著降低(P0.05)。结论:miR-429可降低乳腺癌干细胞的干性和体内成瘤能力,其可能是抑制乳腺癌转移和耐药的关键分子。     

miRNA-21靶向调控Wnt/β-catenin对非小细胞肺癌细胞增殖与侵袭的影响

目的研究microRNA-21(miR-21)是否通过调控wnt/β-catenin信号通路从而影响人非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)细胞株NCI-H1975细胞体外增殖与侵袭能力。方法预测和构建含有miR-21候选靶基因和β-连环蛋白基因的双荧光素酶报告质粒。将miR-21模拟物通过Lipofactamine 2000脂质体转染法转染NCI-H1975细胞,应用qRTPCR检测细胞中miR-21和β-catenin mRNA表达情况,应用Western blot检测β-catenin蛋白水平,CCK-8法检测miR-21mimic对NCI-H1975细胞增殖能力的影响,Transwell侵袭实验检测miR-21 mimic对NCI-H1975细胞侵袭能力的影响。结果qRT-PCR肺癌组织中的miR-21与邻近正常组织相比表达明显升高;双荧光素酶报告基因结果显示miR-21能和β-catenin的3’UTR端结合且显著促进荧光素酶活性;上调miR-21可使β-catenin的mRNA和蛋白表达水平显著升高,同时上调miR-21可显著增强NCI-H1975细胞的增殖与侵袭能力。结论 miR-21在转录后水平调控β-catenin表达来促进NCI-H1975细胞的增殖与侵袭能力,可能是NSCLC潜在的治疗靶点。     

TGF-β1对乳腺癌细胞系Snail表达的影响

目的通过TGF-β1诱导乳腺癌MCF-7发生上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)后检测锌指转录因子Snail表达的改变,探讨Snail在EMT及乳腺癌发生发展中的作用。方法常规培养乳腺癌细胞株MCF-7后,用TGF-β1诱导其发生EMT,用Transwell侵袭小室法进行细胞体外侵袭能力检测;用免疫组织化学方法及免疫荧光检测E-cadherin、Vi mentin、Snail的表达;用real ti me PCR检测E-cadherin、Vi mentin、Snail mRNA的表达。结果TGF-β1处理72h后的MCF-7细胞穿透能力明显增强。E-cadherin蛋白及mRNA表达减少,Vi mentin、Snail蛋白及mRNA表达增加。结论E-cadherin、Vi mentin是细胞发生EMT的重要生物学标志,Snail可能在转录水平上调控E-cadherin、Vi mentin蛋白的表达,Snail在EMT和乳腺癌的发生发展中起着重要的作用。     

MiR-5047在乳腺癌细胞增殖迁移中的作用及表达调控*

探讨miR-5047在乳腺癌细胞中的表达及其在乳腺癌细胞增殖和迁移中的作用,并明确地西他滨在miR-5047表达调控中的作用。通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测人乳腺癌细胞系和正常乳腺上皮细胞MCF10A中miR-5047的表达水平;将miR-5047模拟物(mimic),阴性对照(NC)分别转染至MDA-MB-231和MCF7细胞,经平板克隆实验、MTT实验、划痕愈合实验检测乳腺癌细胞的增殖和迁移能力,通过qRT-PCR和Western blot检测相关基因表达及蛋白水平。使用浓度5 μmol/L和10 μmol/L的地西他滨分别处理MDA-MB-231和MCF-7细胞,经qRT-PCR检测不同浓度和处理时间条件下地西他滨对miR-5047表达的影响。同时,通过形态观察和Western blot检测地西他滨对乳腺癌细胞上皮间质转化的影响。与正常乳腺上皮细胞MCF-10A相比,miR-5047在乳腺癌细胞中表达均显著下调。miR-5047过表达可显著抑制乳腺癌细胞的增殖和迁移,促进上皮细胞标志物E-cadherin的表达,抑制间质细胞标志物Vimentin的表达。不同浓度地西他滨处理MDA-MB-231和MCF7细胞后,miR-5047表达均增强,且10 μmol/L作用48 h效果最显著。地西他滨可诱导MDA-MB-231细胞向上皮样转变。miR-5047在乳腺癌细胞系中表达显著下调,过表达miR-5047可抑制乳腺癌细胞的增殖和迁移,地西他滨可促进乳腺癌细胞中miR-5047的表达,并诱导细胞向上皮样转变。     

miR-424通过结合ARK5 mRNA 3'-UTR抑制胶质瘤细胞侵袭北大核心CSCD

前期的研究证明,人腺苷酸活化蛋白激酶5(ARK5)通过Gab2-Akt-ARK5通路,促进胶质瘤的侵袭。然而,ARK5的调节机制尚不清楚。本研究旨在探讨miR-424是否通过与ARK5 mRNA结合,进而影响胶质瘤侵袭。通过Targetscan找到与ARK5的3'-UTR区互补结合的microRNA(miR-424)。运用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测不同胶质瘤细胞系中miR-424表达水平,发现3种胶质瘤母细胞(高级别胶质瘤细胞)株中,miR-424表达量均不同程度低于低级别胶质瘤H4细胞株。miR-424及miR-424抑制剂质粒转染胶质瘤细胞系H4、LN-229并结合蛋白质印迹法显示,miR-424可负向调控ARK5蛋白表达。qRT-PCR显示,在胶质瘤细胞内过表达miR-424后,ARK5mRNA无显著变化,提示miR-424在翻译水平影响ARK5蛋白表达。Transwell侵袭实验显示,过表达miR-424导致胶质瘤细胞体外侵袭能力明显减弱。双荧光素酶基因报告检测显示,miR-424能与ARK5 mRNA的3'-UTR结合,抑制荧光素酶活性。上述结果提示,miR-424可以结合ARK5mRNA的3'-UTR而抑制ARK5蛋白翻译,从而抑制胶质瘤细胞侵袭。     

miR-424通过结合ARK5 mRNA 3'-UTR抑制胶质瘤细胞侵袭

前期的研究证明,人腺苷酸活化蛋白激酶5(ARK5)通过Gab2-Akt-ARK5通路,促进胶质瘤的侵袭。然而,ARK5的调节机制尚不清楚。本研究旨在探讨miR-424是否通过与ARK5 mRNA结合,进而影响胶质瘤侵袭。通过Targetscan找到与ARK5的3'-UTR区互补结合的microRNA(miR-424)。运用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测不同胶质瘤细胞系中miR-424表达水平,发现3种胶质瘤母细胞(高级别胶质瘤细胞)株中,miR-424表达量均不同程度低于低级别胶质瘤H4细胞株。miR-424及miR-424抑制剂质粒转染胶质瘤细胞系H4、LN-229并结合蛋白质印迹法显示,miR-424可负向调控ARK5蛋白表达。qRT-PCR显示,在胶质瘤细胞内过表达miR-424后,ARK5mRNA无显著变化,提示miR-424在翻译水平影响ARK5蛋白表达。Transwell侵袭实验显示,过表达miR-424导致胶质瘤细胞体外侵袭能力明显减弱。双荧光素酶基因报告检测显示,miR-424能与ARK5 mRNA的3'-UTR结合,抑制荧光素酶活性。上述结果提示,miR-424可以结合ARK5mRNA的3'-UTR而抑制ARK5蛋白翻译,从而抑制胶质瘤细胞侵袭。     

miR-148a通过靶向调节己糖激酶2基因抑制乳腺癌细胞糖酵解和细胞增殖能力

为了探讨miR-148a及己糖激酶2（hexokinase 2,HK2）基因对人乳腺癌细胞糖酵解代谢途径的影响和可能机制,利用实时荧光定量PCR（real-time fluorescent quantitative PCR,qRT-PCR）检测多种乳腺癌细胞系中miR-148a的表达量,从中筛选miR-148a表达量相对较低的乳腺癌细胞系作为研究对象。再通过观察miR-148a表达量的变化对乳腺癌细胞葡萄糖摄取量、乳酸生成量和细胞增殖指标的影响,以探究miR-148a对乳腺癌细胞糖代谢能力的影响。随后,通过TargetScan在线数据库预测miR-148a和HK2基因的靶向关系,再通过双荧光素酶报告实验、Western免疫印迹以及基因回复实验进行验证,以进一步明确miR-148a和HK2在乳腺癌细胞的糖酵解代谢途径中的作用机制。通过qRT-PCR发现miR-148a在多种乳腺癌细胞系表达降低,尤其是在乳腺癌细胞系MDA-MB231中表达量显著降低（P<0.000 1）。过表达miR-148a使MDA-MB231细胞的葡萄糖摄取量、乳酸生成量、细胞增殖指标均显著下降（P<0.01）;而抑制miR-148a表达使MDA-MB231细胞葡萄糖摄取量、乳酸生成量、细胞增殖指标均显著上升（P<0.01）。通过TargetScan在线数据库预测得出,miR-148a与HK2基因3′非编码区（3′-untranslated region,3′-UTR）具有部分结合位点;而双荧光素酶报告实验发现miR-148a与野生型HK2基因的3′-UTR荧光素酶报告载体结合,不与突变型HK2基因的3′-UTR结合。Western免疫印迹检测结果表明,过表达miR-148a使MDA-MB231细胞中HK2蛋白表达量显著下降（P＜0.000 1）,而抑制miR-148a表达则促进HK2蛋白表达量显著上升（P<0.05）。基因回复实验显示,过表达HK2基因使MDA-MB231乳腺癌细胞的葡萄糖摄取量、乳酸生成量、细胞增殖指标显著上升（P＜0.01）;将过表达miR-148a载体与过表达HK2载体共转染MDA-MB231细胞,miR-148a逆转了HK2所致的葡萄糖摄取量增加和乳酸生成量上升,并抑制细胞增殖。因此,研究提示,miR-148a可通过靶向抑制HK2基因表达而抑制乳腺癌细胞MDA-MB231糖酵解代谢和细胞增殖。     

癌睾丸抗原TFDP3与乳腺癌上皮间质化(EMT)的相关性研究

目的:本研究探讨了癌睾丸抗原TFDP3与乳腺癌细胞上皮间质化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)的关系。方法:本研究中选取了乳腺癌细胞系(MCF-10A,MCF-7,SK-BR-3和MDA-MB-231)作为研究对象,通过Western Blot的方法筛选获得了TFDP3低水平表达的乳腺癌细胞株。进一步通过质粒转染的方式构建TFDP3过表达的细胞系模型,观察TFDP3在EMT中的作用。结果:TFDP3在MCF-10A及SK-BR-3中不表达,在间质化程度较高的MDA-MB-231中高水平表达,而在上皮化程度较高的MCF-7中的低水平表达。MCF-7中过表达TFDP3后,上皮细胞标记分子E-cadherin表达下调,而间质细胞标记分子N-cadherin、Snail、Twist及细胞骨架蛋白Vimentin表达上调。结论:TFDP3可以促进乳腺癌细胞发生EMT。     

miR-145通过靶向吞噬和细胞活力蛋白1抑制乳腺癌细胞侵袭

吞噬和细胞活力蛋白1（engulfment and cell motility protein 1,ELMO1）可以促进多种癌细胞的侵袭和转移,但ELMO1的表达是否受miRNA的调控鲜有研究。本研究旨在探讨miR-145与ELMO1表达的相关性,以及miR-145通过结合ELMO1的mRNA对乳腺癌侵袭的影响。通过TargetScan (http://www.targetscan.org/)靶基因预测软件预测与ELMO1的3′UTR结合的miR-145。荧光素酶结果证实两者互补结合。Transwell侵袭结果显示,miR-145组和siELMO1+miR-145组MDA-231乳腺癌细胞穿膜数较对照组分别降低40%（P＜0.05）和79%（P＜0.05）。siELMO1+miR-145组和siELMO1组细胞穿膜数则无显著差异（P>0.05）。结果提示,miR-145通过与ELMO1的mRNA结合抑制细胞侵袭。qRT-PCR显示,低侵袭的MCF-7乳腺癌细胞miR-145的表达量较高侵袭的MDA-435细胞高80%（P＜0.05）,较MDA-231乳腺癌细胞高75%（P＜0.05）,即miR-145与癌细胞侵袭能力呈负相关。Western印迹结果表明,miR-145组ELMO1表达量低于阴性对照组,miR-145 抑制组ELMO1表达量高于抑制剂NC组（P＜0.05）,证明miR-145抑制ELMO1的表达。qRT-PCR显示,过表达miR-145后ELMO1 mRNA含量与对照组无显著差异（P>0.05）。结果提示,miR-145对ELMO1的调控作用通过抑制其翻译实现。F-肌动蛋白聚合实验表明,miR-145组和阴性对照组于20 s和60 s时F-肌动蛋白聚合结果存在明显区别（P＜0.05）。Western 印迹结果表明,miR-145组活化的Rac1表达量较阴性对照组降低60%（P<0.05）,抑制剂NC组活化的Rac1较miR-145 抑制组降低55%（P<0.05）;miR-145组磷酸化的整合素β1较对照组于15 min时降低42%（P<0.05）,于30 min时降低31%（P<0.05）。由此得出的miR-145过表达显著促进乳腺癌细胞F-肌动蛋白聚合、Rac1活化和整合素β1磷酸化结论。综上所述,miR-145通过靶向ELMO1的 mRNA抑制ELMO1翻译,从而抑制乳腺癌的侵袭。     

miR-145通过靶向吞噬和细胞活力蛋白1抑制乳腺癌细胞侵袭

吞噬和细胞活力蛋白1（engulfment and cell motility protein 1,ELMO1）可以促进多种癌细胞的侵袭和转移,但ELMO1的表达是否受miRNA的调控鲜有研究。本研究旨在探讨miR-145与ELMO1表达的相关性,以及miR-145通过结合ELMO1的mRNA对乳腺癌侵袭的影响。通过TargetScan (http://www.targetscan.org/)靶基因预测软件预测与ELMO1的3′UTR结合的miR-145。荧光素酶结果证实两者互补结合。Transwell侵袭结果显示,miR-145组和siELMO1+miR-145组MDA-231乳腺癌细胞穿膜数较对照组分别降低40%（P＜0.05）和79%（P＜0.05）。siELMO1+miR-145组和siELMO1组细胞穿膜数则无显著差异（P>0.05）。结果提示,miR-145通过与ELMO1的mRNA结合抑制细胞侵袭。qRT-PCR显示,低侵袭的MCF-7乳腺癌细胞miR-145的表达量较高侵袭的MDA-435细胞高80%（P＜0.05）,较MDA-231乳腺癌细胞高75%（P＜0.05）,即miR-145与癌细胞侵袭能力呈负相关。Western印迹结果表明,miR-145组ELMO1表达量低于阴性对照组,miR-145 抑制组ELMO1表达量高于抑制剂NC组（P＜0.05）,证明miR-145抑制ELMO1的表达。qRT-PCR显示,过表达miR-145后ELMO1 mRNA含量与对照组无显著差异（P>0.05）。结果提示,miR-145对ELMO1的调控作用通过抑制其翻译实现。F-肌动蛋白聚合实验表明,miR-145组和阴性对照组于20 s和60 s时F-肌动蛋白聚合结果存在明显区别（P＜0.05）。Western 印迹结果表明,miR-145组活化的Rac1表达量较阴性对照组降低60%（P<0.05）,抑制剂NC组活化的Rac1较miR-145 抑制组降低55%（P<0.05）;miR-145组磷酸化的整合素β1较对照组于15 min时降低42%（P<0.05）,于30 min时降低31%（P<0.05）。由此得出的miR-145过表达显著促进乳腺癌细胞F-肌动蛋白聚合、Rac1活化和整合素β1磷酸化结论。综上所述,miR-145通过靶向ELMO1的 mRNA抑制ELMO1翻译,从而抑制乳腺癌的侵袭。     

辣椒碱对乳腺癌MDA-MB-231细胞迁移和侵袭的抑制作用及其机制

本研究旨在观察辣椒碱对人乳腺癌MDA-MB-231细胞迁移和侵袭的影响,并探讨其分子机制。乳腺癌MDA-MB-231细胞经不同浓度辣椒碱作用24 h后进行实验,采用CCK-8法检测细胞活性,采用细胞划痕实验测量细胞迁移率,采用Transwell侵袭实验检测细胞侵袭率,采用Western blot检测乳腺癌MDA-MB-231细胞中c-Src、p-c-Src(Tyr416)、黏着斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)、p-FAK(Tyr576/577)、桩蛋白(Paxillin)、p-Paxillin(Tyr118)、基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2,MMP2)和MMP9蛋白表达水平,采用RT-PCR法检测乳腺癌MDA-MB-231细胞中MMP2和MMP9的mRNA水平。结果显示,10~50μmol/L辣椒碱对MDA-MB-231细胞存活率无显著影响,100~500μmol/L辣椒碱显著降低MDA-MB-231细胞存活率(P0.05);与正常对照组比较,25和50μmol/L辣椒碱组MDA-MB-231细胞体外迁移率和侵袭率均显著降低(P0.05),c-Src、FAK和Paxillin蛋白的磷酸化水平均显著下降(P0.05),MMP2和MMP9的mRNA和蛋白表达水平均下降(P0.05);并且辣椒碱对MDA-MB-231细胞的上述作用具有剂量依赖性。以上结果提示,低浓度辣椒碱可剂量依赖性地抑制人乳腺癌MDA-MB-231细胞迁移和侵袭,其机制可能涉及辣椒碱对c-Src/FAK/Paxillin信号通路以及MMP2和MMP9表达的抑制。     

miR-21与DNA甲基化在不同乳腺癌细胞中的相互作用

目的:探究不同乳腺癌细胞(MCF-7、MDA-MB-231)中miR-21与DNA甲基化相互调节作用。方法:将荧光标记的miR-21抑制剂及阴性对照瞬时转入MCF-7、MDA-MB-231细胞中,用荧光显微镜观察其转染效率,以Real-time PCR检测miR-21的敲低水平,并以bisulfite-q MSP法检测基因组DNA甲基化水平。同时,以2.5μmol/L DNA甲基化酶抑制剂5-AZA处理细胞72 h,以单纯二甲基亚枫(DMSO)处理做为阴性对照,观察DNA甲基化改变对miR-21表达水平的影响,接着以Western blot检测miR-21下游基因人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因(PTEN)、蛋白激酶B(AKT)蛋白的表达水平。结果:miR-21抑制剂可敲低MCF-7细胞中miR-21的表达水平(P0.01),并引起基因组DNA甲基化水平的显著升高以及DNA甲基化转移酶Dnmt1、Dnmt3a以及Dnmt3b的普遍升高(P0.05,P0.01)。而在MDA-MB-231细胞中瞬转miR-21抑制剂则引起miR-21表达水平的小幅度升高(P0.01)以及整体DNA甲基化水平的降低(P0.05),并伴随有Dnmt3a的升高及Dnmt3b的降低。使用5-AZA处理后发现,其可显著上调MCF-7以及MDA-MB-231细胞中miR-21的表达(P0.01),并引起其下游基因PTEN在MCF-7细胞内的表达升高,进而下调AKT的蛋白水平。结论:瞬转miR-21抑制剂对MCF-7与MDA-MB-231细胞DNA甲基化水平的调节截然相反,而DNA甲基化的降低则可使miR-21的表达一致上调。本研究可为以后不同类型乳腺癌的临床治疗提供一定的实验依据。     

长链非编码RNA SNHG3对人乳腺癌细胞MCF-7增殖、迁移与侵袭的影响 *

目的:探讨长链非编码RNA SNHG3对人乳腺癌细胞MCF-7增殖、迁移与侵袭的影响。方法:构建SNHG3过表达质粒,实验分别设置阴性对照组(pcDNA-3.1+)与SNHG3基因过表达组(pcDNA-3.1+/SNHG3)。将MCF-7细胞转染对照组质粒和SNHG3过表达质粒,采用实时定量PCR 方法检测 SNHG3 mRNA 转录水平,Western blot 检测MMP9及EMT相关蛋白质水平;集落形成实验检测MCF-7细胞增殖能力;划痕愈合实验检测MCF-7细胞横向迁移能力; Transwell 小室实验检测MCF-7细胞纵向迁移能力及侵袭能力。结果:过表达SNHG3后,MCF-7细胞中SNHG3的mRNA水平显著增高(P<0.001);MCF-7细胞的体外增殖能力明显增加(P<0.01),迁移(P<0.01)与侵袭能力(P<0.001)也显著增强,实时定量PCR, Western blot 结果显示SNHG3可激活EMT相关通路。结论:过表达SNHG3可能通过激活EMT通路促进乳腺癌MCF-7细胞的增殖,迁移与侵袭。     

miR-21靶向调节MARCKS基因影响人乳腺癌细胞多西紫杉醇敏感性的研究

目的:探讨miR-21对MARCKS基因表达的调控及其与乳腺癌MDA-MB-231细胞株多西紫杉醇耐药的关系。方法:通过基因芯片筛选到miR-21在亲代敏感细胞株(MDA-MB-231/S)与多西紫杉醇耐药细胞株(MDA-MB-231/Doc)中存在差异表达,应用实时荧光定量(RT-qPCR)方法验证此差异,同时分别检测MDA-MB-231/S细胞和MDA-MB-231/Doc细胞转染miR-21模拟物和抑制物后的表达变化;通过靶基因预测软件预测miR-21与MARCKS基因的关系;采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法、流式细胞术、RT-qPCR和蛋白质印迹法检测miR-21表达变化对三阴性乳腺癌细胞多西紫杉醇耐药性的影响,并探讨其与MARCKS基因表达的关系。结果:与MDA-MB-231/S相比,miR-21在MDA-MB-231/Doc中的表达水平明显升高(2.03±0.06)倍(P0.05)。与阴性对照组比,MDA-MB-231/S细胞转染miR-21 mimics后miR-21表达水平明显增高(2.26±0.07)倍(P0.05),而MARCKS基因在mRNA和蛋白水平上均明显下调。MDA-MB-231/Doc细胞转染miR-21 inhibitors后,miR-21表达水平是阴性对照组的(0.36±0.03)倍(P0.05),MARCKS基因的mRNA和蛋白水平高于其阴性对照组。转染miR-21 mimics后的MDA-MB-231/S细胞IC50显著高于其阴性对照组(P0.05),相反,与阴性对照组相比,MDA-MB-231/Doc细胞转染miR-21 inhibitors后,其IC50显著降低(P0.05)。MDA-MB-231/S转染miR-21 mimics后,miR-21表达量明显上调,MARCKS基因分别是阴性对照组的(3.564±0.336)倍和(2.019±0.268)倍(P0.05)。结论:miR-21可能通过靶向调节MARCKS基因增强乳腺癌细胞对多西紫杉醇的耐药性。     

PDGF-C 3'UTR区荧光素酶报告基因载体构建

目的:构建不同长度包含目的片段的PDGFC 3`UTR双荧光素酶报告基因载体,为进一步研究PDGF-C mRNA的上游miRNA调节做准备。方法:培养人乳腺癌细胞系MDA-MB-231细胞,提取腺癌细胞系MDA-MB-231细胞的基因组DNA,以提取的基因组为模板,通过PCR扩增不同长度的PDGFC 3`UTR片段,经胶回收后,将回收的目的片段插入报告基因载体SV40-p GL3中,再经转化将克隆好的载体转入细菌内扩增(先在固体培养基上扩增为菌落,然后再接种进液体细菌培养管中扩增),扩增细菌后进行质粒提取,并进行菌落PCR及双酶切鉴定,最后送公司进行基因序列检测鉴定。结果:成功构建了不同长度目的片段的PDGFC 3`UTR的双荧光素酶报告基因载体。结论:本实验构建了不同长度的PDGF-C mRNA的3’UTR区的双荧光素酶报告基因载体,为进一步研究PDGF-C mRNA的上游miRNA调节打下了基础。