粟酒裂殖酵母中Mef2在线粒体中功能的研究

由核编码基因控制的线粒体翻译对线粒体中电子传递链复合物的合成是必不可少的。旨在揭示粟酒裂殖酵母中Mef2蛋白的主要功能。利用同源重组的方法构建Δmef2突变体,观察Δmef2在以甘油为唯一碳源的非发酵培养基的生长表型;生物信息学分析结果显示Mef2的N端含有一段由31个氨基酸组成的线粒体定位序列(MTS),为进一步确定Mef2蛋白的定位,在Mef2的C端添加一个GFP荧光标记,观察GFP绿色荧光的位置。接着采用Northern blotting检测mef2的缺失对线粒体基因组编码m RNAs的影响。最后,运用Western blotting检测mef2的缺失对线粒体基因组编码的蛋白的影响。研究结果表明,Δmef2菌株在非发酵培养基上表现出生长缺陷,是线粒体呼吸缺陷型菌;GFP绿色荧光定位实验证实了Mef2定位于线粒体中;Northern blotting实验结果显示mef2的缺失不影响线粒体基因组编码m RNAs的转录;Western blotting检测结果显示mef2的缺失导致Cox1、Cox3、Atp6和Cob1蛋白的表达量降低。综上所述,Mef2是一个与线粒体功能密切相关的蛋白,并且参与了线粒体编码蛋白Cox1、Cox3、Atp6和Cob1的翻译。     

粟酒裂殖酵母中Atp11在线粒体中功能的研究

ATP是由ATP合酶复合体催化合成的,在线粒体呼吸过程中起着重要作用。旨在研究粟酒裂殖酵母中Atp11(SPAC3A12.12)在线粒体中的功能。利用同源重组的方法构建Δatp11突变体,观察Δatp11缺失菌在以甘油为唯一碳源的非发酵培养基上的表型;通过生物信息学分析发现Atp11的N端含有一段由24个氨基酸残基组成的线粒体定位序列(MTS),为确定Atp11在细胞内的定位,在Atp11的C端添加一个GFP标签,观察绿色荧光在细胞内的位置;运用Western blotting检测atp11的缺失对线粒体基因组编码蛋白稳态性的影响。研究结果表明,Δatp11突变体在非发酵培养基上表现出生长缺陷,是线粒体呼吸缺陷菌;GFP绿色荧光定位实验结果证实了Atp11定位于线粒体中;Western blotting检测结果显示atp11的缺失导致Cob1、Cox1、Cox2、Cox3和Atp6蛋白的表达量显著降低。综上所述,粟酒裂殖酵母Atp11定位于线粒体且是线粒体呼吸链正常发挥功能所必须的。     

粟酒裂殖酵母蛋白Atp4定位和功能的研究

研究粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)中Atp4的定位和参与线粒体功能的机制。借助于基因敲除、荧光显微镜观察、线粒体提取、生化试剂处理和Western blotting等技术开展研究。在甘油培养基上,Δatp4突变菌株表现出生长缺陷,是线粒体呼吸缺陷菌;Fluorescence microscope观察到用GFP标记的Atp4和线粒体是共定位的;采用生化试剂TritonX-100和蛋白酶K处理以及碳酸钠处理Atp4-Flag和yHL6381线粒体,结果表明Atp4定位在线粒体内膜;Western blotting实验结果表明Atp4缺失导致Cob1、Cox1、Cox2和Atp6表达量剧烈下降,Cox3和Cox4蛋白表达量也有略微下降。综上所述,Atp4在线粒体内膜发挥功能,对于维持线粒体编码蛋白的正常表达至关重要,是线粒体呼吸链功能的发挥所必需的。     

粟酒裂殖酵母中指示线粒体形态的荧光标签的构建

粟酒裂殖酵母是优秀的研究线粒体模型机理的模式生物.为建立适合粟酒裂殖酵母的指示线粒体形态的荧光标签,本研究以pYJ19质粒为骨架,构建了由粟酒裂殖酵母nmt41启动子控制的、以增强型绿色荧光EGFP为报告基因、以粟酒裂殖酵母自身蛋白Cox4为线粒体定位序列(Mitochondrial targeting sequences)来源的mts和以leu1营养为选择标记的质粒系统pMTS7.将pMTS7转化粟酒裂殖酵母yHL6381,以Mito-Tracker线粒体染料为对照,荧光显微镜观察结果发现,pMTS7能够与MitoTracker共定位,能正确显示线粒体定位.与具有一定毒性且染色结果不易控制的MitoTracker相比,利用pMTS7标记线粒体可以在显微镜下长时间观察清晰的线粒体形态,而且可以看到线粒体分裂融合的动态变化.pMTS7的成功构建为研究粟酒裂殖酵母中线粒体相关基因的突变体提供了技术工具.     

巴斯德毕赤酵母甘油转运体的发现及功能研究

目的:分离确认巴斯德毕赤酵母中甘油转运体并初步研究其功能。方法:通过生物信息学方法从NCBI数据库中查找可能的甘油转运体(gt1,GeneID:8197545),并通过DAS软件对其跨膜结构域进行预测。通过PCR方法扩增该基因并将其与EGFP融合克隆到pPICZ B及pRS424载体进行亚细胞定位;同时将其与pRS424载体连接后电转到粟酒裂殖酵母中进行异源表达确定其功能;通过同源重组敲除gt1基因并在不同培养基中培养测定aox1基因表达量。结果:生物信息学显示与酿酒酵母中已经证明的甘油转运体(sugar transporter 1,stl1)类似,GT1蛋白同样为具有疏水结构域的跨膜蛋白,同时亚细胞定位结果显示GT1蛋白定位于细胞膜上,包含有gt1基因的粟酒裂殖酵母可以在以甘油作为唯一碳源的培养基中生长而野生型不可以;在Δgt1突变体中aox1基因可以获得组成型表达。结论:分离并确认了巴斯德毕赤酵母中的甘油转运体GT1,并初步证明其与aox1基因甘油阻遏相关。     

Pichia pastoris X-33 ΔGT2缓解甘油对AOX1的阻遏并用于外源蛋白的高效表达

巴斯德毕赤酵母是甲醇酵母,作为应用最广泛的真核表达系统之一,在以甲醇为唯一碳源时可以利用醇氧化酶启动子PAOX1进行外源蛋白的表达,但是这一过程会被甘油阻遏。近几年有研究表明,甘油转运体不仅有运输甘油的功能,还与甘油、甲醇的代谢有一定的联系。目的:构建了甘油转运体GT2(PAS_chr3_1076)缺失菌株P.pastoris X-33ΔGT2,研究该菌株的甘油去阻遏效应和在不同碳源培养基中诱导PAOX1启动子驱动外源蛋白的表达水平。方法:构建以甲醇诱导型启动子PAOX1调控外源基因EGFP的表达载体PAOX1-EGFP,经酶线性化后电转野生型菌株P.pastoris X-33获得重组菌株x-EGFP;通过同源重组的方法敲除GT2基因,获得ΔGT2-EGFP敲除菌株;以ΔGT2-EGFP和X-EGFP为出发菌株,在甘油、甲醇,以及甘油甲醇混合为碳源诱导醇氧化酶AOX1及绿色荧光蛋白EGFP的表达和生长情况,并检测在以甘油为唯一碳源时,胞外的甘油含量。结果:在以甘油甲醇混合碳源培养时,突变体ΔGT2-EGFP菌株中AOX1单位酶活比野生型菌株高出近35%,单位荧光强度要高出近70%;在以甘油为唯一碳源时,X-EGFP最终收获时的生物量比ΔGT2-EGFP多,且发酵液中甘油含量相对较少;以混合碳源培养时ΔGT2总外源蛋白表达水平最高。结论:实验表明,GT2参与甘油的吸收与代谢,ΔGT2突变株可在一定程度上解除甘油对甲醇的代谢抑制,暗示甘油转运体与PAOX1相关,且基于此研究结果有望优化出更高效的酵母表达系统。     

含35S启动子的粟酒裂殖酵母表达载体的构建及功能鉴定

利用PCR技术从植物表达载体pBI121上先后克隆出GUS基因和35S-GUS-NOS基因序列,分别构建粟酒裂殖酵母重组表达载体pESP-2-GUS和pESP-2-35S.GUS.NOS,并将它们转化到粟酒裂殖酵母菌体中.通过对不同液体培养基中两种转化子的不同启动子启动GUS基因表达产物的GUS染色分析与比较,证明连入的35S启动子能够替代pESP-2自身受维生素B1浓度调控的启动子,从而降低了培养基的成本,为今后工业上利用粟酒裂殖酵母发酵生产产品,提高经济效益,奠定了基础.     

粟酒裂殖酵母Sls1在线粒体中的功能研究

线粒体是真核生物中非常重要的细胞器之一,它参与ATP的合成以及物质代谢、细胞凋亡等多种生理过程。在研究线粒体功能时,粟酒裂殖酵母是一种很好的模式生物。在本文中,我们研究了与线粒体相关的蛋白Sls1的功能。在非发酵型培养基上,Δsls1突变菌株的生长出现缺陷。Western-Blot实验表明,在Δsls1菌株中,线粒体编码蛋白的水平也出现了剧烈的降低。敲除sls1影响了线粒体编码蛋白Cox1的合成。我们的研究表明Sls1是一个与线粒体功能密切相关的蛋白,它的其中一个功能是维持了线粒体编码蛋白的正常水平,并且参与了线粒体编码蛋白Cox1的合成。     

粟酒裂殖酵母中ppr基因缺失引起细胞絮凝的机制研究

粟酒裂殖酵母中PPR蛋白在线粒体和叶绿体的RNA代谢中起重要作用,ppr基因的缺失会引起线粒体功能异常(ppr5除外)。旨在揭示粟酒裂殖酵母中ppr基因缺失引起细胞絮凝的机制。利用含有半乳糖的培养基分别培养WT、Δppr3、Δppr4、Δppr6和Δppr10,观察野生型和突变体的生长表型;通过添加不同的金属离子及改变细胞表面pH来探究诱导这类突变体出现絮凝的因素;采用RT-PCR技术检测缺陷菌中编码细胞表面絮凝因子及细胞壁重构酶基因的表达情况。研究结果表明:ppr3、ppr4、ppr6和ppr10的敲除会引起由Ca²⁺依赖型半乳糖结合蛋白参与的细胞絮凝;不同的pH和不同金属离子对这些缺陷菌的细胞絮凝有影响;ppr3、ppr4、ppr6和ppr10的缺失会使细胞内编码絮凝因子和细胞壁重构酶基因表达上调。线粒体功能异常会诱导絮凝基因表达上调和细胞壁属性发生改变,从而产生絮凝现象。     

利用GFP/RFP双荧光指示载体鉴定特异性启动子功能

在基因表达定位或启动子调控模式的研究中, 多以gusA作为报告基因。但由于部分组织中高内源GUS背景活性或转化手段的限制, 使判断基因表达定位或调控时存在很大误差。为了解决上述问题, 本实验将报道基因绿色荧光蛋白(GFP)和红色荧光蛋白(RFP)融合构建双荧光标记瞬时表达载体pBI221-RFP/GFP。该载体以CaMV35S启动子驱动GFP确定转化效率, 通过鉴定阳性个体的红色荧光活性分析目的基因或启动子的表达模式。并通过番茄E8和西瓜AGPL1果实特异启动子验证了该载体在启动子调控模式研究中的应用可行性。结果表明pBI221-RFP/GFP是一个可以在基因和启动子功能验证中应用的高效瞬时表达载体。     

转醛醇酶基因差异表达影响酵母发酵木糖及耐受乙酸性能

【目的】木糖发酵是纤维素燃料乙醇生产的一个关键瓶颈,同时木质纤维素水解液中的乙酸严重抑制酿酒酵母的木糖发酵过程,因此通过基因工程手段提高菌株对木糖的利用以及对乙酸的耐受性具有重要意义。本研究以非氧化磷酸戊糖途径(PPP途径)中关键基因转醛醇酶基因(TAL1)为研究对象,探讨了3种不同启动子PTDH3、PAHP1和PUBI4,控制其表达对菌株利用木糖和耐受乙酸的影响。【方法】通过同源重组用3种启动子替换酿酒酵母基因工程菌NAPX37的TAL1基因的启动子PTAL1,再通过孢子分离和单倍体交配构建了纯合子,利用批次发酵比较了在以木糖为唯一碳源和混合糖(葡萄糖和木糖)为碳源条件下,3种启动子控制TAL1基因表达导致的发酵和乙酸耐受能力的差异。【结果】启动子PTDH3、PAHP1和PUBI4在不同程度上提高了TAL1基因的转录水平,提高了菌株对木糖的利用速率及乙酸耐受能力,提高了菌株在60 mmol/L乙酸条件下的葡萄糖利用速率。在以木糖为唯一碳源且无乙酸存在、以及混合糖为碳源的条件下,PAHP1启动子控制TAL1表达菌株的发酵结果优于PTDH3和PUBI4启动子的菌株,PAHP1启动子控制的TAL1基因的转录水平比较合适。在木糖为唯一碳源且乙酸为30 mmol/L时,PUBI4启动子控制TAL1基因表达的菌株发酵结果则优于PAHP1和PTDH3启动子菌株,此时PUBI4启动子控制的TAL1的转录水平比较合适。【结论】启动子PTDH3、PAHP1和PUBI4不同程度地提高TAL1基因的表达,在不同程度上改善了酵母菌株的木糖发酵速率和耐受乙酸性能,改善程度受发酵条件的影响。     

GFP工程酵母菌的构建及其对Cu2+的荧光响应

从酿酒酵母基因组DNA中克隆到金属硫蛋白启动子(PCUP1)片段,将绿色荧光蛋白(GFP)基因置于PCUP1的调控下,构建重组质粒pCUP9K-GFP,并通过氯化锂法转化毕赤酵母,获得工程菌株。工程菌细胞及其发酵液中可检出GFP荧光,表明PCUP1能启动外源基因GFP转录,使工程菌表达并分泌GFP。研究发现,工程菌培养液中分别加入10μmol/L的铜、铬、镉和砷离子后,铜处理组GFP荧光强度明显增加,其余三种离子对工程菌荧光强度影响不大;用铜离子诱导后,工程菌发酵上清液的荧光强度明显增强,并与铜离子浓度(0～1mmol/L)呈正相关。研究表明,该工程菌中启动子PCUP1受铜离子诱导,GFP的表达对铜离子具有剂量依赖性,在一定浓度范围内,GFP荧光强度与铜离子浓度呈正相关。     

熊蜂生假丝酵母启动子的筛选及强度分析

【背景】熊蜂生假丝酵母(Starmerella bombicola)作为一种非常规假丝酵母菌株,因其具备高产槐糖脂生物表面活性剂的能力而受到广泛关注。然而,由于自身的表达系统并不完善,限制了该菌株的代谢工程改造。【目的】克隆、筛选及鉴定新的系列内源启动子表达元件。【方法】通过对比分析熊蜂生假丝酵母全基因组及9种功能已知目的基因信息,并结合启动子预测网站,筛选获得系列启动子候选序列,以SbGFP (密码子优化后的酵母增强型绿色荧光蛋白)为报告基因进行整合表达,通过绿色荧光蛋白强度及转录水平分析鉴定启动子强度。【结果】在分别以葡萄糖和油酸作为唯一碳源的条件下,启动子PTEF1和PGPD在不同碳源培养条件下均显示出较高的转录水平。启动子PCYP52M1、PUGTA1、PUGTB1及PMOB在以油酸为唯一碳源时具有弱转录活性,而在以葡萄糖为唯一碳源时则未检测到它们具有转录活性,推测它们是油酸诱导型启动子。进一步利用实时荧光定量PCR (RT-qPCR)对SbGFP进行转录水平分析,检测结果与绿色荧光表达水平一致。【结论】获得了系列熊蜂生假丝酵母内源性启动子,进一步丰富了该菌株的表达元件,为菌株的代谢工程改造及基因的表达与调控奠定了理论基础。     

用绿色荧光蛋白和洋葱表皮细胞检测拟南芥rd29A基因启动子活性的方法

将rd29A基因的启动子与绿色荧光蛋白基因(GFP)融合在一起,构建成植物表达载体,并以CaMV35S启动子驱动的GFP基因的植物表达载体为对照,用基因枪介导法转化置于4种类型培养基上的洋葱表皮细胞.对其进行不同温度下的培养,16 h后观察GFP基因瞬时表达水平的结果表明,rd29A启动子对高盐和脱水逆境的响应较温度显著,特别是在含PEG6000的培养基上,细胞无破损,绿色荧光强烈,适合于GFP的瞬时表达.而高盐由于易导致细胞出现离子毒害,不宜作为GFP瞬时表达的培养基.     

盘基网柄菌DJ-1蛋白的亚细胞定位研究

DJ-1基因的突变或缺失导致帕金森病相关症状,但其在帕金森病中的作用以及其亚细胞位置尚存在争议。盘基网柄菌是研究神经退化性疾病的模式生物,通过绿色荧光蛋白(GFP)标记DJ-1蛋白,利用荧光蛋白技术及DJ-1与GFP共定位技术在正常和氧化情况下研究其在盘基网柄菌的亚细胞定位,可以为探索DJ-1蛋白亚细胞位置与致病机制之间的联系奠定基础。研究结果表明,正常情况下盘基网柄菌DJ-1蛋白位于细胞质内,一旦受到氧化应激, DJ-1蛋白则转移至线粒体,这个亚细胞位置转移与DJ-1蛋白C117位点的氧化相关。该研究为探索DJ-1蛋白如何在氧化应激条件下完成对细胞的保护提供了实验依据。     

板栗疫病菌绿色荧光与红色荧光蛋白共定位载体的构建

低毒病毒-板栗疫病菌组合是研究病毒与宿主相互作用的一个优秀的模式系统.我们构建了含绿色荧光蛋白基因gfp的载体pCPXHY2GFP与含红色荧光蛋白基因rfp的载体pCPXG418RFP,并用于转化野生型菌株EP155,获得了以潮霉素为筛选标记、表达绿色荧光蛋白的转化株pCPXHY2GFP/EP155和以G418为筛选标记、表达红色荧光蛋白的转化株pCPXG418RFP/EP155.将载体pCPXG418RFP转化pCPXHY2GFP/EP155,获得的转化株能观察到绿色荧光蛋白与红色荧光蛋白共定位的现象.板栗疫病菌绿色荧光与红色荧光共定位载体pCPXHY2GFP与pCPXG418RFP的构建,为深入研究病毒与宿主相互作用的分子机制提供了强有力的研究材料.     

绿色荧光蛋白基因原核表达载体的构建及其在昆虫肠道短短芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌中的表达

【目的】构建带有苏云金芽孢杆菌cry3a基因非芽孢依赖启动子和绿色荧光蛋白基因gfp(Green Fluorescent Protein)的原核表达载体,并转化从桑粒肩天牛幼虫肠道分离的两株常驻细菌短短芽孢杆菌CQUBb和苏云金芽孢杆菌CQUBt,以检测cry3a启动子在昆虫肠道常驻菌中的启动子活性,获得GFP标记菌株,为常驻菌在昆虫幼虫肠道中的定殖情况和杀虫工程菌的构建奠定基础。【方法】采用重叠延伸PCR将cry3a基因启动子和gfp基因进行融合,并与pHT304载体连接构建重组质粒pHT3AG,获得的重组质粒以电脉冲转化肠道常驻菌短短芽孢杆菌CQUBb和苏云金芽孢杆菌CQUBt,于可见光和荧光显微镜下观察荧光并通过SDS-PAGE分析重组菌株的蛋白表达情况,然后对重组菌株进行生长动力学分析和稳定性测试。【结果】重组菌在营养期大量组成型表达GFP,经电泳分离在凝胶上出现约29kDa的特异蛋白条带;重组菌生长曲线与出发菌没有显著差异,说明外源质粒未对宿主菌的生长带来明显不利影响;抗性条件下传代30次后两菌株外源质粒稳定性仍可达95%、67%;两个菌株比较,CQUBb比CQUBt质粒转化率高、重组菌GFP表达时间长、表达量大,并且重组菌株稳定性好。【结论】成功地将cry3a基因核心启动子和gfp基因转入桑粒肩天牛幼虫肠道常驻菌,实现了该启动子在Bt之外的菌株中发挥作用,构建了两个GFP标记菌株;重组基因工程菌株表达量大,稳定性好,可以用作昆虫肠道内微生态研究和芽孢杆菌表达系统以及杀虫菌株的构建。     

应用重组表达钙离子敏感蛋白YC2.1研究粟酒裂殖酵母细胞内钙离子浓度的分布

把重组表达钙离子敏感蛋白的YC2．1基因（yellow cameleon 2．1）导入了粟酒裂殖酵母中,观察了粟酒裂殖酵母细胞内钙离子浓度的分布。结果发现,钙离子敏感蛋白所指示的钙离子呈细胞周缘胞质较高浓度分布,而在细胞胞质中部的钙离子浓度相对低一些。通过DAPI染色实验证实这是由于胞质中部细胞核的填充而形成。fluo-3染色的裂殖酵母细胞,由于fluo-3进入到细胞器（房室化现象）,所以出现胞质的内部区域高的荧光信号,而在周缘的胞质区相对弱,不能真实反应胞质钙离子的分布。因此重组表达钙离子敏感蛋白测定钙离子的方法优于fluo-3荧光探针的方法,对于裂殖酵母细胞胞内钙离子的研究具有良好的应用前景。     

利用荧光蛋白标记研究稻瘟病菌有性世代的细胞结构

稻瘟病是水稻最重要的病害之一,同时稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)是植物病原真菌研究的模式生物。稻瘟病菌是异宗配合的子囊菌,但其有性世代的细胞学过程、形态结构、分子机制以及对病菌变异的贡献研究都较少,也缺乏必要的研究手段。该文利用荧光蛋白标记结合荧光染色的方法对稻瘟病菌有性世代结构进行了标记和显微观察,以期为稻瘟病菌有性生殖过程和机制研究提供方法与借鉴。将绿色荧光蛋白GFP和红色荧光蛋白m Cherry分别导入两个相对交配型的稻瘟病菌菌株Guy11(MAT1-2)和70-15(MAT1-1),各转化子及野生型按交配型组合对峙培养,观察有性世代结构中的荧光表达情况。结果表明,组蛋白H3启动子、核糖体蛋白RP27启动子和疏水蛋白MPG1启动子均可在稻瘟病菌有性孢子形成过程中高丰度表达。进一步利用这三种启动子和两种荧光蛋白对稻瘟病菌有性孢子的细胞器(细胞核、过氧化物酶体)进行标记和观察,结果表明,融合组蛋白H2B的m Cherry及融合核定位信号(NLS)的GFP均能有效标记子囊孢子细胞的细胞核,荧光集中而明亮;带有过氧化物酶体定位信号1(PTS1)的GFP可以有效地标记子囊孢子中的过氧化物酶体,每个细胞中均有数量不等的过氧化物酶体,表明子囊孢子中需要过氧化物酶体参与生化代谢。该文还利用脂肪染色剂尼罗红、BODIPY和细胞壁染色剂卡氏白结合荧光蛋白标记对子囊和子囊孢子进行组合染色。结果显示,尼罗红、BODIPY、卡氏白染色剂互不干扰,可以与不同颜色的荧光蛋白相互组合,从而更加清晰地标记子囊和子囊孢子的结构、细胞器和储藏物质。     

烟草质体分裂蛋白NtFtsZs在大肠杆菌中的定位分析

分别构建了两个烟草 (NicotianatabacumL .)质体分裂基因NtFtsZ1和NtFtsZ2与编码绿色荧光蛋白的gfpS65A、V68L、S72A基因相融合的原核表达载体 ,并导入大肠杆菌 (Escherichiacoli)JM10 9菌株中进行表达。全长NtFtsZs∶GFP融合蛋白在菌体中有规律地定位 ,暗示NtFtsZs能识别大肠杆菌潜在的分裂位点 ,并能与大肠杆菌的内源FtsZ发生聚合作用 ;融合蛋白的诱导表达抑制了宿主菌的分裂 ,形成了明显的丝状菌体 ,证明真核生物的ftsZ基因与大肠杆菌的ftsZ基因有相似的作用。同时构建了NtFtsZs不同缺失的原核表达载体 ,对这两个基因所编码蛋白不同结构域的功能做了初步分析。实验结果表明 ,烟草FtsZ蛋白的C端结构域与其在大肠杆菌细胞中的正确定位有关 ;而N端结构域与NtFtsZs∶GFP融合蛋白的聚合有关。