黄姑鱼肌肉胆碱酯酶的纯化及其某些性质

用亲和层析方法纯化了黄姑鱼(Nibea albiflora)肌肉胆碱酯酶。结合在膜上的胆碱酯酶用两种非离子型表面活性剂的混合液抽提、硫酸铵分级沉淀、再经一次亲和层析,共提纯11,800倍,最高比活力达2180活力单位/毫克蛋白,总活力回收约20%。纯化后的酶用聚丙烯酰胺凝胶电泳,除部分酶蛋白留在原点外,在凝胶内为单一蛋白染色区带,具有酶活力。SephadexG-200凝胶过滤得两个酶活力峰。亲和吸附剂在八个月内反复使用近20次,性能不变。对酶的一般性质作了初步的研究。根据酶的底物专一性、受真性酶专一性抑制剂抑制作用的敏感性及过量底物抑制作用的存在,可以认为黄姑鱼肌肉胆碱酯酶基本上具有真性酶的特征。     

黄姑鱼肌肉胆碱酯酶的纯化及其某些性质

用亲和层析方法纯化了黄姑鱼(Nibea albifiora)肌肉胆碱酯酶。结合在膜上的胆碱酯酶用两种非离子型表面活性剂的混合液抽提、硫酸铵分级沉淀、再经一次亲和层析,共提纯11,800倍,最高比活力达2180活力单位/毫克蛋白,总活力回收约20%。纯化后的酶用聚丙烯酰胺凝胶电泳,除部分酶蛋白留在原点外,在凝胶内为单一蛋白染色区带,具有酶活力。SephadexG-200凝胶过滤得两个酶活力峰。亲和吸附剂在八个月内反复使用近20次,性能不变。对酶的一般性质作了初步的研究。根据酶的底物专一性、受真性酶专一性抑制剂抑制作用的敏感性及过量底物抑制作用的存在,可以认为黄姑鱼肌肉胆碱酯酶基本上具有真性酶的特征。     

紫贻贝(Mytilus edulis)血淋巴液乙酰胆碱酯酶的性质研究

紫贻贝(Mytilus edulis)血淋巴液乙酰胆碱酯酶是溶解状态的酶。我们制备了四种接有不同配位基或手臂的亲和凝胶,对酶的亲和层析行为作了比较。结果表明,不仅配位基的性质对酶的结合有关,而且手臂的疏水性质也影响酶的结合。用N-甲基吖啶为配位基的凝胶将粗酶制剂纯化了480倍。该酶对碘化硫代乙酰胆碱的米氏常数Km为6.8×10~(-5)M,对抑制剂BW284C51的可逆抑制常数Ks为1.03×10~(-5)M,过量底物使酶活力受到抑制。另外,我们还初步观察到不同季节的材料,其酶的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离图谱有所差异。     

紫贻贝(Mytilus edulis)血淋巴液乙酰胆碱酯酶的性质研究

紫贻贝(Mytilus edulis)血淋巴液乙酰胆碱酯酶是溶解状态的酶。我们制备了四种接有不同配位基或手臂的亲和凝胶,对酶的亲和层析行为作了比较。结果表明,不仅配位基的性质对酶的结合有关,而且手臂的疏水性质也影响酶的结合。用N-甲基吖啶为配位基的凝胶将粗酶制剂纯化了480倍。该酶对碘化硫代乙酰胆碱的米氏常数K_m为6.8×10~(-6)M,对抑制剂BW284C51的可逆抑制常数K_4为1.03×10(-6)M,过量底物使酶活力受到抑制。另外,我们还初步观察到不同季节的材料,其酶的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离图谱有所差异。     

用高碘酸盐活化葡聚糖凝胶制备亲和吸附剂的研究

 <正> 用高碘酸盐活化的Sephadex与鸡卵类粘蛋白偶合制备分离纯化胰蛋白酶的亲和吸附剂。该方法比CNBr活化Sepharose 4B制备亲和吸附剂的方法具有操作安全,价格低廉等优点。活化载体在4℃保存较长时间不失去键合能力。该亲和吸附剂可制备得比活力为11228.8u/mgBAEE单位电泳单带纯胰蛋白酶,并能反复使用十余次,仍具有较强亲和吸附能力。酶     

通用性配体亲和层析

通用性配体亲和层析采用稳定,价廉的简单配体与固相基质连接形成亲和吸附剂,这种吸附剂已广泛应用于蛋白和多肽等的分离纯化。本文介绍三种通用性配体亲和层析方法的基本原理和应用,包括金属整合物配体亲和层析、染料配体亲和层析和组氨酸配体亲和层析。     

蓖麻蚕氨基酰-tRNA合成酶与丝心蛋白合成的关系

蓖麻蚕Phtlosamta cynthia ricim后部丝腺体在五龄后期主要合成一种蛋白质——丝心蛋白。在组成丝心蛋白的氨基酸成分中,丙氨酸和甘氨酸占了78％,其中内氨酸的含量比甘氨酸高(Kirimura等1962)。已经知道在五龄期,蓖麻蚕后部丝腺体tRNA含量与丝心蛋白的氨基酸成分之间存在着相关性(辜祥荣等,1981)。在生物体内,氨基酸必须与其相应的tRNA结合才能参与蛋白质的合成,而两者的结合反应是由其相应的氨基酰-tRNA合成酶所催化的。本文测定了五龄期蓖麻蚕后部丝腺体中甘氨酰-tRNA合成酶和丙氨酰-tRNA合成酶的活力,以及这两个酶的Km值,观察到在五龄期,这两个酶的活力是随着蛋白质合成的增加而升高的,而且并没有同功酶或酶的变构产生。     

猪甲状腺球蛋白-对氨基苯砜乙基-交联琼脂——一种可分离多种外源凝集素的亲和吸附剂

本文介绍了猪甲状腺球蛋白-对氨基苯砜乙基-交联琼脂的制备过程,用此亲和吸附剂分离提纯了一些已知的对葡萄糖(和甘露糖)、半乳糖、N-酰氨基葡萄糖专一结合的外源凝集素,此柱还可用来分离一些对聚糖专一结合的外源凝集素,如半夏凝集素、莲胚凝集素,还对脲作亲和层析解吸剂进行了讨论。以猪甲状腺球蛋白-对氨基苯砜乙基-交联琼脂作亲和吸附剂,脲作解吸剂适用于动植物来源的凝集素的筛选。     

猪甲状腺球蛋白-对氨基苯砜乙基-交联琼脂——一种可分离多种外源凝集素的亲和吸附剂

本文介绍了猪甲状腺球蛋白-对氨基苯砜乙基-交联琼脂的制备过程,用此亲和吸附剂分离提纯了一些已知的对葡萄糖(和甘露糖)、半乳糖、N-酰氨基葡萄糖专一结合的外源凝集素,此柱还可用来分离一些对聚糖专一结合的外源凝集素,如半夏凝集素、莲胚凝集素,还对脲作亲和层析解吸剂进行了讨论。以猪甲状腺球蛋白-对氨基苯砜乙基-交联琼脂作亲和吸附剂,脲作解吸剂适用于动植物来源的凝集素的筛选。     

浙江产眼镜蛇毒胆碱酯酶的研究——Ⅰ.酶的纯化

用亲和层析法纯化眼镜蛇毒胆碱酯酶440倍左右,比活力达到203毫克分子底物水解/小时/毫克蛋白。亲和吸附剂的制备是以琼脂糖凝胶4B为载体,己二胺为“手臂”,(间-羧基苯基)-二甲基乙基碘化铵为配基制成,不同长度的“手臂”对酶的吸附有影响,疏水性强的“手臂”对酶的吸附也强。在纯化过程中,胆碱酯酶在凝胶电泳中始终保持6条条带,可能是它的同工酶。兔抗眼镜蛇蛇毒血清对猪脑尾状核乙酰胆碱酯酶、黄姑鱼肌肉胆碱酯酶无免疫交叉反应,对蛇毒胆碱酯酶形成络合物后仍能表现胆碱酯酶的活力,说明酶的抗原决定簇和活性中心不在同一部位。     

定向合成化学配基亲和层析纯化碱性磷酸酶

设计合成一种含有碱性磷酸酶抑制剂－对氨基苄基磷酸的化学配基并将其耦联到琼脂糖凝胶上,制备出新型的亲和层析介质,分离纯化从小牛肠中提取的碱性磷酸酶。经过对不同配基浓度吸附剂碱性酸酶吸附容量的考察,确定配基浓度为６μｍｏｌ／ｇ的吸附剂具有最高的酰选择性。     

浙江产眼镜蛇毒胆碱酯酶的研究——Ⅰ.酶的纯化

用亲和层析法纯化眼镜蛇毒胆碱酯酶440倍左右,比活力达到203毫克分子底物水解/小时/毫克蛋白。亲和吸附剂的制备是以琼脂糖凝胶4B 为载体,己二胺为“手臂”,(间-羧基苯基)-二甲基乙基碘化铵为配基制成,不同长度的“手臂”对酶的吸附有影响,疏水性强的“手臂”对酶的吸附也强。在纯化过程中,胆碱酯酶在凝胶电泳中始终保持6条条带,可能是它的同工酶。兔抗眼镜蛇蛇毒血清对猪脑尾状核乙酰胆碱酯酶、黄姑鱼肌肉胆碱酯酶无免疫交叉反应,对蛇毒胆碱酯酶形成络合物后仍能表现胆碱酯酶的活力,说明酶的抗原决定簇和活性中心不在同一部位。     

氨基酰-tRNA合成酶与神经退行性疾病

氨基酰-tRNA合成酶催化tRNA的氨基酰化反应为生物体内的蛋白质合成提供原料.这类古老且保守的蛋白质分子在高等生物复杂的细胞分子网络中分化出的新功能是目前人们关注的焦点.近期在对一些患有神经退行性疾病的病人和小鼠模型的研究中发现,位于酪氨酰-tRNA合成酶、甘氨酰-tRNA合成酶和丙氨酰-tRNA合成酶上的突变,可分别导致DI腓骨肌萎缩症(Charcot-Marie-Toothdisease,CMT)C型,腓骨肌萎缩症2D型及小脑浦肯雅(Purkinje)细胞丢失.初步的致病机理研究表明,致病突变对这3种酶的影响各不相同:酪氨酰-tRNA合成酶的氨基酰化催化能力受到影响,甘氨酰-tRNA合成酶受影响的可能是一种未知的新功能,而丙氨酰-tRNA合成酶受影响的则是它的编校功能.这些研究结果揭示了氨基酰-tRNA合成酶涉及神经退行性疾病的广泛性和其机制的复杂性,并将促进对神经退行性疾病这一类常见疾病的病理和治疗方法的研究.     

辅酶Ⅱ-亲和胶的制备和应用

亲和层析是一种特异性较高的分离纯化方法,目前已广泛应用于多种生物物质的分离纯化。NADP是生物体内许多酶的辅酶,是一种很好的亲和配基。因此,将NADP结合到不溶性介质上,可得到一种分离纯化有关酶及蛋白质的亲和胶。本文介绍NADPSepharose 4B胶的合成方法及其应用。     

注射依赖cAMP的蛋白激酶催化亚基加速胚胎内细胞间连接通讯的发育(英文)

本研究以爪蟾胚胎内胚层细胞间连接通讯发育的时程为指标,观察了cAMP和依赖cAMP的蛋白激酶催化亚基对这一发育的影响。将依赖cAMP的蛋白激酶催化亚基注射入爪蟾胚胎四细胞期的每一个细胞可使该胚胎内胚层细胞间连接通讯的发育明显加快,提示在正常状态下这一发育的进程是受细胞内依赖cAMP的磷酸化水平的制约。但用双丁酰cAMP和磷酸二酯酶抑制剂对胚胎进行培育,或将cAMP和磷酸二酯酶抑制剂注射入胚胎细胞,对这一发育并无影响,可能是由于这些胚胎细胞内依赖cAMP的蛋白激酶的实际有效含量较低而cAMP含量较高所致。注射这种蛋白激酶催化亚基所诱导的胚胎细胞间连接通讯在注射后约8.5小时出现。这一时间比前人在哺乳动物细胞培养中用cAMP或必需的信使RNA诱导出细胞间连接通讯所需要的时间(2—4小时)长得多,提示在胚胎中依赖cAMP的磷酸化对细胞间连接通讯发育的作用是从RNA转录的水平上开始的。     

不同年龄小白鼠全脑细胞质氨酰tRNA合成酶活力的比较

从不同年龄(20天,30天,1年)的小白鼠全脑制得细胞质混合氨酰tRNA合成酶。用异源体系(即用酵母tRNA和小白鼠全脑氨酰tRNA合成酶)测定了氨酰tRNA合成酶分别载运~3H标记的Asp、Gly、Glu、Lys和Ala的活力。结果表明除未检出tRNA~(Glu)的合成酶活力外,对其余四种氨基酸都有明显的活力,特别是年龄20天小白鼠的氨酰tRNA合成酶对~3H-Gly具有高达35％的载运活力。对~3H-Gly、~3H-Lys和~3H-Ala的载运活力有随增龄而下降的趋势,但对~3H-Asp的载运活力则随年龄增长而增高。     

布氏锥虫苯丙氨酰-tRNA合成酶在大肠杆菌中的克隆、表达、纯化及活性测定

苯丙氨酰-tRNA合成酶是布氏锥虫蛋白合成过程中的一类重要酶,以其为靶点的抑制剂可能发展成为新一代的抗锥虫药物,但此前并没有分离锥虫苯丙氨酸-tRNA合成酶的报道。本研究用大肠杆菌成功克隆表达并纯化了布氏锥虫苯丙氨酰-tRNA合成酶并进行了活性测定。首先通过PCR方法从布氏锥虫细胞基因组中分别扩增出苯丙氨酰-tRNA合成酶的α亚基、β亚基的基因,依次克隆入pCOLADuet共表达载体,然后在大肠杆菌BL21(DE3)RIPL中进行了成功表达,并采用Ni-Bind亲和层析对其进行了纯化,最后用免疫印迹进行了鉴定。此外还采用放射性同位素方法进行了酶活性测定,这为下一步进行布氏锥虫苯丙氨酰-tRNA合成酶抑制物的设计和体外筛选奠定了良好的基础。     

大肠杆菌精氨酰—tRNA合成酶变种ArgRS381KA的基本性质

本文研究了Ｌｙ３８１变为Ａｌａ的精氨酰－ｔＲＮＡ合成酶（ＡｒｇＲＳ）变种ＡｒｇＲＳ３８１ＫＡ的最适ｐＨ和稳态动力学性质;比较了此酶与天然酶ＡｒｇＲＳ的荧光光谱性质和热稳定性。实验结果表明ＡｒｇＲＳ３８１ＫＡ的氨酰化活力和ＡＴＰ￣ＰＰｉ交换活力的最适ｐＨ分别为８．０和７．０,与天然酶相同;ＡｒｇＲＳ３８１ＫＡ的氨酰化活力对精氨酸、ＡＴＰ和ｔＲＮＡ＾Ａｒｇ的Ｋｍ分别为１２μｍｏｌ／Ｌ、０．３ｍｍｏｌ／     

亲和层析法分离纯化猪肺血管紧张素转换酶

亲和胶合成实验以双环氧化合物1,4-丁二醇-2-缩水甘油醚(1,4-butanediol diglycidyl ether)为活化体及连接臂,在硼氢化钠(NaBH)存在的碱性条件下,将载体Sepharose CL―4B与雷诺普利(lisinopril)共价连接在一起,成功合成亲和层析胶,并利用亲和层析胶对猪肺血管紧张素转换酶（angiotensin converting enzyme, ACE）进行分离提纯.猪肺组织匀浆经1.6～2.6 mol/L硫酸铵分级沉淀、透析平衡、亲和柱分离等步骤,从200 g猪肺中提纯得到0.79 mg ACE蛋白,酶活力回收11.9％,比活力38.8 U/mg.与层析前的酶液比较,亲和层析一步提纯可达264倍;与肺匀浆液比较提纯达808倍.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳可见,提纯的猪肺ACE为一条带,分子质量约为180 ku.     

一种插入116个氨基酸的亮氨酰—tRNA合成酶具有高酶活力

大肠杆菌亮氨酰 tRNA合成酶 (LeuRS)是第 1类氨基酰 tRNA合成酶 ,由 860个氨基酸残基组成 ,催化亮氨酸tRNA的亮氨酰化。研究发现 ,在它的CP1结构域内 3 68和 3 69间的肽键间插入 2 5 3～ 3 68的肽段 ,该插入变种的酶仍具有酶活力 ,取名为LeuRS C。由于这一插入变种的不稳定性 ,构建了His6 LeuRS C的表达质粒 ,用Ni NTA柱亲和层析的方法进行纯化。发现His6 LeuRS C虽然插入了 116个氨基酸残基 ,但仍具有全部的天然LeuRS的活力。测定了His6 LeuRS C的酶学动力学常数 ,比较了它与天然LeuRS的从CD光谱得到的二级结构和热稳定性