家蝇变应原Tropomyosin基因的克隆、序列分析及诱导表达

对家蝇变应原原肌球蛋白(Tropomyosin)基因进行同源克隆,序列分析;构建原核表达载体并在大肠杆菌中表达。从家蝇幼虫cDNA文库中筛选获得Tropomyosin基因。以该基因的cDNA文库质粒为模板,进行PCR扩增,获得家蝇Tropomyosin完整编码序列。运用生物信息学方法对该基因及其编码蛋白的基本理化性质、信号肽、二级结构、三级结构、抗原表位和亚细胞定位等方面进行预测和分析。构建pEASY-E1-Tropomyosin重组质粒,转化到大肠杆菌OrigamiB(DE3)中进行诱导表达。Tropomyosin基因ORF全长828 bp,编码275个氨基酸,理论分子量31.6 kD;等电点为4.65,具有Tropomyosin家族的蛋白保守结构域。成功构建重组原核表达pEASY-E1-Tropomyosin并诱导表达重组蛋白。     

家蝇Thymosin(THY)基因的克隆及原核表达

采用EST测序技术从构建的家蝇(Musca domestica)幼虫c DNA质粒文库中筛选到胸腺肽(Thymosin,THY)基因,以该基因的c DNA文库质粒为模板,设计引物,通过PCR扩增,测序鉴定,获得THY基因完整编码序列。运用生物信息学方法对该基因及其编码蛋白的基本理化性质、信号肽和亚细胞定位等方面进行预测和分析。构建p ET-28a(+)-THY重组质粒,转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达。研究结果表明,THY基因ORF全长384 bp,编码127个氨基酸,理论分子量14.3 k D,等电点为5.22,具有THY家族的蛋白保守结构域。构建重组原核质粒p ET-28a(+)-THY,经IPTG诱导,蛋白在大肠杆菌中获得表达,经亲和层析柱纯化获得目的蛋白,Western blot检测发现纯化的目的蛋白大小正确。     

家蝇肽聚糖识别蛋白(PGRP-SA)的克隆表达及细菌结合研究

对家蝇PGRP-SA基因进行克隆表达以及研究其重组蛋白与细菌结合能力。从构建的家蝇(Musca domestica)幼虫cDNA质粒文库中筛选到PGRP-SA基因,以cDNA质粒为模板设计引物,通过PCR扩增,获得PGRP-SA基因完整编码序列。运用生物信息学方法对该基因及其编码蛋白进行预测和分析。构建pET-28a(+)-PGRP-SA重组质粒,转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达及蛋白纯化。利用半定量RT-PCR检测PGRP-SA在家蝇3龄幼虫不同组织中的表达量差异。PGRP-SA重组蛋白进行微生物结合实验。结果表明,PGRP-SA基因ORF全长615 bp,编码204个氨基酸,理论分子量22.8 k D,等电点9.11,具有保守的PGRP结构域。成功构建了pET-28a(+)-PGRP-SA重组质粒,蛋白经IPTG诱导后在大肠杆菌中获得表达,经亲和层析柱纯化获得目的蛋白,利用Western blot检测证明纯化蛋白与预期大小相符。PGRP-SA在家蝇3龄幼虫血淋巴、脂肪体、前肠、中肠、气管、马氏管都有表达,血淋巴组织中表达量最高,后肠无表达,由此说明PGRP-SA基因的表达具有一定的组织性。PGRP-SA重组蛋白能与金黄色葡萄球菌和大肠杆菌结合,与白色念珠菌不能结合。成功表达及纯化家蝇PGRP-SA蛋白,证实家蝇PGRP-SA能与金黄色葡萄球菌和大肠杆菌结合。     

铜绿假单胞菌外膜蛋白OprⅠ原核表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达

目的:构建并鉴定铜绿假单胞菌(Pa)外膜蛋白OprⅠ重组质粒p GEX-OprⅠ,研究该重组质粒在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达。方法:PCR扩增OprⅠ抗原编码基因并将其定向克隆至原核表达载体p GEX-1λT,构建重组质粒p GEX-OprⅠ;将p GEX-OprⅠ电穿孔转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western印迹分析并鉴定表达产物。结果:扩增出194 bp的OprⅠ抗原编码基因;双酶切和PCR鉴定证实OprⅠ基因克隆入p GEX-1λT,并且p GEX-OprⅠ成功转入大肠杆菌BL21(DE3);SDS-PAGE显示重组大肠杆菌BL21(p GEX-OprⅠ)的表达产物为相对分子质量约32 000的GST-OprⅠ融合蛋白,其表达量约占菌体总蛋白的20%;Western印迹证实该融合蛋白能被Pa感染的鼠血清特异性识别。结论:构建了重组质粒p GEX-OprⅠ,其在大肠杆菌BL21(DE3)中表达具有抗原性的融合蛋白。     

金黄色葡萄球菌特异性PCR检测靶点的自动化筛选

从水母雪莲Saussurea medusa Maxim. cDNA文库中得到一段查尔酮合酶基因 (SmCHS) 片段,然后通过RT-PCR得到完整的查尔酮合酶基因cDNA。序列分析表明SmCHS全长1 313 bp,其开放阅读框为1 170 bp,编码389个氨基酸,预测表达蛋白的分子量为43 kDa。构建原核表达质粒pET28a(+)-SmCHS,重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),获得表达菌株。经IPTG诱导表达后,对表达产物进行SDS-PAGE分析,结果显示,表达的融合蛋白以部分可溶的形式存在。     

家蝇溶菌酶MDLZM2基因的克隆、序列分析及原核表达

对家蝇溶菌酶(Musca domestica lysozyme,MDLZM2)基因进行克隆、序列分析,构建原核表达载体并在大肠杆菌中表达。从Gen Bank家蝇基因组中筛选获得MDLZM2基因。以该基因的序列设计引物,进行PCR扩增,测序分析获得该基因完整编码序列。运用生物信息学方法对该基因及其编码蛋白的基本理化性质、信号肽、二级结构、三级结构和保守结构域等方面进行预测和分析。构建p EASY-E1-MDLZM2重组质粒,转化到大肠杆菌BL21(DE3)p Lys S Chemically Competent Cell中进行诱导表达及纯化。结果表明MDLZM2基因ORF全长552 bp,编码183个氨基酸,理论分子量21.2 k Da;等电点为6.13,具有Lysozyme家族的蛋白保守结构域。成功构建重组原核表达p EASY-E1-MDLZM2并诱导表达、纯化重组蛋白,为进一步研究该蛋白的生物学及免疫学活性奠定了基础。     

人抗酶抑制因子-1的克隆与原核表达

目的:克隆人抗酶抑制因子-1(ornithine decarboxylase antizyme inhibitor-1,OAZI-1)cDNA,建立在大肠杆菌中原核表达并纯化人OAZI-1蛋白的实验技术。方法:巢式RT-PCR法从人A549总RNA中扩增人OAZI-1 cDNA并构建pET-28a/OAZI-1原核表达质粒。该质粒转化大肠杆菌原核表达菌BL21(DE3)后IPTG诱导表达。诱导表达出的重组蛋白用Ni-NTA树脂亲和层析纯化。SDS-PAGE和Western法检测重组OAZI-1蛋白的表达和纯化。结果:成功克隆出编码全长人OAZI-1的cDNA序列,并构建出原核表达质粒pET-28a/OAZI-1。DNA测序分析,重组质粒中的OAZI-1 cDNA无突变,与6×His标签框架对接正确。重组质粒转化入大肠杆菌表达菌BL21(DE3)中后,可用IPTG诱导表达出重组OAZI-1蛋白,该重组蛋白可用Ni-NTA树脂亲和层析纯化。结论:成功建立了人抗酶抑制因子的原核表达和纯化的实验方法,为后续OAZI-1的功能研究奠定了基础。     

蜘蛛大壶状腺丝蛋白基因的克隆和原核表达

以悦目金蛛(Argiope amoena)丝腺SMARTRACEcDNA文库为模板进行RT-PCR,克隆了1条大壶状腺丝蛋白(major ampullate spidroin,MaSp)基因cDNA序列。该条cDNA序列编码的氨基酸序列可区分为两部分(1)富含丙氨酸的片段和富含甘氨酸的片段相间排列构成的重复氨基酸序列区,并且富含甘氨酸的片段中有脯氨酸分布;(2)约100个氨基酸残基组成的C末端非重复氨基酸序列区。把MaSp基因cDNA序列亚克隆到质粒pET28b( )中,构建原核表达质粒pET28b( )-MaSp,表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达。SDS-PAGE、氨基酸组成测定和N末端氨基酸序列测定的结果表明,表达产物为重组MaSp,表达量约为40mg/L。还对C末端非重复氨基酸序列对重组MaSp在水媒介中溶解性的影响进行了探讨。     

荧光假单胞菌天冬氨酸转氨酶的基因克隆及其在大肠杆菌中的表达

采用克隆基因测序技术,从荧光假单胞菌GcM5-1A基因组文库中筛选到了天冬氨酸转氨酶的编码基因aspC。通过聚合酶链式反应（PCR）扩增目的基因,插入pET-15b构建重组表达质粒pET-15bAAT,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导天冬氨酸转氨酶在大肠杆菌中高效表达,利用亲和层析法初步分离纯化了重组蛋白。生物活性分析表明,纯化的重组天门冬氨酸转氨酶具有氨基转移活性。     

棉花咖啡酸-O-甲基转移酶基因的原核表达及蛋白纯化鉴定

为获得大量高纯度的GhCOMT2蛋白以便研究其功能和性质,以pMD18-GhCOMT2质粒为模板,PCR扩增GhCOMT2基因的cDNA编码区,构建原核表达载体pET-28a-GhCOMT2,经酶切鉴定并测序后转化到大肠杆菌BL21 (DE3)中进行诱导表达,并采用Western blotting方法鉴定表达产物.结果表明:在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中成功表达了与标签蛋白融合的GhCOMT2蛋白,大小约为40.062 kD,浓度为0.62 mg/mL.重组蛋白的最佳诱导条件为:0.2 mmol/L IPTG在16℃诱导12 h.重组蛋白以可溶形式高效表达,用蛋白标签亲和层析柱(His TrapTM HP)获得纯化重组蛋白,Western blotting分析表明其能与His多克隆抗体起特异性反应.     

家蝇核糖体蛋白S18基因的克隆及表达模式研究

旨为证实核糖体蛋白S18(Ribosomal protein S18,RPS18)基因在家蝇体内的表达稳定性。从构建家蝇幼虫c DNA文库中筛选到核糖体蛋白S18基因,以c DNA为模板,通过PCR扩增,获得RPS18基因完整编码序列(登录号:KT006855),运用生物信息学方法对该基因及其编码蛋白进行预测和分析。构建p ET28a/RPS18重组质粒,转化到大肠杆菌Transetta(DE3)中进行诱导表达及蛋白纯化,制备多克隆抗体并进行抗血清特异性分析。应用RT-PCR、q PCR及Western-blot从转录、翻译水平上分析RPS18基因在家蝇不同发育时期和三龄幼虫不同组织中的表达情况。结果表明,RPS18基因ORF全长459 bp,编码152个氨基酸,理论分子量为17 590.5 Da,等电点为10.48;将构建的重组质粒转入大肠杆菌Transetta(DE3)中,纯化得到RPS18蛋白;将该纯化蛋白免疫大白兔获得多克隆抗体,His单抗鉴定及抗血清特异性分析显示,其均可见单一条带;RT-PCR、q PCR及Westernblot分析表明,RPS18基因在家蝇不同发育时期及幼虫不同组织均能够稳定表达;综合分析表明,该基因在家蝇不同发育时期及幼虫不同组织均保持较好的表达稳定性。     

家蝇β-葡萄糖苷酶基因的克隆及重组表达

克隆家蝇内源性β-葡萄糖苷酶(beta-glucosidase,BG)基因并建立原核表达体系,检测其表达产物的活性,了解家蝇内源性BG酶特点,为进一步解释家蝇极强环境适应能力和发现新的种群控制措施提供分子生物学基础。以草地贪夜蛾等结构信息相对完整且研究较为透彻的6种代表性昆虫的BG酶基因序列为参照对象,利用同源克隆结合RACE-PCR的方法,从家蝇cDNA中克隆得到BG酶基因的全长cDNA序列并对其进行生物信息学分析。分别采用原核表达载体pET-28a(+)构建原核表达体系并在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中诱导表达BG酶基因的融合蛋白。采用七叶苷平板显色法和DNS法检测表达体系融合蛋白的酶活性,并对其性质进行初步的分析。家蝇体内克隆得到了长度为1933 bp的家蝇BG酶基因全长cDNA序列,推导其为562个氨基酸残基组成的蛋白多肽。重组原核质粒经诱导表达后,在65 kDa附近均出现特异性蛋白条带,证实重组质粒成功表达。重组表达的家蝇BG酶兼具内切β-1,4-葡聚糖酶、外切β-1,4-葡聚糖酶和BG的酶活性。家蝇BG酶是一种新的多功能纤维素酶,是昆虫纤维素酶研究的重要补充。     

人胱硫醚β合成酶原核表达纯化及鉴定

目的:构建人胱硫醚β合成酶(human cystathionineβ-synthase,hCBS)基因原核表达载体,在E.coli BL21(DE3)中表达,并进行纯化和酶活性检测。方法:以胰腺细胞cDNA文库为模板,采用聚合酶链式反应(PCR)扩增hCBS基因蛋白编码区的全序列,克隆入原核表达载体pET32a(+),构建重组质粒pET32a(+)-hCBS。经限制性内切酶双酶切及DNA序列分析鉴定目的基因后与人CBS基因(基因bank号:BT007154.1)完全一致,转入E.coli BL21(DE3)中,由IPTG诱导表达融合蛋白。结果:经SDS-PAGE、Western blot分析,证明诱导表达的蛋白为重组人CBS(rhCBS)。再由Ni-NTA树脂亲和层析,并脱盐冷冻干燥后获得重组rhCBS(约19 mg/L培养物),并测得其比活力约为57 kU/g。结论:成功地表达纯化出具有功能活性的重组蛋白rhCBS,为进一步研究该酶的相互作用蛋白以及其在生物学和临床科学的作用奠定了基础。     

重组马槟榔甜蛋白MabinlinⅡ在大肠杆菌中的表达

Mabinlin Ⅱ是我国所特有且唯一的植物甜蛋白,在体外至今没有得到具有甜味的基因表达产物.本文根据已知马槟榔甜蛋白的序列设计引物克隆Mabinlin Ⅱ基因,对基因进行剪切重组.将重组基因克隆至大肠杆菌表达载体pET-30a(+)中,构建了3个重组表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3),得到三株表达重组马槟榔甜蛋白的大肠杆菌工程菌.经IPTG诱导,3个重组MabinlinⅡ基因可在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达.     

水母雪莲查尔酮合酶基因的克隆、表达及酶活分析

从水母雪莲Saussurea medusa Maxim. cDNA文库中得到一段查尔酮合酶基因 (SmCHS) 片段,然后通过RT-PCR得到完整的查尔酮合酶基因cDNA。序列分析表明SmCHS全长1 313 bp,其开放阅读框为1 170 bp,编码389个氨基酸,预测表达蛋白的分子量为43 kDa。构建原核表达质粒pET28a(+)-SmCHS,重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),获得表达菌株。经IPTG诱导表达后,对表达产物进行SDS-PAGE分析,结果显示,表达的融合蛋白以部分可溶的形式存在。用Ni-NTA预装柱对融合蛋白进行亲和纯化,对纯化蛋白进行酶活检测,结果表明融合蛋白具有查尔酮合酶活性,可催化底物4-香豆酰辅酶A和丙二酰辅酶A缩合生成产物柚皮素查尔酮。     

不同载体表达的家蝇β-葡萄糖苷酶生物学活性比较

克隆家蝇内源性β-葡萄糖苷酶(beta-glucosidase,BG)基因,建立两种原核表达体系和一种真核表达体系,分别检测表达产物的活性,比较不同表达体系对其表达水平及重组蛋白酶学性质的影响,为进一步研究和利用家蝇BG酶奠定基础。本研究根据BG酶基因的cDNA序列设计引物扩增BG酶基因成熟肽的基因片段,分别采用表达载体pET-28a(+)和pEGX-4T-1构建原核表达体系并在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达。在65 kDa附近均出现特异性蛋白条带,进行Western Blotting鉴定证实重组质粒在其宿主菌E.coli BL21(DE3)中成功表达,命名为MDBG-1蛋白和MDBG-2蛋白。同时选用真核表达载体pPICZa A构建酵母分泌型表达体系在酵母细胞GS115中获得稳定的表达,将其命名为MDBG-3蛋白。采用七叶苷平板法和DNS法对三种表达体系所重组表达的蛋白进行酶活性鉴定和检测,显示3种表达体系所表达的融合蛋白均具有BG酶活性,其酶活力有所不同,且真核表达体系所表达的蛋白酶活性最高。本研究对家蝇β-葡萄糖苷酶基因表达的重组蛋白特性进行初步研究,为发现新的有效纤维素酶体系提供基础数据。     

手掌参γ-硫素的原核表达及纯化

目的：在原核系统中高效表达手掌参γ-硫素,并对其进行纯化。方法：通过筛选手掌参cDNA文库获得γ-硫素基因（gcthionin）,分别对其全长及信号肽编码序列缺失的cDNA片段进行PCR扩增,克隆入原核表达载体pET-32（a）,构建重组质粒pET-32（a）/gcthionin和pET-32（a）/Δgcthionin;测序鉴定后,转化大肠杆菌BL21（DE3）,经IPTG诱导表达融合蛋白;SDS-PAGE分析后,采用Ni-NTA亲和层析柱及凝胶柱对可溶性蛋白进行纯化,Western blotting鉴定。结果：gcthionin基因开放式阅读框全长225nt,编码一个由74个氨基酸残基组成的蛋白;带有信号肽的重组质粒在大肠杆菌BL21（DE3）中以包涵体形式表达;信号肽缺失可以极大地提高外源蛋白的可溶性,该可溶性产物经Ni-NTA柱及凝胶过滤后可获得纯度较高的蛋白,经Western blotting分析,相对分子质量约21.9×10^3处有明显的蛋白条带,与预期蛋白分子大小一致。结论：信号肽编码序列缺失的Δgcthionin可在大肠杆菌中可溶、高效表达。     

斑马鱼TK1基因的克隆表达

目的:克隆斑马鱼TK1基因的cDNA序列,并在大肠杆菌中诱导表达,对其产物进行生物学活性鉴定。方法:采用RT-PCR和RACE方法,克隆TK1的cDNA全长序列。表达载体在大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达。表达蛋白利用镍离子柱纯化。结果:获得TK1基因的cDNA全长序列,编码一个分子量为26kD的蛋白。结论:TK1融合蛋白在28℃条件表现出比较高的生物学活性,达到0.45 U/mg。     

四翅滨藜Osmotin-like Protein基因的克隆、序列分析及其原核表达北大核心CSCD

在构建四翅滨藜(Atriplex canescens)全长cDNA文库中通过随机克隆测序并进行EST分析基础上,得到四翅滨藜osmotin-like protein的1个cDNA序列,命名为AcOLP。AcOLPcDNA包含一个全长为687 bp完整开放阅读框,编码229个氨基酸,属于GH64-TLP-SF超家族,是一种病程相关5(PR-5)蛋白,其核酸序列与大洋洲滨藜(Atriplex nummularia)的osmotin-likeprotein基因的同源性为94%,对应编码氨基酸序列同源性为87%。将得到的序列提交GenBank,序列号为JN632587.1。与其他植物PR-5蛋白的氨基酸序列比对,AcOLP具有保守的半胱氨酸残基,与二硫键的形成有关。对AcOLP与其他植物的氨基酸序列的进化分析表明,其与大洋洲滨藜的亲缘关系较近。将AcOLP基因与原核表达载体pET-28a连接,进行融合表达,在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达出分子质量约29 kD的蛋白。     

A亚群禽白血病病毒囊膜基因gp85片段在大肠杆菌中的表达

将RAV－1囊膜基因gp85片段来克隆到表达质粒pET-21d( )中得到重组表达质粒pET-21d-RAV-1env(BelⅡ/SalⅠ）序列分析表明该插入片段的核苷酸序列和阅读框都与RAV－1囊膜基因相应序列相同。用其转化大肠杆菌BL21（DE）3并经IPTG诱导,SDS－PAGE分析表明RAV－1囊膜基因融合蛋白表达产物约20kD,与理论值相符;IPTG诱导起始时间比诱持续时间对表达量的影响更大。