印度木薯花叶双生病毒外壳蛋白的研究 I．外壳蛋白及其基因的一级结构

在双生病毒DNA中存在保守序列5 TAATATTAC3’,推测也存在于印度木薯花叶双生病毒(tcMv)基因组中。以此序列的互补链为引物,合成ICMV eDNA．cDNA的主带大小为2．7kb。测定了外壳蛋白的基因序列共768个核苷酸,并分柝了外壳蛋白的一级结构。ICMV外亮蛋白由20种氨基酸的256个残基组成,其中脂肪族氨基酸含量高,碱性氢基酸含量高于酸性氨基酸,含硫氨基酸和亚基酸的含量较低。比较ICMV与7种木薯粉虱(Bemi-ria tabaci)传播的双生病毒外壳蛋白,其N-末端变异程变大,而C-末端基本恒定,中部存在3段较长的保守序列。     

葡萄扇叶病毒外壳蛋白基因的克隆,序列分析及其在大肠杆菌中的表达

通过RT-PCR方法把葡萄扇叶病毒(GFLV)外壳蛋白基因(CP gene)分成两部分扩增,扩增产物克隆入pGEM-5Zf(+)载体,并通过BglⅢ位点连接成一完整的外壳蛋白基因,通过序列分析测得全长外壳蛋白基因为1512bp,编码504个AA＇s,与国外株系GFLV-F13相比,核苷酸同源性为88.4％,氨基酸同源性为95.8％。并且这一外壳蛋白基因在大肠杆菌E.coli DH-5α中得到了表达。     

大豆花叶病毒外壳蛋白基因的克隆和其在大肠杆菌中的表达

通过多聚酶连锁反应(PCR),我们合成了包括病毒外壳蛋白基因在内的病毒基因组3’端区域,并完成了其全部序列分析,比较SMV(北京分离物)和SMv—N株的序列发现;外壳蛋白基因的核苷酸序列同源性达93．D％,其氨氢基酸序列同源性高达98．5％,就基因组3,端非编码序列而言,其同源性达88．8％。Western b1ot分析结果表明所克隆的cDNA片段在大肠杆菌JMl07中能表达正常的病毒外壳蛋白。     

外壳蛋白羧端序列缺失对烟草花叶病毒侵染性的影响

对野生型烟草花叶病毒(TMV-U1)的外壳蛋白羧端序列进行系列缺失突变,观察到TMV-U1株系的外壳蛋白羧端序列缺失6个氨基酸(保留152个氨基酸),仍能较强系统侵染烟草并高水平表达外壳蛋白,且能在新生叶里复制大量完整的病毒粒子。该研究结果表明：外壳蛋白羧端6个氨基酸序列并非烟草花叶病毒感染和复制所必需,并对利用外壳蛋白羧端缺失型病毒载体表达外源多肽具有一定的启示性。     

侵染人参果的马铃薯M病毒基因组全序列分析

测定了侵染人参果的马铃薯M病毒(PVMCh)基因组全序列。线状、单链正义RNA全长8526bp,含6个开读框(ORF),具麝香石竹潜隐病毒属(Genus Carlavirus)典型结构特征。序列比较表明它与其他PVM分离物各基因核苷酸和编码蛋白氨基酸序列同源性分别为62.5%～9702%和60.9%～97.4%,其中CP基因最保守,而TGB3基因变异最大。系统进化树分析表明美国爱达荷州马铃薯分离物(PVMId) (AF023877)为PVM的一个远缘株系,而其他4个PVM分离物的成簇在外壳蛋白(Coat protein, CP)和核酸结合蛋白(Nucleic acid binding protein, NABP)区域略有差异。这是PVM在人参果上侵染的首次报道。     

水稻矮缩病毒最外层外壳蛋白基因(S_2)cDNA克隆、序列分析及其在大肠杆菌中的表达

从水稻矮缩病毒（Ｒｉｃｅｄｗａｒｆｖｉｒｕｓ,ＲＤＶ）中国福建分离物中克隆分离了最外层外壳蛋白基因（Ｓ２）全长ｃＤＮＡ,并对其进行了序列分析,结果表明ＲＤＶＳ２ｃＤＮＡ全长３５１２ｂｐ,仅含一个３３４８ｂｐ的阅读框架,编码一个含有１１１６个氨基酸的蛋白（Ｐ２）。与基因库中已知基因序列比较,发现它与日本ＲＤＶＨ株系相应片段的核苷酸和氨基酸同源率分别为９４６％和９５４％,与轮状病毒ＶＰ２氨基酸序列有一定的同源性。Ｓ２核苷酸序列二级结构预测结果表明,５’端５０个核苷酸的二级结构为一个发夹结构和一个茎环结构。Ｐ２有４个富含亮氨酸的区域,位于Ｎ端亲水区域的１０个氨基酸（ＡＡ６９～７８）残基形成一个α螺旋,这些特点均与轮状病毒ＶＰ２的结构特征相似。ＳＤＳＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹分析表明在大肠杆菌中分段高效表达了Ｓ２编码蛋白的Ｎ端和Ｃ端。     

马铃薯X病毒外壳蛋白的表达水平与变偶密码子使用频率的相关性

把经密码子修饰的马铃薯X病毒（Potato Virus X, PVX）外壳蛋白（Coat Protein, CP）基因和未修饰的野生型外壳蛋白基因与CaMV 35S启动子融合后,构建成相应的植物表达载体,利用农杆菌介导转化烟草。分别对修饰CP和野生CP的转基因烟草进行Western blot和ELISA分析,结果表明经密码子修饰的PVX外壳蛋白的表达量是野生型蛋白表达量的1/3～1/5。Northern blot结果表明修饰和未修饰的外壳蛋白在转录水平上是一致的。以上结果暗示外源基因中稀有密码子的数量可能是限制外源基因表达的一个因素。改变基因中稀有密码子的数量有可能成为控制基因表达的一种有效途径。     

大麦黄矮病毒GPV外壳蛋白基因序列分析及其植物表达质粒的构建

大麦黄矮病毒GPV株系是我国特有的一个株系,与国外已报道的大麦黄矮病毒MAV,PAV,SGV,RPV和RMY在血清学上无反应.通过对GPV.外壳蛋白基因的序列分析,明确了病毒的外壳蛋白基因由603个核苷酸组成,编码201个氨基酸,分子量为22218ku.同MAV,PAV,RPV株系一样,在GPV外壳蛋白基因框架中(ORF)含有1个Vpg框架结构,分子量为17024ku.外壳蛋白基因序列同源性比较结果显示,GPV株系和RPV株系同源性较高,核苷酸和氨基酸的同源性分别为83.7%和77.5%.而与PAV和MAV株系同源性较低,核苷酸和氨基酸的同源性分别为56.9%,53.2%和44.1%,43.8%.按照GPV外壳蛋白基因序列,设计寡聚核苷酸引物,通过RT-PCR反应,得到GPV外壳蛋白基因全长cDNA,克隆到表达质粒,构建了高等植物表达载体pPPI1,pPPI2和pPPI5.     

大蒜花叶病毒外壳蛋白基因cDNA的克隆和序列分析

我们从自然发病的大蒜中分离得到了大蒜花叶病毒。以其基因组ＲＮＡ为模板合成了３＇末端部分ｃＤＮＡ。从中选出一批插入片段在２．０ｋｂ以上的重组克隆,经Ｎｏｒｔｈｅｒｎ点杂交分析证实了所选克隆与基因组ＲＮＡ同源。通过对若干个克隆的插入片段两端部分序列的测定,选出一个克隆ｐＧＭ４９５,其插入片段的长度约为２．４ｋｂ,３′末端存有一个Ｐｏｌｙ（Ａ）结构,它应包含了编码该病毒外壳蛋白全部序列。序列测定的结果表明,这个ｃＤＮＡ片段全长为２３７９ｂｐ,其中含有与酶切图谱分析结果相符的ＥｅｏＲＩ、ＰｓｔＩ及ＢａｍＨＩ酶切位点。第一个终止密码子ＴＡＡ与３′ｇ末端相距２６４ｂｐ,我们根据碱基序列推定的氨基酸序列与其它已发表的Ｐｏｔｙｖｉｒｕｓ的外壳蛋白氨基酸序列以及外壳蛋白翻译后加工的蛋白酶专一切点相比较后推测,编码该病毒外壳蛋白序列可能起始于３′末端上游的１１７０ｂｐ处,共编码３０２个氨基酸,其分子量为３６ｋＤ,略大于ＳＤＳ－ＰＡＧＥ所测定的３３ｋＤ,非编码区域长２６４ｂｐ,富含ＡＴ,并有多个终止密码子的存在。趾３′末端３２～２７ｂｐ处有一个ＡＡＴＡＡ序列。     

马铃薯Y病毒外壳蛋白基因的克隆及序列分析

本文报道应用聚合酶链式反应(PCR)技术,在体外扩增马铃薯 Y 病毒外壳蛋白基因及其克隆和序列分析的结果。病毒 RNA 从马铃薯 Y 病毒感染的烟草叶片中提取,用合成的PCR 3引物及 AMV 逆转录酶合成了单链的 cDNA。利用 PCR 技术,经30个循玎的扩增。得到了一特异的0.8kb 片段。克隆后对此片段进行了限制性内切酶物理图谱分析,并测定了其全序列。实验结果证明,我们克隆到的是完整的马铃薯 Y 病毒的外壳蛋白基因。与国外报道的马铃薯 Y 病毒 N 株相比,其核苷酸序列及推测的氨基酸序列的同源率分别为97.8%和97%。将该基因导入马铃薯以期获得抗 Y 病毒马铃薯的工作正在进行。本文还对 PCR 技术用于扩增植物 RNA 病毒的方法以及用基因工程方法培育抗病毒作物新品种的可行性等进行了讨论。     

SARS病毒S和N蛋白抗原表位的基因合成、融合表达及纯化鉴定

通过计算机分析SARS病毒N蛋白和S蛋白的氨基酸序列 ,初步确定含强抗原表位的N蛋白片段和S蛋白片段 ,共 5 6 0个氨基酸。选择真核和原核生物均偏爱的密码子 ,化学合成全新的SARS病毒N蛋白片段和S蛋白片段的基因序列 ,利用基因工程技术将两个基因片段串联 ,克隆至质粒Pet2 8a(+)内的NcoⅠ/EcoRⅠ位点 ,表达S蛋白片段和N蛋白片段的融合蛋白。将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3) ,筛选获得了高效表达SARS病毒S蛋白片段和N蛋白片段融合蛋白的工程菌 ,表达的SARS病毒的融合蛋白约占菌体蛋白总量的 30 %左右 ,部分以可溶性形式存在。经离子交换柱和反相高压液相纯化获得了表达的融合蛋白 ,经初步鉴定 ,显示该融合蛋白有较好的抗原性和特异性.     

禾谷缢管蚜体内的病毒结合蛋白基因的克隆与原核表达

利用一对特异性引物,用PCR的方法从禾谷缢管蚜体内扩增出了病毒结合蛋白基因,序列测定结果表明其长度 为1647 bp,编码548个氨基酸,与GenBank中的禾谷缢管蚜美国生物型Buchnera groELNT核苷酸序列同源性为97%,氨基酸同源性为97.4%。构建了2个原核表达载体并进行表达得到了69kD融合蛋白和63kD的非融合蛋白。     

芒果生长素反应因子类蛋白的cDNA克隆和表达

通过SSH法获得了一个与不定根形成相关的差异表达的cDNA片段,其推导的氨基酸序列与拟南芥的生长素反应因子(ARF)类蛋白具有较大的同源性,因此将它命名为MiARF。用所设计的基因特异引物进行3′RACE扩增获得包含完整读码框架(ORF)的MiARF1（GenBank登录号为AY255705）和MiARF2（GenBank登录号为AY300808）。MiARF1全长为3272bp,其中,ORF含2523bp,5′非翻译区（5′UTR）含285bp, 3′非翻译区(3′UTR)含464bp。由该序列所推导的氨基酸序列与拟南芥ARF2（BAB10162）的ID值为64%, E值为0,在DNA结合区域（DBD）、III和IV区域的同源性更高,ID值均大于80%。MiARF2cDNA全长为1474bp,其中ORF含981bp,5′非翻译区含285bp, 3′非翻译区含208bp,由该序列所推导的氨基酸序列与拟南芥ARF2（BAB10162）的ID值为84%,E值为e-151。 MiARF2仅具有DBD保守区并与MiARF1的基本相同,但缺乏III和IV区域。Virtural Northern 杂交表明：MiARF2在生根的组织中表达水平高, 而在非生根的组织中未见表达;MiARF1在生根及非生根的组织中均有表达。     

两株大蒜病毒外壳蛋白基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

利用建立cDNA库的方法 ,通过RT PCR分别扩增和克隆了感染我国天津地区大蒜的大蒜花叶病毒 (GMVc)和大蒜潜隐病毒 (GLVc)的外壳蛋白 (CP)基因 ,并对其分别在原核细胞中进行了诱导表达和表达产物的分析。克隆基因的序列测定与分析表明 ,GMVc的CP基因全长 867个核苷酸 ,编码 2 89个氨基酸 ,与报道的一株GMV的核苷酸和氨基酸的同源性分别为 88.5%和 97.2 % ,属于马铃薯Y病毒属 (Potyvirus)的成员 ;GLVc的CP基因全长 885个核苷酸 ,编码 2.94个氨基酸 ,与报道的一株GLV的核苷酸和氨基酸同源率分别为 73.6%和 90.9% ,属于香石竹潜隐病毒属 (Carlavirus)的成员 ;克隆基因的表达产物经SDS PAGE分析表明 ,GM Vc和GLVc的外壳蛋白分别约 32kD和 34kD ,与预测的结果一致。本实验结果对感染我国大蒜的病毒进行分子水平的确切诊断、分类和调查奠定了基础 ,将对大蒜病毒病的防治与脱毒大蒜的生产具有重要的意义。     

鼠伤寒沙门氏菌PurR阻遏蛋白Trp-147, Gln-218和Gln-292氨基酸残基的功能分析

对从purR超阻遏突变体(purR^s)出发分离的purR(am)突变体进行了purR编码区DNA片段的克隆和测序,确定了6个purR(am)突变体的am突变位点,其中3个位于C⁹³³(Gln-218),2个位于G⁷²¹(Trp-147),1个位于C¹¹⁵⁵(Gln-292).进而对位于PurR辅阻遏物结合区的这3个不同am位点,通过引入tRNA抑制基因(sup),进行了5种不同氨基酸取代,并测定了对PurR阻遏蛋白功能的影响.结果显示,Cys,Glu,Gly,His和Arg5种氨基酸分别取代Trp-147,都不能明显恢复purR阻遏蛋白的调节功能,证实了Trp-147是影响PurR调节功能的重要氨基酸残基.Cys等5种氨基酸对Gln-292的取代也不能恢复PurR阻遏蛋白的调节功能,证明了Gln-292也是影响PurR阻遏蛋白调节功能的重要氨基酸.     

中国番茄黄化曲叶病毒——双生病毒的一个新种

用 2 0个单抗对中国番茄黄化曲叶病毒 (TYLCV CHI)和其他双生病毒进行了测定 ,在血清学水平上证实中国番茄黄化曲叶病毒与中国烟草曲叶病毒有较大的亲缘关系 ;同时报道了TYLCV CHI部分共同区、外壳蛋白N端基因和AV1基因的PCR及其克隆和序列分析 ,从分子水平上证实TYLCV CHI与世界各地的其他双生病毒不同 ,是一种新的粉虱传双生病毒     

长叶车前花叶病毒上海分离株(HRVsh)外壳蛋白免疫多肽的研究

长叶车前花叶病毒上海分离株(HRVsh)的外壳蛋白中含有4个甲硫氨酸残基,本文采用溴化氰裂解,并结合葡聚糖凝胶G-100柱层析、高压纸电泳及纸层析等方法,分离纯化了5个多肽片段,经~(125)I标记抗体对免疫多肽的鉴定,表明其中二段多肽与~(125)-IgG的结合能力接近完整病毒的水平,说明这二段多肽具有HRVsh的抗原专一性,决定HRVsh抗原性的抗原决定簇主要分布于这二个肽段中。 外壳蛋白的胰蛋白酶酶解肽谱及多肽氨基酸序列分析的结果,表明HRVsh和HRV标准株系间在氨基酸序列上有很大相似性,这就决定了两者密切的血清学亲缘关系。     

南方菜豆花叶病毒外壳蛋白基因序列的分析

用重组DNA技术及序列分析法测定了南方菜豆花叶病毒RNA基因组3′端1,000个碱基的序列,以及由此序列推导出的整个外壳蛋白的氨基酸顺序,它与巳报导的基本上一致。介绍了用DNA的寡核苷酸水解混合物作为起始引物,以3′端不含PolyA尾巴且不能加上PolyA的病毒RNA作为模板合成互补DNA,及进一步无性繁殖此cDNA的方法。