大灰象甲实时定量PCR内参基因的筛选

【目的】筛选出适合分析大灰象甲Sympiezomias velatus成虫不同组织中基因表达水平的内参基因。【方法】利用转录组测序技术获得大灰象甲管家基因序列作为候选内参基因,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术分析候选基因在大灰象甲雌雄成虫触角、头、胸、腹和足中的表达量;并利用geNorm, NormFinder和BestKeeper软件及在线工具RefFinder评价候选基因的表达稳定性。以大灰象甲气味结合蛋白1(odorant bindng protein 1, OBP1)基因为目标基因验证候选基因在大灰象甲成虫不同组织中的表达稳定性。【结果】基于大灰象甲转录组数据首次鉴定得到β-肌动蛋白基因(ACT)、3-磷酸甘油醛脱氢酶基因(GAPDH)、18S核糖体RNA基因(18S rRNA)、60S核糖体蛋白L12基因(RPL12)、60S核糖体蛋白L32基因(RPL32)、40S核糖体蛋白S20基因(RPS20)、延伸因子2基因(EF2)、α-微管蛋白基因(TUA)和β-微管蛋白基因(TUB)共9个管家基因序列。geNorm分析结果显示,RPL12和RPS20是最稳定表达的内参基因,而BestKeeper和NormFinder分析结果显示最稳定表达的内参基因分别是TUA和TUB。综合各分析方法得出9个候选基因中TUB,TUA,RPS20和RPL12是最稳定表达的内参基因,而18S rRNA,ACT和GAPDH这3个广泛应用的内参基因则表现出最低的表达稳定性。最后以OBP1为目标基因对稳定性不同的4个候选基因进行稳定性验证,发现以TUB和RPL12为内参基因,OBP1在成虫不同组织之间的表达模式基本一致;而以RPL32为内参基因,表达模式与应用TUB作为内参基因时稍有不同,使用18S rRNA作为内参基因得到的OBP1表达模式则与应用TUB作为内参基因时的完全不一致。【结论】TUB,TUA,RPS20和RPL12可以作为分析大灰象甲成虫不同组织中基因表达水平的内参基因,为后续基因表达研究奠定了基础。     

褐飞虱热胁迫下内参基因的筛选及热激蛋白基因表达分析（英文）

【目的】褐飞虱Nilaparvata lugens(Stl)是为害水稻的重要害虫之一,温度是影响其暴发、迁飞的主要环境因子之一。本研究旨在探讨研究褐飞虱对高温胁迫适应性的热激蛋白基因表达调控模式。【方法】分别以不同的高温(30℃~40℃)处理褐飞虱雌、雄虫1 h和2 h,利用荧光定量PCR技术检测其体内的β-actin 1,β-actin2,β-actin3,28S rRNA,18S rRNA和α-2-tubulin 6个内参基因的表达量,用geN orm和BestK eeper软件分析确定最稳定表达的内参基因,并检测热胁迫后hsp70和hsp90基因在处理褐飞虱成虫体内的表达模式。【结果】geN orm软件分析结果表明,热胁迫后褐飞虱内参基因稳定性在雌虫体内为:β-actin1=β-actin328S rRNAα-2-tubulin18S rRNAβ-actin2;在雄虫体内为:β-actin1=β-actin3α-2-tubulin28S rRNA18S rRNAβ-actin2。BestK eeper软件分析结果显示,在热胁迫的雌、雄虫体内β-actin1均最稳定,18S rRNA次之,β-actin2最不稳定。两种软件分析结果基本一致。以β-actin1为校正内参基因,荧光定量PCR分析hsp70和hsp90在不同热胁迫条件下的表达模式,结果表明,各高温处理下hsp70表达量与对照26℃下的表达量没有显著性差异;而hsp90基因表达模式表现为被高温诱导上调表达,在雌、雄虫体内表达量达到最高的处理条件分别为40℃和38℃处理2 h。【结论】β-actin1基因可以作为热胁迫下褐飞虱雌雄虫体内基因表达模式分析的校正内参基因使用。褐飞虱hsp90基因能被高温诱导表达,该基因可能在褐飞虱适应热胁迫过程中起着重要的作用。     

微孢子感染东亚飞蝗实时定量PCR内参基因的筛选

【目的】筛选出微孢子Paranosema locustae感染条件下东亚飞蝗Locusta migratoria实时定量PCR最适内参基因。【方法】本研究应用实时荧光定量PCR技术测定东亚飞蝗甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(Glyceralde-hyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)、18s核糖体RNA(18s RNA)、微管蛋白基因(Tubulin,TUB)、肌动蛋白基因(Actin,ACT)和延伸因子1基因(Elongation factor1,EF1)5个候选基因在3个微孢子浓度(1×10~4、1×10~6和1×10~8个孢子/头)感染12 d后的表达稳定性;应用ge Norm、Bestkeeper和Normfinder 3个软件综合分析5个内参基因的稳定性。【结果】ge Norm软件对5个内参基因在不同微孢子虫浓度感染下稳定性分析结果表明:18S基因稳定性最低,平均表达稳定性值M值最高为0.658 4,TUB基因稳定性最高,M值最低为0.278 4。Norm Finder软件分析在不同微孢子虫浓度感染下的5个内参基因的稳定值分别为0.152(EF1)、0.181(ACT)、0.212(TUB)、0.329(GAPDH)和0.395(18S),可知内参基因稳定性顺序为:EF1>ACT>TUB>GAPDH>18S。由Best Keeper软件分析表明5个候选内参基因的SD值均小于1.0,表达均较稳定。根据其变异系数值CV的大小可知,ACT基因最为稳定。【结论】综合3种软件分析结果,在不同微孢子虫浓度感染下,可选择的较为稳定的内参基因ACT、EF1和TUB基因作为相对定量的参照基因。     

松墨天牛化学感受组织荧光定量PCR内参基因的鉴定与筛选

【目的】本研究拟选择适合用于分析松墨天牛Monochamus alternatus化学感受组织中基因表达的内参基因。【方法】依据转录组测序结果进行内参基因鉴定,利用RT-q PCR技术分析内参基因在松墨天牛不同发育阶段和不同性别化学感受组织间的表达差异,并利用软件ge Norm,Norm Finder和Best Keeper比较其表达的稳定性。【结果】松墨天牛转录组中鉴定出9个候选内参基因(Actin,TUB,18S rRNA,RPS27A,RPS3,RPL10,AK,GAPDH和EF1A),其中后7个候选内参基因在松墨天牛中被首次鉴定,松墨天牛候选内参基因和其他昆虫相应基因的同源性很高。9个候选内参基因引物均具有良好的扩增效率,18S rRNA的表达水平最高,EF1A的表达水平最低;18S rRNA和Actin在不同样品间的表达水平差异最大,GAPDH和TUB表达水平在不同样品间差异最小。ge Norm和Norm Finder软件分析认为,GAPDH是最稳定的内参基因,TUB是较为稳定的内参基因,18S rRNA和Actin是最不稳定的内参基因;Best Keeper软件分析认为,GAPDH和TUB是合适的内参基因,18S rRNA和Actin是不适合的内参基因。最适合校正松墨天牛化学感受组织中基因表达数据的内参基因数量为2个,即GAPDH和TUB,并且这样的内参基因组合可以用于不同发育阶段和不同性别的不同化学感受组织。【结论】本研究结果为利用RT-q PCR技术准确分析松墨天牛和其他天牛基因包括化学感受组织基因相对表达量的内参基因选择提供了重要参考。     

黄芩苷对阪崎克罗诺杆菌生物膜的抑制作用

【目的】分析黄芩苷对阪崎克罗诺杆菌生物膜的抑制作用。【方法】采用XTT法评价黄芩苷对阪崎克罗诺杆菌起始粘附性及生物膜内细菌细胞活性的影响,并且采用荧光实时定量PCR(Quantitative real-time PCR,q RT-PCR)检测了阪崎克罗诺杆菌生物膜相关基因glp Q、nlp D、gsi B、deo B、lux S、sdi A的表达水平。【结果】黄芩苷对阪崎克罗诺杆菌的抑制效果呈剂量依赖型。黄芩苷对阪崎克罗诺杆菌的MIC80值为1 024 mg/L,该浓度的黄芩苷对阪崎克罗诺杆菌BAA-894和IQCC10423菌株生物膜的抑制率分别为83.7%和53.2%。浓度为2 048 mg/L的黄芩苷能够通过降低阪崎克罗诺杆菌的粘附性来抑制新生物膜的形成。另外,实时定量PCR结果表明黄芩苷可能通过下调阪崎克罗诺杆菌生物膜相关基因的表达来抑制其生物膜的形成。【结论】黄芩苷有可能被作为抗菌剂以预防和灭活阪崎克罗诺杆菌生物膜。     

Bt毒素诱导下小菜蛾实时定量PCR 内参基因的筛选

【目的】筛选出Bt毒素诱导后的小菜蛾Plutella xylostella (L.)的实时定量PCR最适内参基因。【方法】选取核糖体18S rRNA (18S rRNA)、 肌动蛋白（ACTB）、 延伸因子（EF1）、3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）、 核糖体蛋白L32 (RPL32)、 核糖体蛋白S13 （RPS13）、 核糖体蛋白S20 （RPS20）和β-微管蛋白(TUB)基因作为候选内参基因, 以geNorm、 Normfinder和BestKeeper软件分析这8个基因在Bt毒素诱导后的小菜蛾不同品系中肠组织中的表达稳定性。并应用筛选出来的内参基因分析小菜蛾氨肽酶2（aminopeptidase N2, APN2）基因的表达水平。【结果】geNorm软件以RPS13和EF1为最稳定内参基因, NormFinder和BestKeeper软件均以RPS13和RPL32为最稳定基因。使用3种不同内参基因分析Bt毒素诱导后的小菜蛾Bt抗性和敏感品系中ANP2表达水平时, 新的内参基因EF1和传统内参基因RPL32表现了良好的稳定性, 二者作为标准化因子, ANP2表达量结果基本一致, 而使用18S rRNA作为内参基因, 却导致部分表达量分析结果有所误差。【结论】筛选出PRS13,RPL32和EF1可以作为小菜蛾某些试验条件下的内参基因, 对小菜蛾基因表达研究奠定了一定基础, 也对其他昆虫内参基因的筛选具有参考价值。     

近零磁场下粘虫雌蛾内参基因转录表达稳定性评价

【目的】筛选近零磁场下粘虫Mythimnaseparata雌蛾内稳定表达的内参基因,为在近零磁场下的粘虫靶标基因表达的定量分析准确性提供依据。【方法】利用亥姆霍兹线圈产生近零磁场,分别在近零磁场(<500nT)和地磁场(约50μT)2种磁场强度下饲养粘虫。采用qRT-PCR技术测定2种磁场强度下饲养的粘虫初羽化雌蛾10种内参基因:β-肌动蛋白(β-Actin)、β-微管蛋白(β-TUB)、TATA盒结合蛋白(TBP)、延伸因子(EF-1α)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、18S核糖体RNA(18S rRNA)、28S核糖体RNA(28SrRNA)、cGMP依赖性蛋白激酶(PKG)、核糖体蛋白L12(RPL12)和腺苷三磷酸酶(ATPase)的定量表达,利用geNorm、NormFinder、BestKeeper以及在线综合分析系统RefFinder内参筛选分析软件分别对2种磁场强度下粘虫的内参基因稳定性进行评估筛选。【结果】β-Actin和18S rRNA的稳定性在NormFinder结果中居于前两位,geNorm和BestKeeper结果中β-Actin和PKG基因稳定性最好,RefFinder综合分析表明,β-Actin稳定性最好,其次为18S rRNA和PKG基因,β-TUB和TBP的表达稳定性在三个软件分析结果中都较差。geNorm软件进一步对内参基因的分析表明引入β-Actin和18S rRNA两个内参基因最佳。【结论】明确了近零磁场强度下适用于粘虫初羽化雌成虫稳定表达的内参基因,确保了近零磁场下粘虫靶标基因转录表达水平的准确测定,为粘虫磁感受分子机制研究提供了重要工具。     

松墨天牛小热激蛋白基因的克隆、表达谱及对温度胁迫的响应

【目的】松墨天牛Monochamus alternatus是我国南方松林中的重要蛀干害虫,也是林业检疫性病害——松材线虫病的主要媒介昆虫,其分布范围较广,对温度的适应性强,本研究旨在初步探讨松墨天牛对温度胁迫适应性的分子机制。【方法】采用RT-PCR与RACE技术克隆松墨天牛小热激蛋白(small heat shock protein,sHSP)基因的全长cDNA,结合生物信息学方法分析小热激蛋白的结构特征;利用qPCR技术测定该基因在松墨天牛不同发育阶段、4龄幼虫不同组织及不同低温和高温胁迫下4龄幼虫中的表达谱,并用geNorm,NormFinder和BestKeeper软件对不同温度下内参基因稳定性进行评价。【结果】获得松墨天牛sHSP基因的cDNA全长序列,命名为MaltHSP21.20(GenBank登录号:MH091811),全长为871 bp,编码187个氨基酸,信号肽预测表明其N末端含有18个氨基酸的信号肽,成熟蛋白预测分子质量为21.20 kD,等电点为8.65。结构域预测符合小热激蛋白家族的特征,共含有10个β折叠片,在α结构域内含有7个β折叠片。进化树分析表明该蛋白氨基酸序列与光肩星天牛Anoplophora glabripennis的sHSP有较高的同源性。不同软件分析得到最稳定的内参基因存在差异,结合3种方法评价得出RPL10最为稳定。MaltHSP21.20在不同发育阶段的松墨天牛体内均有表达,滞育幼虫中表达量最高,卵期及蛹期表达量次之;在4龄幼虫不同组织中均有分布,脂肪体中表达量最高;4龄幼虫MaltHSP21.20对低温诱导无响应,其表达量在35℃时显著上调,45℃处理2和3 h最高,50℃时下降。【结论】RPL10是不同温度胁迫下较稳定的内参基因。相比其他热激蛋白基因,MaltHSP21.20对低温敏感性较低,推测其在幼虫滞育越冬及抵抗高温中发挥重要作用。     

五龄飞蝗不同发育时间实时定量PCR内参基因的筛选

【目的】筛选5龄飞蝗不同发育时间的最适内参基因,为相关研究提供基础数据。【方法】本文选取β-肌动蛋白(β-actin)、延长因子(EF-1α)、3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)、核糖体蛋白49(RP49)、α-微管蛋白(α-Tubulin)和18S核糖体RNA(18S rRNA)基因作为候选内参基因,运用实时定量PCR(qPCR)方法研究各基因在5龄飞蝗不同发育时间的相对表达量,用geNorm与Normfmder软件分析这6个基因表达稳定性。【结果】geNorm分析结果显示6个内参基因表达稳定度M值顺序为:β-actin(0.3720)>RP49(0.3750)>α-Tubulin(0.4030)>18S rRNA(0.4270)>EF-1α(0.4970)>GAPDH(0.6040)。M值越小表示基因表达稳定度越高,同时geNorm软件以标准化因子配对差异值(Pairwise variations)0.15默认为取舍值,由于V2/3=0.098<0.15,所以最适内参基因数目为2个。运用NormFinder软件也得出相似的结果。【结论】β-actin与RP49为5龄飞蝗不同发育时间的最适内参基因。     

小菜蛾U6 snRNA基因的克隆及作为miRNA定量表达分析内参基因的评价

【目的】克隆小菜蛾Plutella xylostella (L.)小分子非编码RNA U6的cDNA序列,并评价其是否适合作为定量检测小菜蛾microRNA (miRNA)表达量的内参基因。【方法】本研究采用RT-PCR 克隆获得了小菜蛾4龄幼虫核小RNA(small nuclear RNA, snRNA) U6的cDNA序列,并用定量PCR法检测了U6及8种miRNAs在小菜蛾不同发育阶段及不同杀虫药剂处理后的表达稳定性。【结果】小菜蛾U6的cDNA序列全长 94 bp,与其他昆虫U6的核苷酸序列一致性达98.9%。用geNorm和RefFinder软件分析荧光定量PCR结果表明,U6在小菜蛾卵、1-4龄幼虫、蛹和成虫7个不同发育阶段表达稳定;用马拉硫磷、毒死蜱、辛硫磷、灭多威、呋喃虫酰肼、高效氯氰菊酯、氯虫苯甲酰胺、溴虫腈和Bt 9种不同作用机理的杀虫药剂处理3龄末幼虫48 h,对U6的表达水平无显著影响。【结论】小菜蛾U6表达水平不受不同发育阶段和不同杀虫药剂处理的影响,符合作为内参基因的基本特点,可作为定量PCR法评价小菜蛾miRNA或其他非编码小分子RNA表达水平的内参基因。研究结果为小菜蛾miRNA表达水平的准确定量奠定了基础。     

A Unique Protease Cleavage Site Predicted in the Spike Protein of the Novel Pneumonia Coronavirus (2019-nCoV) Potentially Related to Viral Transmissibility

正Dear Editor,In December 2019, a novel human coronavirus caused an epidemic of severe pneumonia(Coronavirus Disease 2019,COVID-19) in Wuhan, Hubei, China(Wu et al. 2020; Zhu et al. 2020). So far, this virus has spread to all areas of China and even to other countries. The epidemic has caused 67,102 confirmed infections with 1526 fatal cases     

Curcuminoids as inhibitors of thioredoxin reductase: A receptor based pharmacophore study with distance mapping of the active site

Curcumin is the yellow pigment of turmeric that interacts irreversibly forming an adduct with thioredoxin reductase (TrxR), an enzyme responsible for redox control of cell and defence against oxidative stress. Docking at both the active sites of TrxR was performed to compare the potency of three naturally occurring curcuminoids, namely curcumin, demethoxy curcumin and bis-demethoxy curcumin. Results show that active sites of TrxR occur at the junction of E and F chains. Volume and area of both cavities is predicted. It has been concluded by distance mapping of the most active conformations that Se atom of catalytic residue SeCYS498, is at a distance of 3.56 from C13 of demethoxy curcumin at the E chain active site, whereas C13 carbon atom forms adduct with Se atom of SeCys 498. We report that at least one methoxy group in curcuminoids is necessary for interation with catalytic residues of thioredoxin. Pharmacophore of both active sites of the TrxR receptor for curcumin and demethoxy curcumin molecules has been drawn and proposed for design and synthesis of most probable potent antiproliferative synthetic drugs.     

The structure, reproduction and taxonomy of Vidalia and Osmundaria (Rhodophyta, Rhodomelaceae)

Comprises species occurring mostly in subtidal habitats in tropical, subtropical and warm-temperate areas of the world. An analysis of the type species, V. spiralis (Sonder) Lamouroux ex J. Agardh, a species from Australia, establishes basic characters for distinguishing species in the genus. These characters are (1) branching patterns of thalli, (2) flat blades that may be spiralled on their axis, (3) width of the blade, (4) primary or secondary derivation of sterile and fertile branchlets and (5) position of sterile and fertile branchlets on the thalli. Application of the latter two characters provides an important basic method for separation of species into three major groups. Osmundaria , a genus known only in southern Australia, was studied in relation to Vidalia , and its separation from the Vidalia assemblage is not accepted. Species of Vidalia therefore are transferred to the older genus name, Osmundaria. Two new species, Osmundaria papenfussii and Osmundaria oliveae are described from Natal. Confusion in the usage of the epithet, Vidalia fimbriala Brown ex Turner has been clarified, and Vidalia gregaria Falkenberg, described as an epiphyte on Osmundaria pro/ifera Lamouroux, is revealed to be young branches of the host, Osmundaria prolifera.     

New or rare chromosome counts in Artemisia L. (Asteraceae, Anthemideae) and related genera from Kazakhstan

Fifteen chromosome counts of six Artemisia taxa and one species of each of the genera Brachanthemum, Hippolytia, Kaschgaria, Lepidolopsis and Turaniphytum are reported from Kazakhstan. Three of them are new reports, two are not consistent with previous counts and the remainder are confirmations of very scarce (one to four) earlier records. All the populations studied have the same basic chromosome number, x = 9, with ploidy levels ranging from 2x to 6x. Some correlations between ploidy level, morphological characters and distribution are noted.     

Comparative morphology of the carpel in the Liliaceae: Hewardieae, Petrosavieae, and Tricyrteae

The young pistils in the melanthioid tribes, Hewardieae, Petrosavieae and Tricyrteae, are uniformly tricarpellate and syncarpous. They lack raphide idioblasts. All are multiovulate, with bitegmic ovules. The Petrosavieae are marked by the presence of septal glands and incomplete syncarpy. Tepals and stamens adhere to the ovary in the Hewardieae and the Petrosavieae but not in the Tricyrteae. Two vascular bundles occur in the stamens of the Hewartlieae and Tricyrtis latifolia. Ventral bundles in the upper part of the ovary of the Hewardieae are continuous with compound septal bundles and placental bundles in the lower part. Putative ventral bundles occur in the alternate position in the Tricyrteae and putative placental bundles in the opposite. position in the Petrosavieae. The dichtomously branched stigma in each carpel of the Tricyrteae is supplied by a bifurcated dorsal bundle.     

肝癌中HBV和HCV基因和抗原的分布及意义

采用原位分子杂交方法检测HCV RNA及HBV X基因;采用免疫组织化学方法研究HCV核心抗原,非结构区C33c抗原及HBxAg在肝细胞肝癌中的定位及分布.结果表明(1)HCV RNA、HBV X基因在肝细胞肝癌组织检出率分别为40%(55/136)和82%(112/136).HCV RNA定位于癌细胞的胞浆内,阳性细胞呈散在、灶状及弥漫分布三种形式;HBV X基因在肝癌细胞中的分布呈胞浆型、核型及核浆型,阳性细胞也呈上述三种分布形式;(2)HCV C33c抗原、核心抗原在肝细胞肝癌中的阳性率为81%(133/164)及86%(141/164).C33c抗原定位于癌细胞及肝细胞的胞浆内;核心抗原既定位于癌细胞核中,又可定位于胞浆中.C33c抗原阳性细胞以灶状分布为主;而核心抗原阳性细