晚期糖基化白蛋白通过上调核苷酸结合寡聚结构域样受体蛋白3诱导巨噬细胞焦亡

本研究旨在探讨晚期糖基化白蛋白(advanced glycated albumin, AGE-alb)对巨噬细胞核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3 (nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3, NLRP3)-caspase-1途径的影响,以阐明AGE-alb对巨噬细胞焦亡的影响及机制。体外培养RAW264.7巨噬细胞,分别给予AGE-alb (1、2、4和6 g/L)、对照白蛋白(C-alb,4 g/L)处理24h或以NLRP3抑制剂MCC950 (1μmol/L)预处理细胞,1h后以AGE-alb(4g/L)处理24h。MTT法检测细胞活力,试剂盒测定caspase-1和培养基乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)活性以及白细胞介素-1β(interleukin-1β, IL-1β)、IL-18浓度,TUNEL法和Hoechst 33342/PI双染法检测细胞死亡情况,Westernblot分析NLRP3、procaspase-1和cleavedcaspase-1表达变化。结果显示:AGE-alb显著诱导RAW264.7巨噬细胞损伤,表现为细胞活力降低,LDH漏出、TUNEL阳性和PI阳性细胞率显著增加,且呈浓度依赖性,并可促进IL-1β和IL-18分泌。AGE-alb显著上调NLRP3表达和caspase-1活性,尤其在4和6 g/L浓度时更为明显。然而,MCC950预处理可抑制AGE-alb所诱导的RAW264.7巨噬细胞活力降低、LDH漏出、TUNEL阳性和PI阳性细胞率增加以及IL-1β和IL-18分泌,并可抑制AGE-alb所致的caspase-1活化。以上结果表明,AGE-alb可诱导RAW264.7巨噬细胞焦亡,其机制至少部分是通过激活NLRP3-caspase-1信号途径实现的。     

内质网应激介导氧化低密度脂蛋白所诱导的巨噬细胞清道夫受体A1上调

本文旨在研究内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)是否介导氧化低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein,ox-LDL)所诱导的巨噬细胞清道夫受体A1(scavenger receptor A1,SR-A1)上调。体外培养RAW264.7巨噬细胞,给予20mmol/L ERS抑制剂4-苯丁酸(4-phenylbutyric acid,PBA)处理30 min后,再加入ox-LDL(50 mg/L)继续培养12 h或2 mg/L ERS诱导剂衣霉素(tunicamycin,TM)或2μmol/L毒胡萝卜素(thapsigagin,TG)继续培养4 h。另外培养巨噬细胞分别给予0.5、1和2 mg/L TM处理4 h或给予2 mg/L TM处理1、2和4 h。采用试剂盒检测细胞内总胆固醇(total cholesterol,TC)含量;分别采用免疫印迹法和实时定量聚合酶链反应(real-time PCR)技术检测SR-A1和ERS标志分子糖调节蛋白78(glucose-regulated protein 78,GRP78)蛋白和mRNA表达变化;采用多功能酶标仪检测Dil-ox-LDL摄取情况。结果显示,PBA显著抑制ox-LDL所诱导的巨噬细胞内胆固醇蓄积。ox-LDL可显著上调SR-A1和GRP78表达,而PBA可明显抑制ox-LDL所诱导的SR-A1上调(P0.05),并使GRP78降低39.3%(P=0.057)。TM明显上调SR-A1蛋白表达,并促进巨噬细胞对ox-LDL的摄取,且呈浓度和时间依赖性,但对SR-A1转录水平没有明显影响,且ERS另一诱导剂TG也可明显上调SR-A1表达;而PBA则明显抑制TM和TG所诱导的上述变化。以上结果表明,ERS在ox-LDL所诱导的SR-A1上调中具有重要作用,进而促使巨噬细胞摄取更多的ox-LDL,导致泡沫细胞形成。     

双氢青蒿素调控巨噬细胞增殖和迁移的作用研究

目的:探讨双氢青蒿素在体外对小鼠单核巨噬细胞RAW264.7的增殖、克隆形成、周期、凋亡和迁移的影响。方法:采用梯度浓度(2.5μg/m L, 5μg/m L, 10μg/m L, 20μg/m L)的双氢青蒿素处理RAW264.7细胞,利用CCK8实验检测双氢青蒿素对巨噬细胞增殖能力的影响,利用克隆形成实验检测双氢青蒿素对RAW264.7细胞克隆形成能力的影响,利用流式细胞术检测双氢青蒿素对RAW264.7细胞周期和凋亡的影响,利用划痕修复实验检测RAW264.7细胞迁移能力。结果:CCK8实验结果显示,双氢青蒿素可以显著抑制RAW264.7巨噬细胞的增殖能力,且抑制效果与双氢青蒿素的浓度呈正相关性。克隆形成实验结果显示,双氢青蒿素可以抑制细胞的克隆形成能力。双氢青蒿素处理使RAW264.7细胞G0/G1期比例显著升高,S期与G2/M期细胞比例显著降低。双氢青蒿素对巨噬细胞凋亡具有诱导作用,且凋亡诱导作用呈现浓度依赖的特性。划痕修复实验结果显示,双氢青蒿素可以显著抑制RAW264.7巨噬细胞的迁移能力。结论:双氢青蒿素可以导致巨噬细胞的细胞周期G0/G1阻滞,并且诱导细胞凋亡,对巨噬细胞增殖和迁移具有抑制作用。     

腺苷脱氨酶抑制巨噬细胞增殖迁移的作用研究

目的:探讨腺苷脱氨酶对鼠源巨噬细胞RAW264.7增殖、迁移、细胞周期、细胞凋亡的影响。方法:用不同浓度(0、0.25、1.25、2.5、5U/m L)的腺苷脱氨酶处理RAW264.7细胞后,用实时细胞分析系统检测细胞增殖能力,用流式细胞术检测腺苷脱氨酶对细胞凋亡和周期的影响,划痕修复实验检测RAW264.7细胞迁移能力。结果:与对照组相比,高浓度腺苷脱氨酶(2.5 U/m L、5 U/m L)处理可以显著抑制RAW264.7细胞的增殖能力,且抑制效果随腺苷脱氨酶浓度升高而增强(P<0.05)。流式细胞术检测结果显示,相较于对照组,高浓度腺苷脱氨酶(2.5 U/m L)处理可以诱导RAW264.7细胞凋亡,并导致细胞周期G2/M期阻滞(P<0.05)。此外,细胞划痕实验表明,高浓度腺苷脱氨酶(2.5 U/m L)处理可以显著抑制RAW264.7巨噬细胞的迁移能力(P<0.05)。结论:高浓度腺苷脱氨酶对巨噬细胞增殖和迁移具有抑制作用,并可诱导细胞凋亡和细胞周期阻滞。     

阻断Kv1.3通道可增强RAW264.7巨噬细胞的吞噬功能

本研究旨在阐明电压门控性钾通道1.3(Kv1.3)在巨噬细胞吞噬功能中的作用.利用RAW264.7巨噬细胞吞噬鸡红细胞的半定量检测系统及吞噬异硫氰酸荧光素标记的大肠杆菌(E.coli)k-12的流式细胞术定量检测系统测定巨噬细胞的吞噬功能.研究发现,用海葵神经毒素(Sh K)(100 pmol/L)选择性阻断Kv1.3通道能显著增强处于静息状态的和被脂多糖(LPS)激活的RAW264.7巨噬细胞吞噬鸡红细胞的能力;Sh K也可增强静息RAW264.7细胞吞噬大肠杆菌的能力,但由于LPS刺激吞噬的效应近乎饱和,Sh K并不能进一步增加被LPS激活的RAW264.7细胞吞噬大肠杆菌的数量.Sh K促进LPS激活的RAW264.7细胞释放一氧化氮(NO),但并不增加静息RAW264.7细胞的NO释放.Sh K(100 pmol/L)自身并不影响静息RAW264.7细胞释放细胞因子,但能抑制LPS激活的RAW264.7细胞释放白细胞介素-1?.Sh K(100 pmol/L)对RAW264.7细胞的活力无明显影响.RAW264.7细胞表达Kv1.3通道蛋白;LPS使RAW264.7细胞的Kv1.3蛋白表达下调,菲律宾菌素Ⅲ(小凹蛋白依赖性内吞途径抑制剂)使Kv1.3蛋白表达上调,细胞松弛素D对Kv1.3蛋白表达无明显影响.研究表明,RAW264.7细胞表达Kv1.3蛋白;阻断Kv1.3通道可增强RAW264.7细胞的吞噬能力和NO生成.结果提示,Kv1.3通道可能是RAW264.7细胞吞噬活动的负调节因子,有可能成为治疗巨噬细胞吞噬功能异常相关疾病的一个靶点.     

分枝菌酸诱导巨噬细胞泡沫细胞化对细胞自噬的影响

研究分枝菌酸(mycolic acid,MA)诱导的巨噬细胞泡沫细胞化对巨噬细胞自噬的影响,探讨MA促巨噬细胞泡沫细胞化的机制。构建LC3真核表达质粒(p EGFP-LC3B),转染RAW264.7细胞后获得其稳定转染细胞株(RAW264.7/p EGFP-LC3B);用MA诱导RAW264.7/p EGFP-LC3B获得RAW264.7/p EGFP-LC3B泡沫细胞。实验分为三组:RAW264.7细胞组、RAW264.7/p EGFP-LC3B细胞组及MA诱导的RAW264.7/p EGFP-LC3B泡沫细胞组。通过RT-PCR法检测各组细胞中自噬相关基因Becn1、LC3B的转录水平,Western blot法检测各组细胞自噬标志蛋白LC3B II/I的表达水平。RTPCR检测结果显示,RAW264.7/p EGFP-LC3B泡沫细胞组的Becn1基因及LC3B基因的转录水平明显较其他两组低(P0.05)。Western blot检测结果显示,RAW264.7/p EGFP-LC3B泡沫细胞组LC3B II/I比值明显较其他两组低(P0.05)。由此可见,当巨噬细胞被MA诱导成为泡沫巨噬细胞后,其自噬功能显著降低。该研究证明,MA可能通过抑制巨噬细胞自噬,引起脂代谢失衡,进而发生巨噬细胞泡沫细胞化。     

A族链球菌诱导巨噬细胞坏死而非凋亡

为了研究A族链球菌(GAS)作用巨噬细胞系RAW264.7后,RAW264.7细胞增殖变化的情况,以进一步研究GAS的致病机制。将RAW264.7接种于96孔板,采用低菌量、中菌量和高菌量分别作用于该细胞,培养三天后行MTT检测;用TUNEL及ANNEXIN V-FITC法检测高菌量GAS作用后巨噬细胞是否发生凋亡;透射电子显微镜观察低、中、高菌量GAS作用RAW264.7后细胞超微结构的变化。结果显示低、中菌量GAS对RAW264.7细胞增殖有促进作用;高菌量GAS对细胞增殖有抑制作用,且高菌量GAS作用RAW264.7后诱导大部分细胞发生了坏死而非凋亡。结果表明高菌量GAS引起RAW264.7细胞发生坏死而非凋亡。     

甘草酸对巨噬细胞抗绵羊肺炎支原体感染的调控作用研究

为观察甘草酸在小鼠巨噬细胞系RAW264.7抗绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae,MO)感染中的作用,实验利用CCK-8细胞活性检测找到最佳甘草酸处理浓度;检测甘草酸对受MO感染的巨噬细胞活性的影响。流式细胞仪检测甘草酸对RAW264.7巨噬细胞生长周期的影响;ELISA检测甘草酸对受MO感染的巨噬细胞分泌TNF-α的影响;Western blot检测细胞凋亡因子Bax、Bad的表达情况。RT-PCR检测凋亡和自噬相关基因的表达情况。结果显示,浓度为12μmol/L的甘草酸显著升高RAW264.7的活性(P=0.012 9),且处于G1期的细胞数减少,G2期的细胞数增加。甘草酸(12μmol/L)可提高受MO感染的RAW264.7的增殖率(P=0.034 0),培养上清中TNF-α含量升高(P=0.015 2),巨噬细胞中促凋亡蛋白Bax表达量增加,但基因caspase 3和caspase 9的表达量显著下调(P<0.000 1),自噬相关基因Atg 7和Beclin 1表达量显著升高(P<0.000 1)。结果提示在MO感染巨噬细胞引起免疫抑制的情况下,甘草酸可通过促增殖、抑凋亡、促进TNF-α的表达、增加自噬来起到免疫调控作用。     

氧化低密度脂蛋白诱导巨噬细胞内质网应激及CD36的可能作用

本文旨在研究在鼠源巨噬细胞泡沫化过程中氧化低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein,ox-LDL)对巨噬细胞内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)的诱导作用及其机制。体外培养RAW264.7巨噬细胞,分别给予ox-LDL(25、50和100mg/L)、抗CD36抗体+ox-LDL和衣霉素(tunicamycin,TM)等不同处理。采用油红O染色观察细胞内脂质蓄积情况,酶比色法测定细胞内总胆固醇含量,免疫细胞化学法检测ERS标志分子糖调节蛋白94(glucose-regulated protein94,GRP94)表达,免疫印迹法检测GRP94及未折叠蛋白反应关键分子p-IRE1(phosphorylated inositol-requiring enzyme1)和X盒结合蛋白1(X box binding protein1,XBP1)蛋白表达水平。结果显示,不同浓度(25、50和100mg/L)ox-LDL处理细胞24h后,胞浆内可见大量油红O染色阳性脂质颗粒,细胞内总胆固醇含量明显增加,分别为空白对照组的2.1倍、2.8倍和3.1倍;使用抗CD36抗体阻断ox-LDL的摄入,可显著减少100mg/Lox-LDL所致的细胞内胆固醇蓄积。不同浓度ox-LDL和ERS诱导剂TM均可显著增加GRP94及其上游信号分子p-IRE1和XBP1蛋白表达,且表达强度随着ox-LDL诱导浓度的增加而增强;抗CD36抗体显著抑制100mg/Lox-LDL所致的上述3种蛋白表达上调。上述结果提示,ox-LDL可呈剂量依赖性诱导RAW264.7巨噬细胞产生ERS,激活未折叠蛋白反应信号通路;该过程可能由清道夫受体CD36所介导。     

Daxx通过上调caveolin-1的表达介导Ox-LDL诱导巨噬细胞胆固醇蓄积和凋亡

为探讨Daxx对氧化型低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein,Ox-LDL)诱导巨噬细胞胆固醇蓄积和凋亡的介导作用及其可能的分子机制,用高效液相色谱法检测细胞内胆固醇含量,油红O染色观察细胞内脂滴的形成情况,流式细胞术和吖啶橙/溴化乙锭(AO/EB)染色法研究Ox-LDL对细胞凋亡的影响,Real time RT-PCR检测细胞内Daxx mRNA的表达水平,Western blot检测caveolin-1蛋白的表达,用特异性siRNA沉默Daxx在RAW264.7 细胞中的表达．Ox-LDL上调Daxx mRNA和caveolin-1的表达、增加细胞内胆固醇含量、促使RAW264.7细胞凋亡,用特异性siRNA干扰Daxx在RAW264.7细胞中的表达能降低caveolin-1的表达、减少细胞内胆固醇含量、以及抑制细胞凋亡．上述结果表明,Daxx对Ox-LDL诱导RAW264.7巨噬细胞胆固醇蓄积和凋亡具有介导作用,这一作用可能与Daxx上调caveolin -1的表达有关．     

艾拉莫德(T-614)对巨噬细胞M1型极化的影响

[目的]研究艾拉莫德(T-614)对小鼠巨噬细胞(RAW264.7)M1型极化的影响。[方法]细胞毒性实验观察3个浓度(400 g/L,800 g/L,1 200 g/L)的T-614对RAW264.7的影响,使用LPS/IFN-γ诱导RAW264.7发生M1型分化,同时进行T-614干预。流式细胞术检测RAW264.7表面F4/80+CD86+与MHCⅡ+的比例,ELISA检测细胞中IL-1β、IL-6、TNF-α的含量,RT-PCR检测细胞中IL-1β、IL-6、TNF-α、MCP-1、CD86和iNOS基因的表达,Western Blot检测细胞中MCP-1、CD86和iNOS蛋白表达水平。[结果]3个浓度T-614对未分化的巨噬细胞没有毒性;高浓度T-614降低M1巨噬细胞表面的F4/80+CD86+与MHCⅡ+比例(P<0.05),降低MCP-1、CD86和iNOS的基因表达水平与蛋白表达水平(P<0.05),降低IL-1β、IL-6、TNF-α基因表达与减少IL-1β、IL-6、TNF-α的含量(P<0.05)。[结论]T-614能抑制RAW264.7进行M1型极化,抑制MCP-1、CD86和iNOS的表达,减少IL-1β、IL-6、TNF-α的形成与分泌。     

黄芪甲苷对马兜铃酸诱导的巨噬细胞M1型极化的作用及机制研究

目的:探讨黄芪甲苷对马兜铃酸诱导的RAW264.7细胞向M1型极化的影响,并初步探索其可能的作用机制。方法:分别采用马兜铃酸和脂多糖(LPS)刺激RAW264.7细胞24 h,伴或不伴黄芪甲苷进行药物干预处理。采用细胞计数检测试剂盒-8(CCK 8)检测细胞活性变化,流式细胞仪检测巨噬细胞分型,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测细胞上清液中白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的分泌量。反转录实时定量PCR(RT-qPCR)技术检测RAW264.7细胞IL-6、TNF-αmRNA表达。蛋白免疫印迹法(Western blot)检测RAW264.7细胞p-p38和p38 MAPK蛋白表达水平。结果:CCK8结果提示黄芪甲苷在5~50μg/mL浓度范围对RAW264.7巨噬细胞无明显毒性,本研究选取10μg/mL作为实验干预浓度。黄芪甲苷能够显著改善马兜铃酸诱导的巨噬细胞活性(P<0.05),同时减少IL-6和TNF-α的分泌水平和mRNA表达水平(均P<0.05),抑制马兜铃酸和LPS诱导的M1/M2巨噬细胞比例(P<0.05)。黄芪甲苷可部分抑制马兜铃酸诱导的巨噬细胞p38 MAPK磷酸化水平(P<0.05)。结论:黄芪甲苷可减少巨噬细胞M1型极化,降低炎症因子IL-6和TNF-α水平,减少巨噬细胞的活性,从而起到减缓马兜铃酸肾损害的作用,其作用机制可能与部分抑制p38 MAPK信号活性有关。     

S-亚硝基-N-乙酰-DL-青霉胺对RAW264.7巨噬细胞亚型分化的影响

目的:探讨S-亚硝基-N-乙酰-DL-青霉胺(SNAP)对巨噬细胞亚型分化的影响及其机制。方法:以RAW264.7巨噬细胞为研究对象,分为空白对照组、SNAP组、SNAP+PBA(4-苯基丁酸)组,采用不同浓度(30、100、300、400、500μmol/L)的SNAP或300μmol/L SNAP+20 mmol/L PBA对巨噬细胞进行干预24 h,应用RT-PCR法检测RAW264.7巨噬细胞亚型分化标志物M1(iNOS,CD86)、M2(Arg-I,MR)及CHOP mRNA的表达,应用Western blot技术检测iNOS及ERS通路中相关蛋白CHOP、P-PERK的表达。结果:与空白对照组比较,SNAP组iNOS、CD86、CHOPmRNA的表达均明显降低(P0.05),Arg-ImRNA表达明显升高(P0.05),而MR mRNA表达升高,但差异无统计学意义(P0.05);与300μmol/L SNAP组比较,300μmol/L+PBA组iNOS、CHOP mRNA均无明显变化(P0.05),CD86 mRNA升高,Arg-I、MR mRNA均明显降低(P0.05)。SNAP组CHOP、iNOS、p-PERK蛋白表达均明显低于对照组(P0.05),300μmol/LSNAP+20 mmol/LPBA组与300μmol/LSNAP组比较iNOS蛋白、p-PERK、CHOP蛋白表达升高(P0.05)。结论:NO可能通过内质网应激机制抑制巨噬细胞向M1亚型分化。     

肌动蛋白解聚对巨噬细胞TLRs的表达及细胞凋亡的影响

在肺癌等的癌细胞中,脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)等致炎因子介导的促瘤效应涉及Toll样受体(Toll like receptors, TLRs)/纤维型肌动蛋白(fibrous actin, F-actin)通路。该研究探讨了外源性松胞菌素D(cytochalasin D, cytD)和细胞内源过表达的重组肌动蛋白解聚因子丝切蛋白(Cofilin-1)所诱导的肌动蛋白解聚对巨噬细胞TLR2、TLR4和TLR9的表达和细胞凋亡水平的影响。分别用6种不同浓度的cytD处理RAW264.7小鼠巨噬细胞48 h,用Western blot检测6组细胞TLR2、TLR4、TLR9的表达水平。构建重组pEGFP-N1-Cofilin-1质粒并转染RAW264.7细胞,设置空质粒对照和空白细胞对照组。用Real-time PCR法和Western blot检测细胞转染前后Cofilin-1表达水平;Western blot检测巨噬细胞TLR2、TLR4、TLR9的表达情况;用流式细胞术检测3组细胞的凋亡水平。结果显示,终浓度≥1.5μmol/L的cytD处理细胞后, RAW264.7细胞表达TLR2明显降低(P0.05);终浓度≥1.0μmol/L的cytD处理细胞后,巨噬细胞表达TLR4、TLR9明显降低(P0.05)。重组质粒转染组细胞的cofilin-1 mRNA及Cofilin-1蛋白水平均高于空质粒对照组和空白细胞对照组(P0.05),且其TLR2、TLR4、TLR9蛋白表达水平和细胞凋亡水平均显著低于空质粒对照组和空白细胞对照组(P0.05)。结果表明,外源性cytD和巨噬细胞内源性高表达的Cofilin-1蛋白均可下调巨噬细胞TLR2、TLR4、TLR9的表达,其中,细胞高表达的Cofilin-1蛋白还显著降低了细胞凋亡率。该文通过揭示肌动蛋白解聚对巨噬细胞TLRs的表达及细胞凋亡的抑制,为进一步研究炎症与肿瘤的关系及分子机制奠定了基础。     

冠蛋白-1不同表达水平对巨噬细胞iNOS、TLRs表达以及凋亡的影响

冠蛋白-1(Coronin-1)在真核细胞中广泛表达,涉及钙离子稳态、细胞骨架动力学、免疫及炎症反应等多种细胞功能。该研究探讨了冠蛋白-1不同表达水平对巨噬细胞诱导性一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)、Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)表达和凋亡的影响并探讨其分子机制。根据冠蛋白-1表达水平的差异,实验细胞分为RAW264.7-Cor.Plus、RAW264.7、RAW264.7-Cor.Minus 3组。各组细胞分别经4μmol/L钙调磷酸酶抑制剂环孢素A(cyclosporin A,Cs A)处理24 h或2μmol/L肌动蛋白聚合抑制剂松胞菌素D(cytochalasin D,cyt D)处理48 h,同时设未处理对照,再分别用Real-time PCR法检测iNOS m RNA水平,Western blot法检测细胞TLR2、TLR4、TLR9及钙调磷酸酶(calcineurin,Ca N)的蛋白质水平,流式细胞术检测细胞凋亡百分率。各组细胞用四甲基异硫氰酸荧光素标记的鬼笔环肽(TRITC-phalloidin)染色后,计算纤维型肌动蛋白(F-actin)重排率。结果显示,冠蛋白-1过表达细胞相对于冠蛋白-1正常表达细胞,其iNOSm RNA水平以及TLR2、TLR4、TLR9蛋白表达水平和细胞凋亡率均显著降低(P0.05);Cs A作用后,RAW264.7-Cor.Plus的iNOS m RNA水平以及TLR2、TLR4、TLR9蛋白质水平和细胞凋亡率均较未处理对照细胞显著增加(P0.05),RAW264.7和RAW264.7-Cor.Plus细胞的Ca N水平较未处理对照细胞显著降低(P0.05);cyt D作用后,与未处理对照细胞相比,iNOS m RNA水平及细胞凋亡率无显著性差异(P0.05),但TLRs的表达显著降低(P0.05);经鬼笔环肽染色后,RAW264.7-Cor.Plus细胞F-actin重排率显著高于RAW264.7细胞(P0.05)。以上结果表明,冠蛋白-1过表达不仅促进了巨噬细胞F-actin重排,而且下调了iNOS、TLRs水平并且抑制细胞凋亡,其分子机制与冠蛋白-1促进钙调磷酸酶调控的Ca~(2+)信号通路有关。     

内质网应激特有Caspase-12凋亡途径在高糖刺激的条件永生型小鼠足细胞中的作用

目的检测内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)标志蛋白GRP78在高糖刺激的条件永生型小鼠足细胞中的表达及其特有Caspase-12凋亡途径与该细胞凋亡之间的关系,探讨高糖是否通过ERS特有Caspase-12凋亡途径诱导了小鼠足细胞凋亡。方法体外培养的小鼠足细胞(mouse podocyte,PC),分为正常糖对照组(NG,1g/l D-glucose)、甘露醇对照组(M,1g/L D-glucose plus 24.4mmol/l mannitol)、高糖组(HG,4.5g/l D-glucose)。分别经细胞同步化、分组干预及刺激12、24、48、72h后收集细胞,应用TUNEL法及流式细胞术检测细胞凋亡;免疫细胞化学、Western blot检测GRP78、Caspase-12蛋白的动态表达。结果与正常糖对照组及甘露醇对照组相比,高糖组小鼠足细胞于48h及72h凋亡率明显增高(all P0.01);ERS标志蛋白GRP78从12h表达开始增高,提示永生型小鼠足细胞在高糖刺激下激活了ERS,ERS特有凋亡途径caspase-12随时间的延长表达逐渐增高;相关性分析显示Caspase-12蛋白表达与足细胞凋亡率呈正相关(r=0.915,P0.01)。结论高糖刺激可以引起足细胞凋亡,ERS在高糖对足细胞的损害过程中被诱导,其特有Caspase-12凋亡途径参与了足细胞的凋亡,可能在糖尿病(diabetes mellitus,DM)肾组织损害病理过程中发挥重要作用。     

Fucoidan对巨噬细胞RAW264.7的免疫调节作用

目的观察褐藻多糖硫酸酯(Fucoidan)对巨噬细胞RAW264.7体外吞噬活性、细胞因子TNF-α和IL-6分泌,以及Toll样受体4(TLR4)mRNA表达的影响。方法实验分对照组,Fucoidan高、中、低剂量组(浓度分别是200、400和800μg/mL)。药物处理6~48h后,MTT法检测RAW264.7细胞活力;中性红比色法检测细胞吞噬活性;ELISA法检测培养上清中TNF-α和IL-6的分泌水平;实时定量PCR检测Toll样受体4(TLR4)mRNA表达量。结果与对照组相比,Fucoidan显著增强RAW264.7细胞代谢活力和吞噬能力(P0.01),增加TNF-α和IL-6的分泌,上调TLR4的表达,呈剂量依赖关系。结论 Fucoidan可上调TLR4表达,增强巨噬细胞代谢和吞噬活性,增加TNF-α和IL-6的分泌,具有潜在的调节免疫作用。     

内质网应激促进肺动脉平滑肌细胞的表型转化

目的:探讨内质网应激(ERS)对肺动脉平滑肌细胞表型转化的影响。方法:采用胶原酶Ⅰ消化法培养原代大鼠肺动脉平滑肌细胞(PASMCs),用衣霉素(TM)或4-苯基丁酸(4-PBA)诱导或抑制内ERS,MTS法评价细胞增殖情况,western blot和定量RT-PCR检测蛋白和mRNA表达情况。结果:TM呈浓度依赖性诱导内质网应激标志物GRP78和XBP1 mRNA表达;较低浓度的TM促进PASMCs增殖,高浓度(5μg/mol)使细胞凋亡;TM使PASMCs表达SM22 alpha减少,分泌Ⅰ型胶原增加;4-PBA预处理可逆转TM诱导PASMCs的SM22 alpha减少和Ⅰ型胶原分泌增加。结论:内质网应激促进肺动脉平滑肌细胞表型转化,可能是内质网应激参与肺动脉高压的机制之一。     

灵芝多糖对单核巨噬白血病细胞株的体外作用

目的:研究灵芝多糖对单核巨噬白血病细胞THP-1和RAW264.7的肿瘤生物学活性的影响。方法:用1、50和100μg/ml的灵芝多糖和脂多糖(LPS)刺激THP-1和RAW264.7细胞,CCK-8法测定巨噬细胞的增殖活力、流式细胞仪检测细胞的凋亡活性、Q-PCR检测细胞因子TNF-α、IL-1、IL-6和IL-12基因、相关凋亡信号通路基因TRADD、TNFSF10、TNFRSR10b、NFκBI、Caspase10和Caspase 3基因的mRNA表达水平。结果:灵芝多糖可以呈反浓度依赖性地刺激两种细胞的增殖,在50和100μg/ml浓度下可引起细胞凋亡,凋亡信号基因TNFRSR10b和NFκBI的mRNA水平在24h升高了53%和48%;在1~100μg/ml浓度下可上调细胞因子TNF-α、IL-1、IL-6和IL-12细胞因子mRNA的表达水平。结论:灵芝多糖对白血病细胞株具有双重作用,在低浓度下促进细胞增殖,而在高剂量时诱导细胞凋亡,均可上调免疫相关细胞因子的表达。