晚期糖基化白蛋白通过激活caspase-12途径诱导巨噬细胞凋亡

本文旨在研究晚期糖基化白蛋白(advanced glycated albumin,AGE-alb)对巨噬细胞内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)凋亡途径关键分子caspase-12的影响,以阐明AGE-alb对巨噬细胞凋亡的诱导作用及机制。体外培养RAW264.7巨噬细胞,分别给予AGE-alb(2、4和6 g/L)、正常对照白蛋白(control albumin,C-alb,4 g/L)、ERS诱导剂衣霉素(tunicamycin,TM,4 mg/L)处理,或以ERS抑制剂4-苯丁酸(4-phenylbutyric acid,PBA,5 mmol/L)预处理细胞1 h,然后与AGE-alb(4 g/L)共孵育24 h。采用MTT法检测细胞活力,TUNEL法检测细胞凋亡情况,试剂盒测定培养基乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)活性,免疫印迹法检测caspase-12表达变化。结果显示:与TM相似,AGE-alb显著诱导RAW264.7巨噬细胞损伤,表现为细胞活力降低,LDH漏出和细胞凋亡率明显增加,且呈浓度依赖性。AGE-alb明显上调caspase-12活性,尤其在4和6 g/L浓度时更为显著(P0.01)。然而,PBA可抑制AGE-alb所致的巨噬细胞活力降低以及LDH漏出和凋亡增加,且减轻AGE-alb诱导的caspase-12活化(P0.05)。上述结果提示,AGE-alb可诱导RAW264.7巨噬细胞凋亡,其机制可能与激活caspase-12介导的ERS凋亡途径有关。     

内质网应激在乙型脑炎病毒诱导神经元细胞凋亡中的作用及机制研究

内质网应激(Endoplasmic reticulum stress,ERS)的激活与创伤、缺血再灌注等病理刺激引起的神经元凋亡有关,流行性乙型脑炎病毒(JEV)感染能够促进神经元凋亡、激活ERS,但ERS在JEV诱导神经元细胞凋亡中的作用尚不清楚.为了研究ERS在JEV诱导神经元细胞凋亡中的作用及机制,本研究以神经细胞株SH-SY5Y为对象,感染JEV并加用ERS激动剂、ERS抑制剂或转染阴性对照(NC) siRNA、蛋白激酶R样内质网激酶(PERK)siRNA,检测细胞存活率、凋亡率、ERS蛋白PERK、肌醇必需酶-1α(IRE1α)、活化转录因子6(ATF6)及凋亡蛋白C/EBP同源蛋白(CHOP)、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶12(Caspase-12)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)的表达.结果 显示:JEV组SH-SY5Y细胞的凋亡率及PERK、CHOP、Caspase-12、Bax的表达水平高于对照组,存活率低于对照组(P＜0.05),IRE1α、ATF6的表达水平与对照组比较无显著差异(P＞0.05).与JEV组比较,激动剂组SH-SY5Y细胞的凋亡率及PERK、CHOP、Caspase-12、Bax的表达水平显著增加,存活率显著降低(P＜0.05);抑制剂组SH-SY5Y细胞的凋亡率及PERK、CHOP、Caspase-12、Bax的表达水平显著降低,存活率显著增加(P＜0.05);与si-NC+JEV组比较,si-PERK+JEV组SH-SY5Y细胞的凋亡率及PERK、CHOP、Caspase-12、Bax的表达水平P显著降低,存活率显著增加(P＜0.05).以上结果表明ERS的PERK通路激活与JEV诱导神经元凋亡有关.     

晚期糖基化白蛋白通过上调核苷酸结合寡聚结构域样受体蛋白3诱导巨噬细胞焦亡

本研究旨在探讨晚期糖基化白蛋白(advanced glycated albumin, AGE-alb)对巨噬细胞核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3 (nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3, NLRP3)-caspase-1途径的影响,以阐明AGE-alb对巨噬细胞焦亡的影响及机制。体外培养RAW264.7巨噬细胞,分别给予AGE-alb (1、2、4和6 g/L)、对照白蛋白(C-alb,4 g/L)处理24h或以NLRP3抑制剂MCC950 (1μmol/L)预处理细胞,1h后以AGE-alb(4g/L)处理24h。MTT法检测细胞活力,试剂盒测定caspase-1和培养基乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)活性以及白细胞介素-1β(interleukin-1β, IL-1β)、IL-18浓度,TUNEL法和Hoechst 33342/PI双染法检测细胞死亡情况,Westernblot分析NLRP3、procaspase-1和cleavedcaspase-1表达变化。结果显示:AGE-alb显著诱导RAW264.7巨噬细胞损伤,表现为细胞活力降低,LDH漏出、TUNEL阳性和PI阳性细胞率显著增加,且呈浓度依赖性,并可促进IL-1β和IL-18分泌。AGE-alb显著上调NLRP3表达和caspase-1活性,尤其在4和6 g/L浓度时更为明显。然而,MCC950预处理可抑制AGE-alb所诱导的RAW264.7巨噬细胞活力降低、LDH漏出、TUNEL阳性和PI阳性细胞率增加以及IL-1β和IL-18分泌,并可抑制AGE-alb所致的caspase-1活化。以上结果表明,AGE-alb可诱导RAW264.7巨噬细胞焦亡,其机制至少部分是通过激活NLRP3-caspase-1信号途径实现的。     

中介素1-53对高磷诱导人主动脉血管平滑肌细胞ERS-线粒体凋亡通路及钙化的影响

摘要 目的：探讨中介素1-53（IMD1-53）对高磷诱导人主动脉血管平滑肌细胞（HA-VSMC）内质网应激（ERS）-线粒体凋亡通路及钙化的影响。方法：体外培养HA-VSMC,MTT法检测IMD1-53对HA-VSMC的毒性作用。HA-VSMC中添加10 mmol/L β-甘油磷酸盐进行高磷诱导,使用0.1 nmol/L或0.5 nmol/L IMD1-53干预,并在0.5 nmol/L IMD1-53干预基础上添加ERS诱导剂衣霉素（TM）,流式细胞仪检测HA-VSMC凋亡率,茜素红S染色观察HA-VSMC中钙盐沉积,酞络合酮比色法测定HA-VSMC中钙含量,分光光度法检测HA-VSMC中碱性磷酸酶（ALP）活性,蛋白质印迹法（Western blot）检测HA-VSMC中钙化以及ERS--线粒体凋亡通路相关蛋白表达。结果：IMD1-53浓度≤2.5 nmol/L时,对HA-VSMC细胞活力无明显影响（P＞0.05）,故选择对细胞无明显毒副作用的低、高2个剂量（0.1、0.5 nmol/L）进行后续实验。高磷诱导后,HA-VSMC凋亡率、钙含量、ALP活性以及Runt相关转录因子-2（Runx2）、骨桥蛋白（OPN）、Bcl-2相关X蛋白（Bax）、裂解的半胱氨酰天冬氨酸蛋白酶-3（cleaved caspase-3）、葡萄糖调节蛋白78（GRP78）、C/EBP同源蛋白（CHOP）、感受器活化转录因子6（ATF6）、p-需肌醇酶1（IRE1）/IRE1蛋白表达水平升高（P＜0.05）,橘红色结节明显增多,骨保护素（OPG）、B细胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）蛋白表达水平降低（P＜0.05）。0.1 nmol/L和0.5 nmol/L IMD1-53干预处理均可降低HA-VSMC凋亡率、钙含量、ALP活性以及Runx2、OPN、Bax、cleaved caspase-3、GRP78、CHOP、ATF6、p-IRE1/IRE1蛋白表达水平（P＜0.05）,明显减少橘红色结节,升高OPG、Bcl-2蛋白表达水平（P＜0.05）。ERS诱导剂TM可升高HA-VSMC中GRP78、CHOP、ATF6、p-IRE1/IRE1蛋白表达水平,并减弱IMD1-53抑制高磷诱导的HA-VSMC ERS、凋亡和钙化的作用。结论：IMD1-53可减轻高磷诱导的HA-VSMC钙化,其作用机制可能与抑制ERS-线粒体凋亡通路激活,减少细胞凋亡有关。     

高糖诱导滋养层细胞内质网应激及凋亡

目的探讨高糖对滋养层细胞系HTR-8内质网应激及凋亡的影响。方法用不同浓度的含糖培养基培养人滋养层细胞系HTR-8细胞24小时,实时定量PCR检测细胞中内质网应激相关分子CHOP、GRP78、ATF6、XBP-1 mRNA的表达水平;Western blot检测CHOP、GRP78蛋白表达水平;流式细胞术检测细胞早期凋亡率。结果实时定量PCR结果显示,与正常血糖及渗透压对照组相比,高糖组CHOP及XBP-1 mRNA表达水平显著升高,GRP78 mRNA表达降低,ATF6表达无差异;Western blot检测显示,CHOP蛋白表达水平升高,GRP78蛋白表达水平降低;流式细胞术检测显示,高糖组细胞早期凋亡率增加。正常血糖组与渗透压对照组相比,CHOP、GRP78、ATF6、XBP-1 mRNA、蛋白表达水平及细胞早期凋亡率均无差异。结论高糖能激活滋养层细胞HTR-8内质网应激,并诱导细胞凋亡。     

沉默UVRAG基因在二烯丙基二硫诱导K562细胞中caspase3的表达

目的:沉默UVRAG基因在DADS诱导K562细胞中观察caspase3的表达。方法:以K562细胞为细胞模型,将构建成功并筛选出最有效干扰抑制UVRAG基因的si RNA序列片段采用lipofectamine TM2000脂质体转染法转染白血病K562细胞,组别为:空白对照组,转染试剂组、阴性对照组,阳性对照组,转染24小时后,利用QT-PCR检测UVRAG m RNA的表达水平以此观察干扰效果,再以40 mg/LDADS处理转染试剂组12小时,采用蛋白印迹(Western Blotting)技术检测凋亡相关基因caspase3的表达。结果:QT-PCR显示:与空白组相比,UVRAG m RNA表达明显减少,表明沉默UVRAG基因成功;Western Blotting显示:DADS处理的干扰成功的K562细胞12小时后,检测到caspase3的蛋白表达水平下降。结论:沉默UVRAG基因能使白血病K562细胞中凋亡相关基因caspase3的蛋白表达水平下降,提示抑制UVRAG表达的同时也可能抑制DADS诱导K562细胞的凋亡。     

RNA干扰c-maf基因表达对多发性骨髓瘤细胞凋亡的影响及机制研究

目的:探讨RNA干扰c-maf基因表达对多发性骨髓瘤细胞凋亡的影响及机制。方法:将人骨髓瘤细胞株NCI-H929分为正常对照组、转染si RNA Control的阴性对照组和转染si RNA c-maf基因的沉默组,转染48 h后,提取细胞中的蛋白,Western blot检测各组细胞中c-maf的蛋白表达,流式细胞仪检测细胞凋亡情况,Western blot检测凋亡相关蛋白Cleaved caspase3及Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白β-catenin和Cyclin D1蛋白表达。结果:阴性对照组c-maf的蛋白表达与正常对照组比较差异无统计学意义(P0.05),沉默组c-maf的蛋白表达显著低于正常对照组(P0.01),而阴性对照组c-maf的蛋白表达与正常对照组比较差异无统计学意义(P0.05)。与阴性对照组比较,沉默组的细胞凋亡率显著升高,Cleaved caspase3蛋白显著上调表达,β-catenin和Cyclin D1蛋白显著下调表达(P0.01)。结论:RNA干扰c-maf基因表达可诱导多发性骨髓瘤细胞凋亡,其机制可能与抑制Wnt/β-catenin信号通路有关。     

CXCL1促进内质网应激在肝癌肿瘤微环境中传递

目的:研究趋化因子1(CXCL1)对肝癌肿瘤微环境中肿瘤细胞间及肿瘤细胞和巨噬细胞间内质网应激(ERS)的作用。方法:收集受衣霉素(TM)刺激的HepG2细胞的上清作为条件培养基,用于培养未受TM刺激的HepG2和THP-1细胞,检测培养基中未折叠蛋白反应(UPR)相关蛋白IRE1、PERK和ATF6的mRNA表达,构建ERS在细胞间传递的模型;合成si-CXCL1,瞬时转染HepG2细胞,RT-PCR检测HepG2细胞的CXCL1的转染效率,ELISA检测上清中CXCL1的表达水平;TM刺激CXCL1敲低的HepG2细胞,收集其上清用于培养未受TM刺激的HepG2和TPH-1细胞,RT-PCR检测HepG2细胞和THP-1细胞中UPR相关的IRE1、PERK及ATF6的mRNA表达。结果:用TM刺激后的条件培养基培养HepG2和TPH-1细胞时,2种细胞中的IRE1、PERK、ATF6表达均上调,构建了ERS在细胞间传递的模型;si-CXCL1转染HepG2细胞后,与对照组相比,si-CXCL1组HepG2细胞中CXCL1的表达降低,同时ELISA检测培养基中的CXCL1也降低;用TM刺激CXCL1敲低的HepG2细胞的上清培养未受TM刺激的HepG2和TPH-1细胞后,与对照组相比,CXCL1血清敲低组培养的细胞中IRE1、PERK和ATF6的mRNA水平均下降。结论:CXCL1能够促进肝癌肿瘤微环境中内质网应激在细胞间传递。     

CHOP双重调控衣霉素诱导的DU-145细胞凋亡及自噬的研究

目的研究内质网应激分子CHOP调控细胞凋亡与自噬的作用和机制。 方法利用衣霉素诱导DU-145细胞产生内质网应激,Western Blot法检测内质网应激相关分子Grp78、Grp94、p-eIF2α和CHOP及自噬蛋白LC3Ⅱ、Atg5和Beclin1的表达;用流式细胞术检测细胞凋亡水平;沉默CHOP基因,用Western Blot法检测凋亡蛋白PARP、Caspase3的表达,流式细胞术检测细胞凋亡;并利用免疫荧光检测自噬标志性蛋白LC3B的表达。 结果衣霉素诱导DU-145细胞内质网应激能诱导一定程度的细胞凋亡,衣霉素处理8、12、24?h的细胞凋亡率分别为3.27﹪±1.02﹪,8.97﹪±0.71﹪和11.67﹪±1.41﹪,处理12?h及24?h的细胞凋亡率与对照组相比差异具有统计学意义（P < 0.01）。同时也能通过抑制PI3K/AKt/mTOR信号通路激活DU-145细胞自噬。CHOP基因沉默抑制细胞凋亡,shCtrl组细胞凋亡率为32.17﹪±3.93﹪,shCHOP-1组细胞凋亡率为23.53﹪±3.41﹪,两组相比差异具有统计学意义（P < 0.05）。且CHOP基因沉默能促进细胞自噬分子LC3B的表达。 结论衣霉素诱导DU-145细胞内质网应激状态下,CHOP在细胞凋亡与自噬之间发挥双重调控作用。     

miRNA378*表达对柯萨奇B3病毒感染乳鼠心肌细胞凋亡、网腔钙结合蛋白、内质网应激伴侣蛋白表达的影响

目的：研究沉默miRNA378^*表达对柯萨奇B3病毒（CVB3）感染心肌细胞凋亡、内质网应激、网腔钙结合蛋白（calumenin）影响。方法：原代培养乳鼠心肌细胞分为：对照组（正常细胞）、柯萨奇病毒感染组（正常细胞+柯萨奇B3病毒）、miRNA378^*沉默对照组（正常细胞+柯萨奇B3病毒+转染miRNA378^*空质粒）、miRNA378^*沉默组（正常细胞+柯萨奇B3病毒+转染miRNA378^*沉默质粒）,各组细胞分别转染和感染处理后置37℃、CO₂培养箱中培养3 d。检测细胞α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、细胞凋亡率、网腔钙结合蛋白、葡萄糖调节蛋白78（GRP78）及内质网应激信号通路因子激活转录因子6（ATF6）、转录因子C/EBP同源蛋白（CHOP）的表达。结果：通过检测ɑ-SMA蛋白,证实分离乳鼠细胞为心室肌细胞。TUNEL法检测不同组心室细胞凋亡情况发现,柯萨奇病毒感染组心室肌细胞凋亡明显,与柯萨奇病毒感染组心肌细胞相比较,miRNA378^*沉默组心肌细胞凋亡细胞量明显减少。与柯萨奇病毒感染组比较,Calumenin表达减少（P<0.01）,而GRP78、ATF6、CHOP表达增加（P<0.01）。结论：CVB3病毒感染心肌细胞作用与miRNA378^*,引发内质网应激并激活信号通路因子,心肌细胞凋亡增加。     

CHOP在三氧化二砷诱导SMMC-7721 凋亡中的作用

目的:探讨CHOP在三氧化二砷(Arsenic Trioxide,As_2O_3)诱导肝癌细胞系SMMC-7721凋亡中的作用。方法:通过MTT法观察不同浓度的As_2O_3对肝癌细胞系SMMC-7721增殖活性的影响;通过流式细胞术检测不同浓度的As_2O_3作用后,SMMC-7721细胞的凋亡率;以Western-blot方法检测As_2O_3处理SMMC-7721细胞后,内质网应激相关蛋白GRP78,CHOP的变化。通过CHOP siRNA沉默CHOP后,观察As_2O_3对SMMC-7721细胞凋亡的影响。结果:As_2O_3能显著抑制SMMC-7721细胞的增殖活性,并呈剂量依赖性诱导SMMC-7721细胞的凋亡;Western blot结果显示三氧化二砷诱导内质网应激相关蛋白的表达。CHOP siRNA沉默CHOP后能够显著抑制As_2O_3对SMMC-7721细胞凋亡的诱导。结论:As_2O_3诱导SMMC-7721细胞凋亡可能与其诱导CHOP表达有关。     

沉默信息调节因子3促进肝癌细胞凋亡及其机制研究

该文旨在探讨沉默信息调节因子3(sirtuin 3,SIRT3)对肝癌细胞凋亡的影响,并研究SIRT3调节肝癌细胞凋亡的分子机制。运用流式细胞术检测SIRT3过表达对肝癌细胞系(SMMC-7721和SK-Hep-1)凋亡的影响;通过si RNA靶向沉默SIRT3并检测SIRT3沉默对肝癌细胞凋亡的影响;实时荧光定量PCR(Real-time PCR)分析SIRT3对Bcl-2家族成员m RNA水平的影响,筛选受SIRT3调节的Bcl-2家族成员;Western blot进一步检测SIRT3对目标Bcl-2家族成员蛋白水平的影响;流式细胞术分析目标Bcl-2家族成员在SIRT3诱导肝癌细胞凋亡中的作用。结果显示,SIRT3过表达促进肝癌细胞凋亡并引起Bax mRNA和蛋白水平升高;SIRT3沉默抑制肝癌细胞凋亡,同时也抑制Bax蛋白水平表达,Bax沉默显著减少了SIRT3过表达细胞中的凋亡数目。该研究结果提示,SIRT3通过凋亡调节基因Bax诱导肝癌细胞凋亡。     

SIRT6基因沉默对人肝癌细胞凋亡的影响及其机制研究

该文旨在探讨慢病毒介导的沉默信息调节因子6(silent information regulator 6,SIRT6)基因沉默对人肝癌细胞凋亡的影响及其机制。逆转录PCR(RT-PCR)和Western blot分别检测人肝癌细胞系(SK-Hep-1、Huh-7、PLC/PRF/5、Hep G2)和永生化肝细胞系(MIHA)中SIRT6基因的表达水平;利用慢病毒介导的sh RNA干扰技术靶向沉默SIRT6的表达,并通过RT-PCR和Western blot验证其沉默效率;流式细胞术检测SIRT6基因沉默对人肝癌细胞凋亡的影响,进一步应用RT-PCR和Western blot检测SIRT6基因沉默对凋亡抑制蛋白基因(inhibitor of apoptosis proteins,IAPs)家族m RNA和蛋白质水平的影响;最后,应用流式细胞术分析X连锁凋亡抑制蛋白基因(X-linked inhibitor of apoptosis protein gene,XIAP)在SIRT6基因沉默诱导的肝癌细胞凋亡中的作用。结果显示,SIRT6基因在人肝癌细胞系中表达上调;慢病毒介导的sh RNA能抑制人肝癌细胞中SIRT6基因的表达;沉默SIRT6基因的表达能诱导人肝癌细胞凋亡,并降低XIAP的m RNA和蛋白质水平;过表达XIAP能逆转SIRT6基因沉默所诱导的人肝癌细胞凋亡。该研究结果提示,SIRT6基因沉默可能通过调节XIAP的表达从而诱导人肝癌细胞凋亡。     

PACE4对异丙肾上腺素诱导的心肌细胞凋亡的影响及其机制

目的:研究前体蛋白转化酶枯草溶菌素(PACE4)对异丙肾上腺素(ISO)诱导的心肌细胞凋亡的作用及其可能的作用机制。方法:构建pFLAG-PACE4重组表达载体并转染H9c2心肌细胞。将心肌细胞分为四组:正常对照组(无任何干预因素)、ISO组(10μmol/L ISO)、ISO+pFLAG组(空载质粒pFLAG转染+10μmol/LISO)、ISO+pFLAG-PACE4组(pFLAG-PACE4重组表达质粒转染+10μmol/LISO)。采用AnnexinV-FITC/PI双染法测定心肌细胞凋亡率;蛋白免疫印迹法检测活性半胱氨酸蛋白酶(caspase)-3、caspase-12、钙网蛋白、葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白(CHOP)、活化转录因子4(ATF4)和PERK的表达以及真核起始因子2α(eIF2α)的磷酸化水平。结果:与正常对照组相比,ISO组中PACE4表达水平明显降低,而转染pFLAG-PACE4质粒后,其表达水平显著增加。PACE4过表达可以显著抑制ISO诱导的细胞凋亡和caspase-3以及caspase-12的蛋白表达。ISO处理显著增加内质网应激分子钙网蛋白、GRP78和CHOP的表达,而PACE4过表达则可以抑制这些蛋白的表达。ISO诱导的PERK、eIF2α和ATF4的表达可以显著被PACE4过表达抑制。结论:PACE4过表达可以抑制ISO诱导的H9c2心肌细胞凋亡,其机制可能与PERK信号通路介导的内质网应激反应有关。     

单宁酸协同顺铂增强肝癌HepG2细胞内质网应激PERK-ATF4通路的激活水平

本文主要研究单宁酸(TA)联合顺铂(CDDP)对肝癌Hep G2细胞内质网应激PERK-ATF4通路的影响,以探究TA协同CDDP抗肝癌的分子机制。用180μM TA、0.9μg/m L CDDP单独用药或者联合用药处理肝癌Hep G2细胞24 h和48 h后,利用实时荧光定量PCR技术(q-RT-PCR)、蛋白免疫印迹(Western Blot)技术检测细胞PERK、p-PERK、ATF4、CHOP、Procaspase3与Cleaved caspase3分子的表达水平。q-RT-PCR及Western Blot结果显示,TA与CDDP联合用药能显著上调细胞PERK、ATF4、CHOP的表达水平和Caspase3的剪切活化水平,下调PERK的磷酸化水平(P0.01或P0.05)。TA协同CDDP增强了肝癌Hep G2细胞内质网应激PERK-ATF4通路的激活水平,其可能是通过激活细胞ERS,促进PERK-ATF4通路相关分子和ERS标志性分子CHOP的表达,抑制PERK的磷酸化,从而促进Caspase3的剪切活化来诱导细胞凋亡的发生。     

转录因子GADDl53/CHOP的激活与糖尿病大鼠肾组织固有细胞凋亡的关系初探

目的检测内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)标志蛋白:葡萄糖调节蛋白(GRP78/Bip)、转录因子GADDl53/CHOP在糖尿病大鼠肾脏细胞中表达及其与肾脏固有细胞凋亡之间的关系,初步探讨ERS在糖尿病肾损害中的作用及机制。方法单侧肾切除大鼠腹腔注射链脲佐菌素诱发糖尿病,于8周应用免疫组织化学检测GRP78、GADDl53/CHOP的表达与定位,TUNEL染色检测细胞凋亡部位,流式细胞术检测细胞凋亡程度,并对GRP78、GAD-Dl53/CHOP表达水平进行半定量分析,同时观察尿蛋白、BUN、尿肌酐等反应肾功能的相关指标。结果建模8周,糖尿病大鼠较正常组的肾细胞凋亡率明显升高,GRP78、GADDl53/CHOP表达明显增加。结论糖尿病肾损害过程中,ERS被诱导并可能通过激活转录因子GADDl53/CHOP引起肾脏细胞过多丢失,在糖尿病肾病的发病机制中起重要作用。     

巨噬细胞冠蛋白-1 siRNA对小鼠巨噬细胞吞噬功能的影响

巨噬细胞冠蛋白-1(Coronin-1)与结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)逃逸免疫杀伤有关。该研究探讨了p S-EGFP-SP-Coronin-1si RNA重组质粒靶向抑制巨噬细胞Coronin-1表达后对小鼠巨噬细胞吞噬功能的影响。用该质粒转染小鼠巨噬细胞系RAW264.7,采用RT-PCR法和Western blot检测质粒转染前后细胞Coronin-1的表达水平。以耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)分别感染转染质粒组细胞和对照组细胞,通过细胞内细菌菌落计数和细胞爬片抗酸染色法评估巨噬细胞转染质粒前后对细菌的吞噬能力;利用流式细胞术检测转染质粒组细胞及对照组细胞吞噬耻垢分枝杆菌后不同时段的细胞凋亡水平。结果显示,该质粒能显著抑制RAW264.7细胞Coronin-1的m RNA水平及蛋白表达水平;感染耻垢分枝杆菌6 h后,转染质粒组细胞内细菌数显著高于对照组细胞(P0.05);感染耻垢分枝杆菌48 h后,转染质粒组细胞凋亡水平显著高于对照组细胞(P0.05)。以上结果表明,p S-EGFP-SP-Coronin-1si RNA重组质粒能显著抑制巨噬细胞Coronin-1的表达,并可显著促进巨噬细胞吞噬细菌和凋亡杀菌,为开发靶向巨噬细胞Coronin-1的抗结核基因治疗措施奠定基础。     

NF-κB介导哮喘过敏原刺激后支气管上皮细胞的凋亡

目的研究核转录因子κB(NF-κB)在哮喘过敏原刺激后支气管上皮细胞中的表达及对细胞凋亡的影响。方法以300U/L尘螨抗原提取物作为过敏原刺激支气管上皮细胞系16HBE细胞,应用RT-PCR和Western blot检测尘螨抗原提取物刺激对16HBE细胞NF-κB(p65)表达水平的影响;用NF-κB(p65)sh RNA沉默16HBE细胞内NF-κB表达后,应用流式细胞术和Western blot检测NF-κB(p65)在过敏原刺激诱导16HBE细胞凋亡中的作用。结果过敏原刺激后使16HBE细胞内NF-κB(p65)m RNA和蛋白水平明显上调,明显诱导16HBE细胞凋亡和活化型caspase-3水平上调,沉默NF-κB可使过敏原刺激诱导的16HBE细胞凋亡率降低和活化型caspase-3水平上调减少。结论 NF-κB可介导哮喘过敏原刺激后的支气管上皮细胞凋亡。     

内质网应激促进肺动脉平滑肌细胞的表型转化

目的:探讨内质网应激(ERS)对肺动脉平滑肌细胞表型转化的影响。方法:采用胶原酶Ⅰ消化法培养原代大鼠肺动脉平滑肌细胞(PASMCs),用衣霉素(TM)或4-苯基丁酸(4-PBA)诱导或抑制内ERS,MTS法评价细胞增殖情况,western blot和定量RT-PCR检测蛋白和mRNA表达情况。结果:TM呈浓度依赖性诱导内质网应激标志物GRP78和XBP1 mRNA表达;较低浓度的TM促进PASMCs增殖,高浓度(5μg/mol)使细胞凋亡;TM使PASMCs表达SM22 alpha减少,分泌Ⅰ型胶原增加;4-PBA预处理可逆转TM诱导PASMCs的SM22 alpha减少和Ⅰ型胶原分泌增加。结论:内质网应激促进肺动脉平滑肌细胞表型转化,可能是内质网应激参与肺动脉高压的机制之一。