TTV武汉分离株DNA克隆和序列分析

用PCR技术从一武汉病人血清中分离获得TGV DNA片断,把此DNA片断克隆到pMD18-T质粒载体中,进行全序列测定并用计算机软件对核苷酸,氨基酸序列和ORF2多肽特征进行比较和分析。所分离获得的TTV DNA片断全长1333bp,含TTV完整的ORF2及部分ORF1序列,核苷酸和氨基酸序列与其它基因型为1a的TTV分离株具有极高的同源性。ORF2多肽含202个氨基酸,在N端部分和C端部分具有较高的亲水性和较强的抗原性,而中间为一段疏水区域,抗原性较弱。N端结构以α螺旋为主,含有典型的酪氨酸激酶磷酸化价点（RARDWYPGY,38－45aa）和三个潜在的蛋白质激酶C的磷酸化位点,C端富含脯氨酸。结构以β转向为主,含有三个连续的N－十四烷酰化位点,推测ORF2编码的蛋白可能是一种磷酸化蛋白。     

锦鲤疱疹病毒丹东株ORF83基因克隆及生物信息学分析

锦鲤疱疹病毒病是具有高致病性、传染性的疾病,对渔业生产造成巨大的危害。为了研究锦鲤疱疹病毒衣壳蛋白ORF83的结构和功能,本研究采集感染锦鲤疱疹病毒活鱼样品,经DNAStar软件预测分析、DNA提取,PCR扩增、重组质粒构建等步骤成功克隆到ORF83(1)和ORF83(2)基因。应用生物信息学分析蛋白结构与功能,并构建系统进化树。结果显示,两蛋白均能编码前体蛋白,均由α螺旋、β折叠、无规则卷曲组成,均有4个跨膜区域;抗原性较好;但不含保守结构域;ORF83(1)N端11个氨基酸序列为信号肽序列;ORF83(2)N端33个氨基酸序列为信号肽序列;ORF83(1)氨基酸序列存在1个潜在的N-糖基化位点、ORF83(2)氨基酸序列存在3个潜在的N-糖基化位点,两蛋白均潜在13个磷酸化位点,无潜在的O-糖基化位点;系统进化树分析表明,KHV-DD ORF83与美国株、以色列株、日本株均具有同源性。通过研究表明,本研究成功克隆到ORF83基因,并对其结构和功能进行分析,获得重要的生物信息学数据,为进一步研究锦鲤疱疹病毒发病机制和疱疹病毒抗体制备等提供了理论基础。     

大熊猫核糖体蛋白S11亚基基因(RPS11)cDNA的克隆及序列分析

RPS11是核糖体小亚基40S的组成部分,由RPS11基因所编码,属于核糖体蛋白S17p家族,主要存在于真核生物中.为了解大熊猫核糖体蛋白亚基RPS11基因的结构特点及其与已报道的人和其他哺乳动物核糖体蛋白亚基RPS11 基因的异同,本研究根据已报道的部分哺乳动物核糖体蛋白S11亚基基因(RPS11)的相关信息设计引物,运用RT-PCR 技术从大熊猫的肌肉组织总RNA中成功克隆了核糖体蛋白亚基RPS11基因,并进行了测序和序列分析.结果表明:大熊猫RPS11亚基基因的开放阅读框(ORF)长为477 bp,编码158 个氨基酸的蛋白质,该蛋白的相对分子量为18.4275 kDa,pI为10.96.拓扑预测显示该蛋白含有14个功能位点:即2 个N-糖基化位点,6个蛋白激酶C磷酸化位点,4个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点,1个酪氨酸激酶磷酸化位点和1个核糖体蛋白S17 signature位点.进一步分析发现,大熊猫RPS11基因与已报道的部分哺乳动物的表达序列及其编码的氨基酸序列都具有很高的相似性.本研究结果为丰富和完善哺乳动物RPS11基因资源库提供了基础资料.     

地中海拟无枝菌酸菌U32中amrC/amkC基因的序列分析及在大肠杆菌中的表达

从力复霉素SV产生菌--地中海拟无枝菌酸菌(Amycolatopsismediterranei)U32的硝酸盐同化基因簇的上游克隆了一个2.6kb的EcoRI-XhoIDNA片段并测定其序列.序列分析表明,该DNA片段编码两个完整的开放阅读框架(ORF),ORF2的起始密码子GTG与ORF1的终止密码子TGA在TG处重叠.ORF1编码一个含224个氨基酸的多肽,它同放线菌中典型的应答调节蛋白包括AfsQ1和MtrA有很高的同源性;ORF2编码一个含472个氨基酸的蛋白,它同包括AfsQ2和MtrB在内的组氨酸激酶同源.ORF1和ORF2有可能构成典型的双组份信号传导系统,分别命名为amrC和amkC.在T7启动子的控制下,完整的amrC和去除子N端一个可能的跨膜区的amkC在大肠杆菌中分别得到了高效表达,表达蛋白的分子量分别为30kD和46kD,与推测蛋白的分子量一致.     

大熊猫酸性核糖体磷酸蛋白P1 基因cDNA 克隆及序列分析

运用RT-PCR 技术,从大熊猫的肌肉组织总RNA 中成功克隆了酸性核糖体磷酸蛋白P1 (RPLP1)基因的表达序列,并对其进行了测序及初步分析。结果表明:大熊猫RPLP1 基因的表达序列全长为448 bp,开放阅读框(ORF)为344 bp,编码114 个氨基酸的蛋白质,该蛋白的分子量为11.566 kDa,pI 为4.4,含有3 个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点和2 个N - 酰基化位点。进一步分析发现,大熊猫RPLP1 基因的表达序列及其编码的氨基酸序列与已报道的部分哺乳动物具有很高的相似性。      

内蒙古白绒山羊翻译控制肿瘤蛋白(TCTP)基因克隆及组织表达特性分析

旨在克隆内蒙古白绒山羊翻译控制肿瘤蛋白(Translationally controlled tumor protein,TCTP)基因并分析其表达模式。采用RT-PCR技术扩增TCTP基因编码区cDNA序列,将得到的基因cDNA序列及其编码的氨基酸序列进行生物信息学分析,利用定量RT-PCR方法检测TCTP基因在绒山羊不同组织中的表达特异性。获得的内蒙古白绒山羊TCTP基因编码区cDNA序列全长519 bp,包含了完整的ORF,编码172个氨基酸残基组成的蛋白质。核苷酸序列与绵羊、牛、猪、人、猴及大鼠的同源性在99%-95%之间。生物信息学分析表明,编码的蛋白质理论分子质量19.6 kD,等电点(pI)4.673,含有一个N端糖基化位点,一个蛋白激酶C磷酸化位点,3个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点,定位于细胞质中。定量RT-PCR方法检测表明,TCTP基因在绒山羊肾脏、肌肉、胰腺、肝脏、睾丸和脑组织中均有表达,其中在肝脏中的表达量较高,在脑中表达量较低。     

杜梨铵转运蛋白基因的克隆表达及在梨属植物中的SNP分析

利用EST并结合RACE方法从杜梨幼苗克隆获得1个AMT基因(PbAMT1;2).分析显示,PbAMT1;2cDNA全长1 811 bp,开放阅读框为1 515 bp,其对应基因组DNA序列不含内含子.PbAMT1;2编码的蛋白由504个氨基酸组成,具有11个跨膜域,1个N-糖基化位点、3个酪蛋白激酶磷酸化位点和8个蛋白激酶C磷酸化位点.同源性分析发现,PbAMT1;2与其他植物的AMT具有较高的一致性,其中与百脉根LjAMT1;2的一致性为80.23%,与拟南芥AtAMT1;2的一致性为78.68%,与番茄LeAMT1;2的一致性为77.80%.系统进化树分析表明,PbAMT1;2属于AMT1亚家族.半定量RT-PCR结果显示,PbAMT1;2主要在根部表达,而在茎和叶中几乎没有表达.以杜梨、豆梨、砂梨、白梨、秋子梨和西洋梨等6种梨属植物的DNA为模板,高保真Taq酶PCR扩增AMT1;2基因ORF区DNA序列,发现6种梨属植物的AMT1;2 ORF区DNA序列长度均为1 515 bp,相似性高达99.48%,但在44个核苷酸位点中存在SNPs,导致18个氨基酸位点发生变异,多态性频率为1SNP/34.43 bp,核苷酸变异度为2.9%,氨基酸变异度为3.57%.     

大熊猫RPS15 cDNA的克隆及序列分析

本研究运用RT-PCR技术,首次从大熊猫 Ailuropoda melanoleuca的肌肉组织总RNA中成功克隆了核糖体蛋白S15 (RPS15)基因的表达序列,并对其进行了初步分析.结果 表明:大熊猫RPS15基因的表达序列全长为442 bp,开放阅读框(ORF)为438 bp,编码145个氨基酸,该蛋白的分子量为17.0401 KDa, 等电点为10.3,含有2个依赖于cAMP和cGMP的蛋白激酶磷酸化位点, 5个蛋白激酶C磷酸化位点,4个N-酰基化位点及1个RPS19蛋白signature位点.进一步分析发现,大熊猫RPS15基因的表达序列及其编码的氨基酸序列与已报道的部分哺乳动物具有很高的相似性.     

花椰菜花叶病毒(新疆分离物)基因组DNA的全部核苷酸序列

用Maxam-Gilbert化学切断法,从含全长病毒DNA的克隆pCaMV C17中,测定了CaMV-XJ基因组的全部核苷酸序列。CaMV-XJ DNA含有8,060个碱基对。在不同的译读相位中,CaMV基因组含有6个主要ORF或可能的基因,与其他巳作全序列测定的三个CaMV分离物比较,有三个显著的差别;(1)ORFⅥ编码的氨基酸变化达16％,显著高于其他区域的变化和其他三个分离物之间的差别,(2)在ORFⅣ的近氨基末端有39bp的插入,它与被插入区的序列几乎是直接重复;(3)由于核苷酸置换而引入了终止信号,所以T.Hohn[2]推测,可能存在的ORFⅦ不可能编码有功能的蛋白。     

22株猪圆环病毒2型安徽分离株全基因组遗传进化分析

为了解安徽地区猪圆环病毒2型(PCV2)的分子流行病学及流行毒株遗传变异情况,本研究应用DNA Star软件,针对22株PCV2安徽分离株和26株GenBank登录的PCV2参考毒株,进行全基因组核苷酸序列、ORF1和ORF2核苷酸序列及其推导的氨基酸序列的同源性分析,并运用MEGA 6.0软件构建系统进化树.结果显示,22株PCV2安徽分离株基因组全长均为1 767 bp,相互之间的核苷酸序列相似度为94.6％～99.8％,与GenBank登录的26株PCV2参考毒株之间的核苷酸序列相似度为92.4％～99.8％.PCV2安徽分离株的ORF1核苷酸序列及其推导的氨基酸序列与参考毒株之间的相似度分别为94.3％～100％和85.4％～100％,ORF2核苷酸序列及其推导的氨基酸序列相似度分别为85.9％～99.9％和76.9％～100％.ORF2编码的Cap蛋白氨基酸序列在8～30、44～91、121～140及190～224几个区域存在突变,且有部分变异位点位于抗原表位区.22株PCV2安徽分离株分布于两个基因亚型,8株属于PCV2b,14株属于PCV2d.结果表明,PCV2安徽分离株的全基因组核苷酸序列较稳定且彼此间亲缘关系密切.ORF2的变异程度远高于ORF1,PCV2d基因亚型己经逐渐过渡成为安徽地区的主要流行毒株.Cap蛋白氨基酸序列在免疫反应区域内的变异可能影响PCV2的免疫原性.本研究结果丰富了安徽地区猪圆环病毒病的分子流行病学资料,同时也为有效防控该病提供了一定的参考依据.