尼罗红在测定细菌细胞中聚-β-羟基丁酸和其他脂类贮藏物质中的应用

通过对含有PHB和非PHB(脂类贮存物质(NPLD)的细菌细胞的尼罗红染色和荧光显微观察,证实尼罗红是一种很好的细菌细胞内贮存的脂类物质的荧光染色剂,灵敏度较高.可用于PHB和非PHB脂类贮藏物质荧光显微观察,并能在一定程度上将两者区分开来.     

钩端螺旋体聚Beta羟基丁酸(PHB)生物合成途径分析

【目的】致病型问号钩端螺旋体(问号钩体, Leptospira interrogans)和腐生型双曲钩体(L. biflexa)能够大量合成菌体内贮藏物, 这可能是钩体在营养贫瘠环境中长时间存活的主要原因之一。本研究对钩体聚Beta羟基丁酸(PHB)贮藏物进行定性定量测定, 通过基因组分析补充定义PHB合成主要功能基因, 并采用分子生物学方法初步证明PHB合成途径的完整性, 为进一步研究PHB合成与钩体抗逆能力的关系奠定基础。【方法】采用脂类特异性尼罗红染色法和浓硫酸氧化-紫外分光光度计测定法, 对问号钩体和双曲钩体的PHB贮藏物进行定性定量测定; 采用生物信息学方法(BLAST和InterProscan/InterPro2Go), 通过同源性分析和功能结构域搜索寻找钩体基因组中的PHB合成相关基因; 最后采用克隆测序和定量RT-PCR技术检测相关基因表达情况, 初步验证生物信息学预测结果。【结果】尼罗红染色和氧化后比色定量实验证明钩体合成细菌常见贮藏物PHB, 问号钩体合成量为菌体干重的42%?45%, 双曲钩体合成量为64%?68%。尽管已公布的多个钩体基因组中均没有定义完整的PHB合成途径, 但本研究通过综合生物信息学分析, 在问号钩体和双曲钩体中鉴定了PHB合成途径的主要功能基因(phbC)。克隆测序和定量RT-PCR证实钩体转录表达大部分PHB合成相关基因(phbA/B/C), 说明钩体内该生物途径基本完整, 且部分高水平表达基因可能是钩体主要的PHB合成相关基因。【结论】问号钩体和双曲钩体均可合成PHB贮藏物, 且具有基本完整的PHB合成生物途径。     

我国聚β—羟基丁酸的研究进展与展望

聚采β-羟基丁酸（PHB）是细菌细胞内积累的一种能被微生物的酶所降解的一种高分子聚合物,作为细胞内的能源和碳源物质。介绍了PHB的特性和应用情况。PHB的合成机理和主要技术方法,我国PHB的研究进展和展望等。     

一株嗜酸化能异养菌产胞内聚合物的研究

目的:探讨Fe3+对嗜酸兼性异养菌产聚-β-羟基丁酸酯(vim)的作用及其作用机制.方法:采用两种不同的培养基培养DXI-1,并利用浓硫酸煮沸法,定时检测菌体内PHB含量、细胞干种、培养基中剩余葡萄糖的含量变化.结果:在透射电镜照片中,我们发现细胞内聚集了大量的透明颗粒,并且已经鉴定为聚-β-羟基丁酸酯(PHB).我们还发现,在Fe3+存在的情况下,细菌DXI-1产PHB的能力急剧下降,仅为细胞干重的14.2%;而无Fe3+存在的情况下,细菌产PHB的能力达细胞干重的40.9%.结论:Fe3+对DXI=1产PHB的能力有一定的抑制作用.     

合成聚β-羟基丁酸(PHB)鞘细菌的分离、鉴定与筛选

通过富集培养和划线分离等手段从活性污泥中分离筛选到一株合成PHB鞘细菌FQ4 0 ,其生物学特征为 :杆菌 ,大小 (0 .6～ 1.5 ) μm× (1.5～ 5 .5 ) μm ;革兰氏染色阴性 ;具衣鞘 ,丝状体很长 ,偶见假分枝 ;亚端生鞭毛 ;胞内具PHB颗粒 ;菌落为光滑型和丝状型两种。经鉴定该菌株为鞘细菌类球衣菌属中的浮游球衣菌 (Sphaerotilusnatans)。对其合成PHB研究表明 :细胞内可积累大量的PHB颗粒 ,含量可达细胞干重的 30 .5 %。     

微生物合成塑料——聚羟基链烷酯

许多原核生物在非平衡生长条件下,在胞内合成并积累不同烷侧基的脂肪族聚-3-羟基脂类物质--聚羟基链烷酯(PHA),其中含甲基侧链的聚羟基丁酯(PHB)和含乙基侧链的聚羟基戊酯(PHV)是聚合物的主要成分,它们是高结晶热塑性物质,与化学合成的塑料一样能铸造成型、压制成型并能制成薄膜和纤维状材料。     

废弃活性污泥中产聚羟基脂肪酸酯菌株Bacillus sp. PB-3的发酵条件优化

通过尼罗红染色法结合荧光显微镜镜检,从废弃活性污泥中分离得到1株高产聚羟基脂肪酸酯(PHAs)的菌株Bacillus sp.PB-3,经气相色谱法鉴定该菌株胞内产物为聚β-羟基丁酸酯(PHB)。对培养基成分及发酵条件优化后,获得最佳培养方案:12 g/L的葡萄糖为C源,2 g/L的牛肉膏为N源,初始pH 7.5,培养基装液量80 mL,转速为200 r/min,37℃培养48 h,PHB质量分数可达菌体干质量的32.09%,比优化前提高30%。     

聚-β-羟基丁酸(PHB)在细菌建立感受态中的作用

介绍了PHB作为细胞膜上的物质运输通道成分在细菌感受态中的结构、分布、分析方法以及其可能的作用 ,阐明了PHB的合成与细菌感受态建立的关系和PHB在感受态细胞摄取外源DNA时的作用方式 ,同时也对控制生物体合成PHB的相关基因和酶作了简要介绍 ,并探讨了研究PHB的实际意义。     

利用光合细菌生产聚-β-羟基丁酸酯的研究进展

石油基塑料进入环境后会造成污染并影响人体健康。因此,寻找石油基塑料的替代品成为未来发展的趋势。生物塑料因其具有良好的生物降解性与安全性,近年来备受关注,尤其是作为生物塑料之一的聚-β-羟基丁酸酯(Poly-β-Hydroxybutyrate,PHB),已成为生产生物塑料制品的重要来源。光合细菌(Photosynthetic Bacteria,PSB)是生产PHB的重要原料。PSB可利用废水中廉价的碳源为底物累积PHB,能实现废水资源化,其应用前景广阔。本文系统地总结了目前可生产PHB的PSB菌种、PHB在菌体内的合成途径、影响PSB累积PHB的因素和目前利用废水培养紫色非硫菌(Purple Non-Sulfur Bacteria,PNSB)并累积PHB的研究现状,并对以废水生产PHB的PNSB污水资源化这一技术的工程化应用提出了展望,以期为解决石油基塑料污染与废水资源化提供新的思路与参考。     

PHB颗粒在红豆草根瘤细菌发育中的动态变化

红豆草根瘤胞间隙和侵入线中另有个别细菌含有PHB颗粒,而且数量很少,一个细菌通常仅有一个。随着细菌被从侵入线中释放到寄主细胞中,这些PHB颗粒立即消失。幼龄细菌不含PHB颗粒,成熟细菌一般也不含这种内含物。当细菌衰老时,它们又再度出现,并大量增加,而后很快减少,直至完全消失。从未发现这种颗粒存在于解体细菌中,尽管它们处于各种不同的解体状态。PHB颗粒在细菌发育中的变化表明,它的多少不仅与根瘤细菌发育密切有关,而且也受制于根瘤品种。     

东海表层沉积物纯培养与非培养细菌多样性

于2011年7月采集了浙江舟山沿岸海底沉积物样品(122°10′41″E,29°49′7″N),通过埋片原位观察、荧光显微计数、纯培养菌分离以及非培养细菌构建克隆文库的方法,分析和研究了东海表层沉积物细菌群落结构及其多样性.埋片原位观察和荧光显微计数法的结果表明:沉积物样品中细菌的细胞数量为(9.30±3.44)×107 cells/g;通过分离纯化共获得313株细菌,分属于20个属,4种培养基对细菌的分离效果依次为RO＞M l＞Zobell 2216＞MR2A;常规形态学与生理生化鉴定结果显示芽孢杆菌属(Bacillus)和海球菌属(Marinococcus)从数量和种类上皆为优势菌属,分别占分离菌株总数的21.08％和17.25％;对73株典型海洋细菌进行16S rDNA分子鉴定发现,厚壁菌门(57.5％)、γ-变形杆菌纲(32.9％)、黄杆菌纲(4.1％)和放线菌纲(5.5％)等为主要类群.非培养细菌克隆文库序列分析发现:细菌克隆子主要属于厚壁菌门和变形杆菌门,而芽孢杆菌纲和γ-变形杆菌纲是上述两个门的优势类群.综合纯培养与非培养数据得出东海海域表层沉积物细菌多样性丰富,具有进一步开发研究的价值.     

尼罗红荧光优化法快速检测微拟球藻细胞内油脂含量

【目的】利用尼罗红荧光染色法快速检测微拟球藻细胞内的油脂含量。【方法】系统性地调整激发波长与发射波长,确定最佳二甲基亚砜(DMSO)浓度、尼罗红终浓度、染色时间和细胞密度的范围,比较重量法和Triolein标准品的油脂含量分别与荧光强度之间的关系。【结果】分析得出了尼罗红荧光强度与微拟球藻细胞油脂含量的关系,确定优化后染色条件为:二甲基亚砜浓度为5%,尼罗红终浓度为1 mg/L,染色时间为6 min,且细胞密度为(0.5-3.0)×10~6 cells/m L的范围内,激发波长和发射波长分别为515 nm和570 nm。重量法和Triolein标准品的油脂含量分别与尼罗红染色荧光强度之间的关联性,表明尼罗红荧光染色方法可以用来快速准确地检测细胞内的油脂含量,且油脂含量与荧光强度之间正相关,相关系数R~2为0.997 3。尼罗红染色优化后油脂的检测下限达到2μg,大大减少了测定油脂含量所需细胞量。【结论】针对不同种属系统性地确认了荧光激发波长和发射波长,并优化验证得到了最佳尼罗红荧光染色条件,可以快速准确地检测微量微拟球藻细胞内的油脂含量,便于大规模筛选高产油突变藻株。     

聚3-羟基丁酸酯（PHB）生物降解过程的研究

利用DS9701菌株对聚3-羟基丁酸酯(PHB)膜进行降解,对降解到不同程度的PHB膜采用扫描电子显微镜观察其表面形态结构的变化,并对其降解产物进行分析测定.结果表明,PHB的生物降解首先发生在PHB表面的非晶部分,随后结晶部分开始降解,并且降解首先发生在球晶的中心部分.DS9701菌株所产生的PHB解聚酶主要降解PHB的第二个酯键,降解产物为二聚体.     

球衣细菌的分离和生物特性研究

报道一种有效分离球衣细菌 (Sphaerotilusnatans)的实验方法 ,并对球衣细菌实验菌株的菌落形态 ,碳、氮源物质 ,生长条件 ,生长曲线和PHB积累变化曲线等生物学特性进行了研究。研究结果能为球衣细菌的综合开发利用提供理论指导     

利用荧光蛋白标记研究稻瘟病菌有性世代的细胞结构

稻瘟病是水稻最重要的病害之一,同时稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)是植物病原真菌研究的模式生物。稻瘟病菌是异宗配合的子囊菌,但其有性世代的细胞学过程、形态结构、分子机制以及对病菌变异的贡献研究都较少,也缺乏必要的研究手段。该文利用荧光蛋白标记结合荧光染色的方法对稻瘟病菌有性世代结构进行了标记和显微观察,以期为稻瘟病菌有性生殖过程和机制研究提供方法与借鉴。将绿色荧光蛋白GFP和红色荧光蛋白m Cherry分别导入两个相对交配型的稻瘟病菌菌株Guy11(MAT1-2)和70-15(MAT1-1),各转化子及野生型按交配型组合对峙培养,观察有性世代结构中的荧光表达情况。结果表明,组蛋白H3启动子、核糖体蛋白RP27启动子和疏水蛋白MPG1启动子均可在稻瘟病菌有性孢子形成过程中高丰度表达。进一步利用这三种启动子和两种荧光蛋白对稻瘟病菌有性孢子的细胞器(细胞核、过氧化物酶体)进行标记和观察,结果表明,融合组蛋白H2B的m Cherry及融合核定位信号(NLS)的GFP均能有效标记子囊孢子细胞的细胞核,荧光集中而明亮;带有过氧化物酶体定位信号1(PTS1)的GFP可以有效地标记子囊孢子中的过氧化物酶体,每个细胞中均有数量不等的过氧化物酶体,表明子囊孢子中需要过氧化物酶体参与生化代谢。该文还利用脂肪染色剂尼罗红、BODIPY和细胞壁染色剂卡氏白结合荧光蛋白标记对子囊和子囊孢子进行组合染色。结果显示,尼罗红、BODIPY、卡氏白染色剂互不干扰,可以与不同颜色的荧光蛋白相互组合,从而更加清晰地标记子囊和子囊孢子的结构、细胞器和储藏物质。     

产聚β-羟基丁酸酯菌株的筛选及发酵条件的优化

作为一类可望替代传统塑料的新型可降解生物高分子材料,聚β-羟基丁酸酯(PHB)日益引起人们的重视。采用尼罗蓝荧光法从污水中初筛得到产PHB的细菌,摇瓶发酵复筛得到一株PHB产量较高的菌株AE13,同时对该菌株的发酵条件进行了正交优化,PHB的产量达到0.85g/L。     

甘蓝型油菜油体数量及面积之和与含油量的相关性

利用荧光染料尼罗红染色和激光扫描共聚焦显微观察技术,建立了油菜油体观察或生物体内中性脂类物质定性鉴定的研究体系。对高油品种宁油14号、宁油18号、ZH-088和低油品种ZL-366、NjY008、Westar共6个甘蓝型油菜品种子叶贮藏细胞内的油体进行了观察。研究发现：油菜种子成熟过程中,油体从着色不明显的小颗粒,逐渐发育形成着色清晰的球状大油体。种子成熟干燥后,油体间很少发生聚合。在成熟干燥的种子中,油体集中分布于子叶贮藏细胞中央,呈椭圆形或不规则形状,较少为圆形。通过研究种子内油体与含油量的关系,发现高油品种组与低油品种组之间在单个子叶贮藏细胞内油体数量和截面积之和存在明显差异,而在高油品种组内或低油品种组内的差异不明显。结果显示,油菜种子细胞中油体的数量和总面积与含油量之间存在正相关,可作为高油分材料的选择依据。     

甘蓝型油菜油体数量及面积之和与含油量的相关性

利用荧光染料尼罗红染色和激光扫描共聚焦显微观察技术, 建立了油菜油体观察或生物体内中性脂类物质定性鉴定的研究体系。对高油品种宁油14号、宁油18号、ZH-088和低油品种ZL-366、NjY008、Westar共6个甘蓝型油菜品种子叶 贮藏细胞内的油体进行了观察。研究发现: 油菜种子成熟过程中, 油体从着色不明显的小颗粒, 逐渐发育形成着色清晰的球状大油体。种子成熟干燥后, 油体间很少发生聚合。在成熟干燥的种子中, 油体集中分布于子叶贮藏细胞中央, 呈椭圆形或不规则形状, 较少为圆形。通过研究种子内油体与含油量的关系, 发现高油品种组与低油品种组之间在单个子叶贮藏细胞内油体数量和截面积之和存在明显差异, 而在高油品种组内或低油品种组内的差异不明显。结果显示, 油菜种子细胞中油体的数量和总面积与含油量之间存在正相关, 可作为高油分材料的选择依据。     

一株新型高产PHB假单胞菌SCH17的分离和特征分析

通过丁醇富集筛选,从土壤样品中筛选到一株菌株SCH17。经过生理特性和16S rRNA分析,鉴定菌株SCH17属于假单胞菌属。透射电镜显示该菌细胞内聚集了大量颗粒状物质,经过氯仿抽提和核磁共振分析,确认这些颗粒物质是聚β-羟基丁酸(PHB)。通过对碳源和氮源的优化,得到最佳积累PHB的碳源是果糖,氮源是蛋白胨。在该培养基中仅需发酵14 h,菌体干重和PHB含量均达到最大,分别为3.52 g/L和2.69 g/L,PHB含量高达细胞干重的76%。     

水稻成熟花药和花粉的结构和组织化学研究

用乙二醇甲基丙烯酸脂(简称GMA)和环氧树脂Epon812包埋的薄切片方法对水稻成熟花药和花粉的结构进行了观察,并对各种结构的性质和细胞中的后含物做了细胞化学的分析.对成熟花药的绒毡层膜及乌氏体的研究采用了分离技术,做了显微和超微观察.证明水稻成熟花药壁和花粉除具一般禾本科植物特征外,还揭示了花药壁表皮上可能有硅质,药壁表皮细胞内含有脂类颗粒,药室内壁具纤维素质的纤维状加厚;发现花粉粒中除了贮存有大量淀粉颗粒外,还含有脂类,成熟花粉中营养核与两个精细胞及两个精细胞间联系紧密;并讨论了薄切片的优越性,绒毡层膜的意义及其上细胞印迹的来源.