高效转化植物甾醇为9α-OH-AD的分枝杆菌诱变选育及工艺优化

以实验室前期筛选得到的分枝杆菌(Mycobacterium sp.LY-1)为出发菌株,采用等离子诱变(ARTP)技术选育出能高效转化植物甾醇为重要甾体药物中间体9α-羟基雄甾-4-烯-3,17-二酮(9α-OH-AD)的菌株,并对其转化工艺进行优化。经过ARTP诱变选育得到遗传稳定性较好的分枝杆菌突变株Mycobacterium sp.C33,当底物植物甾醇投料浓度为15 g/L时,转化生成9α-OH-AD的摩尔得率达到15.5%,较原始菌株提高34.8%。继而采用正交实验设计方法,对突变菌的发酵培养基组分进行优化,并建立了油水双相转化体系,进一步提高了突变菌株C33的产物摩尔得率,最高达到47.0%,较优化前(15.5%)提高了2倍。     

分枝杆菌LY-1转化植物甾醇产9α羟基雄烯二酮的发酵工艺优化

9α-羟基雄甾-4-烯-3,17-二酮(9α-OH-AD)是一种重要的甾体药物中间体,可用于糖皮质激素类药物的生产。为了提高目的产物的产量,以分枝杆菌(Mycobacterium sp.) LY-1作为出发菌株,研究不同碳源、氮源、磷酸盐和金属离子等培养基组分对菌株LY-1转化植物甾醇生产9α-OH-AD的影响,结合正交试验优化,确定最适培养基组分为玉米浆30 g/L、KNO_3 4.0 g/L、NaH_2PO_4 1.2 g/L、FeSO_4 0.075 g/L及CaCl_2 0.10 g/L。在此条件下,当植物甾醇投料质量浓度为15 g/L时,产物得率达到43.9%～44.9%。通过单因素实验优化培养条件,得到最适培养条件为pH 8.0、接种量2%、温度30℃时,9α-OH-AD的得率可达46.2%～47.0%,比优化前提高了22.1%,产量达到5.21 g/L,具有潜在的工业应用价值。     

响应面法优化热带假丝酵母104菌株产羰基还原酶发酵培养基

通过菌种优选得到产高选择性羰基还原酶的热带假丝酵母(Candida tropicalis)104菌株,可不对称还原1-(3,5-二三氟甲基)苯基乙酮生成(S)-1-(3,5-二三氟甲基)苯基乙醇,对映体过量值>99.9%。采用部分因子实验设计考察发酵培养基中各组分对产酶的影响,结果表明,酵母粉、葡萄糖和NH4Cl浓度对产酶影响显著。继而采用最陡爬坡路径逼近最大响应区域,并结合中心组合实验和响应面对3个显著性因素进行分析,得到优化的发酵培养基组成:葡萄糖47.14g/L,酵母粉13.25g/L,NH4Cl2.71g/L,MgSO4·7H2O0.4g/L,KH2PO41g/L和K2HPO41g/L。采用该优化培养基,供试菌株的羰基还原酶活力达851.13U/L,较优化前提高了65.2%。     

三羟基雄甾烯酮高转化菌株的选育及工艺优化

以能将去氢表雄酮 (DHEA) 转化为三羟基雄甾烯酮 (7α,15α-diOH-DHEA) 的赤霉菌Gibberella intermedia CA3-1为出发菌株,对其进行了诱变选育及工艺优化,以期提高转化效率。采用0.12 mg/mL亚硝基胍诱变处理赤霉菌孢子悬液30 min,以350 μmol/L酮康唑为最低抑制浓度进行抗性平板筛选,最终获得一株遗传稳定性较好的高产菌株M-10,其产物摩尔得率达到70.2%,为出发菌株的1.2倍。通过摇瓶转化工艺的优化,确定了突变菌株的最适转化工艺。在优化的转化工艺下,当底物DHEA投料浓度为5 g/L时,7α,15α-diOH-DHEA摩尔得率提高到75.6%,较原始菌株提高了31.3%。     

羰基还原酶产生菌SW2026的产酶条件及其不对称催化还原4＇-氯苯乙酮

以4＇-氯苯乙酮为模型底物,对筛选得到的Candida krusei SW2026的羰基还原酶产酶条件进行研究。结果表明：适宜的发酵培养基组成为甘油50g/L,玉米浆20g／L,KH2PO4 4g／L,MgSO4·7H2O 1．5g／L;适宜的培养条件为温度30℃,初始pH6,摇床转速200r／min,发酵周期48h。在产酶发酵条件下培养的湿细胞对4＇-氯苯乙酮进行不对称还原反应,产物（S）-4＇-氯-α-苯乙醇的产率最高达88．56％,e．e．值稳定在87％左右。     

假交替单胞菌Pseudoalteromonas sp. AJ5 产k-卡拉胶酶的培养条件优化

[目的]本研究的目的是优化Pseudoalteromonas sp. AJ5菌株的培养条件使之产生高活性的胞外κ-卡拉胶酶.[方法]通过富集培养技术从刺参肠道分离出一株卡拉胶降解菌AJ5,该菌株能利用卡拉胶作为惟一碳源和能源.依据形态学和生理学特征及16S rRNA基因序列分析,将该菌株鉴定为假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas).通过单因素试验和正交试验对Pseudoalteromonas sp. AJ5菌株产胞外κ-卡拉胶酶的培养条件进行了优化.[结果]单因素试验结果表明,Pseudoalteromonas sp. AJ5菌株的最佳培养条件为250 mL三角瓶装入75 mL发酵培养基、摇床转速150 r/min、接种量7%、pH8.0.单因素试验和正交试验结果显示该菌株的最佳培养基组成为κ-卡拉胶 1 g/L、牛肉膏2 g/L、 NaCl 20 g/L、K2HPO4·3H2O 1 g/L、 MgSO4·7H2O 0.5 g/L、 MnCl2· 4H2O 0.2 g/L、 FePO4 · 4H2O 0.01 g/L; 培养温度为28℃,培养时间为28 h.[结论]Pseudoalteromonas sp. AJ5菌株分泌胞外κ-卡拉胶酶,在最佳培养条件下,该菌株的κ-卡拉胶酶活力比优化前提高了4倍.     

鬼伞0901纤维素酶液体发酵条件研究

纤维素酶的低成本生产是第二代燃料乙醇产业化的关键.以农业废弃生物质为原料的液体发酵是纤维素酶规模化制备的发展趋势.利用实验室保藏的鬼伞0901 菌株,采用单因子比较的方法,初步考察了其发酵产纤维素酶的培养基组分和培养条件,培养基组分为(100mL 发酵液):菜籽饼1.2g,尿素0.09g,麸皮0.72g,蔗糖0.025g,MgSO4 · 7H2O 0.03 g,CaCl2 0.03g, FeSO4 · 7H2O 0.5 mg,MnSO4 ·H2O 0.16mg,ZnSO4 · 7H2O 0.14mg,CoCl2 0.2mg,KH2PO4 0.2g,;且培养条件初始pH 值为5,250mL 三角瓶中装液量为30mL,发酵周期为163h,菌株0901 的CMC 酶活最高达199.684U/mL.     

洋葱伯克霍尔德菌（Burkholderia cepacia）CF-66发酵生产新型抗菌物质CF66I培养基的优化

利用基于统计学的实验设计RSM（Response surface methodology）优化了Burkholderia cepacia CF-66产新型抗菌活性物质CF66I的发酵培养基组成。首先,用部分重复因子实验对培养基组分NH4Cl,MgSO4·7H2O,柠檬酸钠及酵母粉浓度对菌株产CF66I的影响进行评价,找出主要影响因子为柠檬酸钠和酵母粉。两者均为正影响,其他组分对CF66I活性的影响不显著。其次用最陡爬坡路径逼近最大响应区域。最后用中心组合设计及响应面分析确定主要影响因子的最佳浓度。菌株在优化培养基中培养较初始培养基CF66I活性提高了约两倍。     

无机磷分解菌BL-11的鉴定及其解磷能力研究

研究了解磷菌株BL-11的菌体形态、生理生化特性,结合该菌的16SrDNA序列分析结果,将菌株BL-11鉴定为侧孢短芽孢杆菌。菌株BL-11在以Ca3(PO4)2为唯一磷源的培养液中的可溶性磷得率为10.91%;在以砂子为唯一磷源的培养液中,可溶性磷得率为1.56%。分解Ca3(PO4)2的最佳条件为30℃,180r/min,pH7-8;最佳培养基配方为蔗糖20g/L,(NH4)2HCO30.3g/L,MgSO4.7H2O0.5g/L,NaCl0.3g/L,KCl0.5g/L,FeSO40.03g/L,MnSO4.H2O0.03g/L。     

2,3-丁二醇生产菌株生产能力的比较和培养基优化

对5株克雷伯氏肺炎杆菌 (包括两株乳酸途径被敲除的工程菌株) 发酵生产2,3-丁二醇能力进行了比较,其中K. pneumonia HR521 LDH (乳酸合成途径中ldhA基因被敲除) 具有最佳的发酵性能。通过正交试验优化了其发酵培养基的主要组分,优化后的培养基组成为：葡萄糖 90 g/L,(NH4)2HPO4 3 g/L,玉米浆 (CLSP) 6 g/L,乙酸钠 5 g/L,KCl 0.4 g/L,MgSO4 0.1 g/L,FeSO4·7H2O 0.02 g/L,MnSO4 0.01 g/L。在优化后的发酵培养基中进行摇瓶发酵,24 h发酵乙偶姻和2,3-丁二醇的终浓度为37.46 g/L,比未优化前增加了10 g/L,2,3-丁二醇得率达到了理论得率的90.53％,生产强度1.56 g/(L·h),检测不到副产物乳酸的生成,利于后提取工艺的进行和工业生产的应用。     

代谢甘油高产乳酸的菌种选育及培养基优化

分离出一株可高效利用甘油生产乳酸的菌株, 经过生理生化和16S rDNA分子鉴定, 确定其属于大肠埃希氏菌, 命名为Escherichia coli AC-521。通过五因素四水平正交试验, 优化了其最佳发酵培养基成分为初始甘油70 g/L, 酵母粉4 g/L, 蛋白胨7 g/L, (NH4)2SO4 10 g/L, K2HPO4 2.5 g/L。利用该最佳条件的5 L发酵罐批式补料发酵实验表明: 该菌株发酵80 h后, 乳酸产量可达到74.5 g/L, 得率为0.87 mol/mol甘油。     

4-丁内酰胺水解酶法制备γ-氨基丁酸

以吡咯烷酮为唯一碳源,从采集的土样中分离、筛选得到具有4-丁内酰胺水解酶活性的菌株.采用响应面分析法对该菌株的产酶培养基组分进行了优化研究并对酶促转化反应条件也进行了研究.结果表明:编号为HHSW-16的菌株水解活性最高.优化后的培养基组成为:葡萄糖11.50 g·L-1,牛肉膏6.35 g·L-1,酵母粉5.58 g...     

脱落酸产生菌的筛选及其产酸条件优化

利用马丁-孟加拉红培养基由20份土壤样品和2份植物病叶样品中分离出57株真菌,分别对其进行液体培养,通过各菌株发酵液抑制莴苣种子发芽的方法筛选得到一株脱落酸产生菌NX-53,通过L9(34)正交实验对其产酸条件进行了优化,该菌株产脱落酸的培养基配方和培养条件如下:葡萄糖25g/L,维生素B11.25mg/L,谷氨酸单钠盐3.0g/L,MgSO4·7H2O 0.2 g/L,KCl 0.5 g/L,CaCO3 5 g/L,KH2PO4 0.8 g/L,FeSO4·7H2O 0.5mg/L, ZnSO4·7H2O 2.5mg/L,CuSO4·5H2O 4mg/L,250mL摇瓶装液量50mL,28℃、150r/min培养7d.优化条件下菌株NX-53的脱落酸产量可达276 mg/L.     

α-淀粉酶高产菌株选育方法的研究

在含有氨苄青霉素1—10μg/ml的LB液体培养基中,接入枯芽孢杆菌BF7658菌悬液,在37℃下振荡培养3—5天,经平板分离单菌落以及摇瓶发酵试验,初筛获得2213、2104和2120等α-淀粉酶高产菌株。将2213菌株的菌悬液涂布于含有4-6μg/ml氨苄青霉素的2%淀粉培养基上,复筛得到4213、4218、4237等α-淀粉酶高产菌株。4213菌株再经4次亚硝基胍诱变,未能得到蛋白酶活性低、α-淀粉酶活性高的突变株。     

α-淀粉酶高产菌株选育方法的研究

在含有氨苄青霉素1—10μg/ml的LB液体培养基中,接入枯芽孢杆菌BF7658菌悬液,在37℃下振荡培养3—5天,经平板分离单菌落以及摇瓶发酵试验,初筛获得2213、2104和2120等α-淀粉酶高产菌株。将2213菌株的菌悬液涂布于含有4-6μg/ml氨苄青霉素的2%淀粉培养基上,复筛得到4213、4218、4237等α-淀粉酶高产菌株。4213菌株再经4次亚硝基胍诱变,未能得到蛋白酶活性低、α-淀粉酶活性高的突变株。     

转化RSA为氢化可的松的新月弯胞霉筛选

从土样中筛选到 1株能转化甾体化合物 RSA(17α-羟基孕甾 - 4 -烯 - 3,2 0 -二酮 - 2 1-醋酸酯 )生成氢可的松 (11β,17α,2 1-三羟基孕甾 - 4 -烯 - 3,2 0 -二酮 )的 C4菌株 ,经菌落形态与个体形态观察 ,初步鉴定为新月弯胞霉 (curvularia lunata)。正交实验确定该菌株的最适培养基为 :葡萄糖 10 g,黄豆粉 10 g,自来水 10 0 0 m L,p H6 .5.经硅胶层析和高交液相色谱测定 ,氢化可的松     

胆固醇转化菌株的筛选及发酵条件优化

【目的】从土壤中筛选及鉴定具有转化胆固醇能力的菌株SE-1,对转化产物进行结构鉴定,并通过一定的工艺条件优化提高转化产率。【方法】利用胆固醇为唯一碳源筛选能转化胆固醇的菌株SE-1,对菌株进行形态、生理生化特征试验及16S rRNA基因序列同源性分析确定该菌株的系统发育学地位。发酵转化产物经氯仿萃取,对转化产物进行硅胶板薄层层析法分析,用硅胶柱层析法、Sephadex LH20分离产物,通过1H-NMR、13C-NMR分析确定转化产物的化学结构。对菌株转化胆固醇的发酵培养基的碳源、氮源、底物添加方式及发酵条件进行优化。【结果】菌株SE-1为革兰氏阴性菌,生理生化特征与洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)相似,16S rRNA序列与洋葱伯克霍尔德氏菌(GenBank No.U96927)相似性为99%。硅胶薄层层析显示转化产物为两种产物。发酵转化时,在胆固醇-吐温乳化液的添加量为1 g/L,碳源糖蜜5%,氮源(NH4)2SO40.3%,接种量4%,发酵液pH7.5,36℃发酵的条件下,7β-羟基胆固醇的产率最高,达到34.4%。【结论】分离得到的菌株SE-1鉴定为Burkholderia cepacia。菌株SE-1转化胆固醇的主产物为7β-羟基胆固醇,次产物为7-酮基胆固醇,胆固醇7β-羟基化转化率在最适的转化条件下比优化前提高了20.8%。     

发酵生产S-腺苷-L-蛋氨酸培养条件的优化研究

考察了摇瓶发酵生产S-腺苷-L-蛋氨酸过程中碳源、氮源、无机盐和生长因子以及培养过程中补加L-蛋氨酸时间对S-腺苷-L-蛋氨酸的产量、含量及生物量的影响。并通过均匀实验设计对培养基配方进行优化,在30℃、180 r/m in的培养条件下,得到最后的培养基配方为:葡萄糖30g,酵母粉11g,(NH4)2SO412g,K2HPO4.3H2O 5g,KH2PO410g,MnSO4.H2O 0.09g,ZnSO4.7H2O 0.14g,MgC l20.5g,CaC l20.3g,CuSO40.005g,自来水定容至1L。摇瓶中优化后的S-腺苷-L-蛋氨酸产量可以达到0.9g/L,比优化前产量提高了30%。采用优化后的培养基和培养条件在5L发酵罐中间歇培养,24h后一次性补加24g/L葡萄糖和1.0g/L L-蛋氨酸,继续培养24h后产量可达2.66g/L,生物量23.4g/L。     

L-色氨酸基因工程菌发酵培养基配方优化研究

[目的]对L-色氨酸基因工程菌液态发酵的培养基进行优化。[方法]通过P-B试验,筛选出对基础发酵培养基的发酵液中L-色氨酸浓度影响显著的因素,进一步通过最陡爬坡试验、B-B试验对影响显著的因素进行优化。在此基础上,确定最佳的发酵培养基配方。[结果]酵母粉、Fe SO4·7H2O、KH2PO4对发酵液中L-色氨酸浓度的影响显著;最佳培养基配方为:Glucose 25.0 g/L,酵母粉4.5 g/L,(NH4)2SO49.0 g/L,Mg SO44.5 g/L,柠檬酸钠2.0 g/L,Fe SO4·7H2O 96.1 m g/L,KH2PO41.2 g/L。[结论]根据此配方进行验证实验,发酵液中L-色氨酸浓度可达2.25 g/L。     

蚯蚓粪中乳酸菌的分离及其在大肠杆菌O157:H7中的抗菌活性

本研究利用SL培养基从蚯蚓粪中分离到54株具有产酸性能的菌株,并以E. coli O157:H7 (EDL933株)作为指示菌株,采用点种法检测分离菌株的抑菌活性.结果表明其中6个菌株对指示菌具有拮抗作用,通过形态特征,结合16S rDNA序列分析,初步鉴定该6个菌株分别为食物魏斯特菌(Listeria welshimeri)、乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)、短乳杆菌(Lactobacillus brevis)和格氏乳球菌(Lactococcus garvieae).分离到的乳酸菌对E. coli O157:H7 (EDL933株)具有显著的抑制作用,发酵温度和初始pH值影响发酵液的抑菌作用,优化环境因子可以促进拮抗菌对E. coli O157:H7的抑制作用.本研究为进一步分离抗菌产物用于人畜共患病的预防和治疗提供了理论依据.