K14和CMV启动子驱动裸鼠体内HPV16 E6/E7基因表达的差异

人乳头瘤病毒（human papillomavirus,HPV）是一种无包膜的环状闭合双链DNA病毒,具有严格的嗜人组织的特性．为探讨不同启动子驱动HPV E6/E7癌蛋白在裸鼠体内不同组织的表达效率,构建了带有角蛋白(K14)启动子和带有巨细胞病毒（CMV）启动子的E6/E7腺病毒载体（pAd-K14-E6/E7和pAd-CMV-E6/E7）,pAd-K14-E6/E7和pAd-CMV-6/E7、以及作为对照的重组腺病毒空载体pAdtrack- K14和pAd-CMV同源重组后,分别在293细胞中包装,收集重组病毒Ad-K14-E6/E7 、Ad-CMV-E6/E7、Adtrack-K14和Ad-CMV,通过尾缘静脉注射到随机分组的裸鼠体内,并每d向裸鼠腹腔注射0.05 mg雌激素．采用RT-PCR和Western 免疫印迹检测不同实验组E6/E7 mRNA 和蛋白表达水平,免疫组化法检测P53和Bcl-2蛋白表达．结果显示,注射病毒Ad-K14-E6/E7（实验组1）裸鼠子宫体中E6/E7 mRNA、E6蛋白质、P53和Bcl-2蛋白高表达,而其它组织中低表达;注射病毒Ad-CMV-E6/E7（实验组2）裸鼠各组织E6/E7　mRNA、E6蛋白质、P53和Bcl-2蛋白均低表达．研究表明,在裸鼠体内角蛋白K14启动子可以调控E6/E7在子宫体中表达,CMV启动子未能诱导E6/E7在子宫体中表达．     

人乳头瘤病毒l6型E6-E7融合蛋白真核表达载体的构建与鉴定

目的构建人乳头瘤病毒l6型(HPV16)E6-E7融合蛋白真核表达载体,为研究其基因疫苗免疫活性奠定实验基础。方法 PCR扩增HPV16 E6-E7基因片段,将其连接到真核表达载体pcDNA3.1(+),构建真核表达载体pcDNA3.1(+)/HPV16 E6-E7,双酶切及测序鉴定。将质粒转染HeLa细胞,RT-PCR鉴定E6-E7基因在HeLa细胞中的表达。提取质粒免疫小鼠,利用免疫组化方法检测在其肌肉组织中的表达。结果成功构建了真核表达载体pcDNA3.1(+)/HPV16 E6-E7;在转染pcDNA3.1(+)/HPV16 E6-E7的细胞中检测到HPV16 E6-E7基因。在免疫该质粒的小鼠肌肉组织中可以检测到该质粒的蛋白表达。结论成功的构建的了真核表达载体pcDNA3.1(+)/HPV16 E6-E7,该载体能在HeLa细胞内以及小鼠骨骼肌细胞内有效表达。     

与CIK细胞结合的肿瘤特异性增殖腺病毒KGHV400的构建

为了构建能与CIK细胞(Cytokine induced killer cell,CIK)结合的肿瘤特异性增殖腺病毒,我们用化学合成的35型腺病毒(Ad35)纤毛基因替换5型腺病毒(Ad5)骨架质粒的纤毛基因,获得5/35嵌合型腺病毒骨架质粒,然后与携带肿瘤特异性启动子hTERT(端粒酶逆转录酶基因启动子)和HRE(缺氧反应元件启动子)的穿梭质粒在HEK293细胞中同源重组,获得能与CIK细胞结合的肿瘤特异性增殖腺病毒KGHV400。分离人外周血单个核细胞,诱导培养成CIK细胞,与KGHV400共培养获得荷载KGHV400的CIK细胞。建立乳腺癌裸鼠移植瘤模型,经尾静脉注射荷载KGHV400的CIK细胞,在注射后第1d、2d、3d、5d、7d、14d解剖实验鼠,用免疫组化技术检测腺病毒六邻体蛋白在移植瘤、心、肝、脾、肾组织的表达。结果显示,构建的重组腺病毒KGHV400能高效率感染CIK细胞;荷瘤鼠尾静脉注射荷载KGHV400的CIK细胞后第1d,肿瘤细胞中即有腺病毒六邻体蛋白表达,之后表达逐渐增多,第14d仍有表达;脾脏在第1~14d检测到少量淋巴细胞中存在腺病毒六邻体蛋白;心、肝、肾组织未检测到该蛋白。对照组(尾静脉注射KGHV400)在注射后第1d、2d、3d、5d,肝、脾、肾组织中检测到存在腺病毒六邻体蛋白,但第7d后为转阴性;肿瘤细胞和心肌细胞未检测到腺病毒六邻体蛋白。我们的研究结果表明,重组腺病毒KGHV400是一种有用的肿瘤基因治疗载体。     

AFP表达调控载体对肝癌模型的靶向治疗作用

目的观察甲胎蛋白(AFP)表达调控载体pAFP-P53-EGFP对AFP表达阳性肝癌模型靶向治疗作用。方法以人肝癌HepG2(AFP阳性)、人肝癌SMMC7721(AFP阴性)细胞于BALB/c-nu裸小鼠右腋皮下荷瘤,14d成瘤,免疫组化检测AFP。将构建好的pAFP-EGFP和pAFP-P53-EGFP重组质粒于肿瘤内注射,观察肿瘤体积变化,通过免疫组化观察p53在HepG2肿瘤中的特异性表达及对肿瘤细胞的杀伤作用。结果荷HepG2、SMMC7721细胞株裸鼠14d皮下肿瘤生长良好,且肿瘤体积均为500mm3左右,经HE染色证实造模成功。同时,AFP免疫组化结果显示接种HepG2细胞的肿瘤组织AFP表达阳性,SMMC7721细胞的肿瘤组织AFP表达为阴性。经pAFP-EGFP和pAFP-P53-EGFP重组质粒治疗后,p53的免疫组化分析结果显示接种HepG2细胞的裸鼠pAFP-P53-EGFP治疗组p53表达量显著高于其他各组,可见明显细胞凋亡现象,且肿瘤体积较对照组减小。结论含AFP基因调控序列的pAFP-P53-EGFP载体可专一性地作用于AFP阳性肝癌细胞,引起肝癌细胞周期阻滞和凋亡。     

构建皮肤组织中特异表达HPV16-E6基因的小鼠模型

目的:构建特异在皮肤表达乳头瘤病毒(HPV16)E6基因的真核表达载体,并鉴定其在转基因小鼠体内的表达。方法:通过PCR方法扩增皮肤特异启动子p INV及HPV16-E6,将以上片段通过酶切连接,插入去掉CMV启动子的pc DNA3.1(-)载体,获得dpc DNA3.1(-)-p INV-E6载体;并显微注射制备其转基因小鼠,利用RT-PCR、Western blot及免疫组化技术检测获得的阳性小鼠体内E6的表达水平。结果:dpc DNA3.1(-)-p INV-E6载体测序正确;经鉴定31只实验小鼠中,有2只小鼠携带外源基因,将其与野生型小鼠交配获得的F1代中又有2只阳性小鼠;且在获得阳性小鼠的皮肤组织中RT-PCR检测有E6的转录本,Western blot检测有E6蛋白表达,且免疫组化检测结果显示有E6在皮肤表达且引起皮肤微增生。结论:成功构建了p INV-E6转基因模型小鼠,HPV16-E6基因在小鼠皮肤中特异表达,为进一步研究HPV16-E6在癌症中的作用奠定了基础。     

猪瘟病毒T细胞表位E290多肽与猪细小病毒VP2蛋白在干酪乳杆菌中的共表达及免疫小鼠特异性抗体的测定

将分别编码猪瘟病毒T细胞表位E290多肽和猪细小病毒主要保护性抗原VP2蛋白的重组基因插入干酪乳杆菌分泌型表达载体pPG中,构建了重组表达载体pPG-VP2-E290,将其电转化干酪乳杆菌Lactobacillus casei 393,获得了猪瘟病毒T细胞表位E290多肽与猪细小病毒VP2蛋白的乳酸菌共表达系统,经2%乳糖在MRS培养基中的诱导表达,对诱导表达的菌体及培养上清液进行SDS-PAGE检测表明,有约70kDa蛋白得到了表达,表达蛋白的大小与理论值相符。Western blot分析结果表明所表达的蛋白具有与天然病毒蛋白一样的抗原特异性。以诱导表达上清液作为抗原进行的间接ELISA实验也表明,重组的目的蛋白获得了分泌表达。将该重组干酪乳杆菌经口服接种途径免疫BALB/c小鼠,收集粪便样品检测小鼠产生抗PPV的特异性sIgA抗体,采集血液样本检测血清中抗PPV及抗E290的特异性IgG。结果表明分泌型的重组菌pPG-VP2-E290/L.casei 393免疫小鼠能够产生明显的抗体水平,为重组猪瘟与猪细小病毒乳酸菌口服活菌疫苗的研制奠定了重要的物质基础。     

吴茱萸碱联合吉西他滨对舌鳞癌荷瘤裸鼠模型的抑制作用及其机制研究

研究中药吴茱萸碱联合西药吉西他滨对舌鳞癌裸鼠皮下移植瘤的抑制作用并探讨其作用机制。建立舌鳞癌荷瘤裸鼠模型,药物干预后观察裸鼠瘤体积、进食量、进水量及对外界刺激的应激反应变化,HE染色观察移植瘤及各脏器组织病理结构,透射电镜观察肿瘤组织超微结构,Western blot及免疫组化检测NF-κB及Bcl-2家族基因蛋白表达。结果显示,较模型对照组及单药组,联合组移植瘤体积显著减小,荷瘤裸鼠的生活质量提高,肿瘤细胞病理性核分裂像数目减少,凋亡率增加,Bax、Ik-βα蛋白表达明显增加,Bcl-2、Bcl-xl、P65表达水平明显减少。吴茱萸碱联合吉西他滨抗肿瘤作用机制可能与调控NF-κB及Bcl-2家族蛋白有关。     

人乳头瘤病毒58型E6E7融合蛋白的原核表达、纯化及鉴定

目的:构建pET-42a(+)-HPV58E6E7原核表达质粒,诱导表达人乳头瘤病毒(HPV)58型E6E7融合蛋白。方法:采用PCR方法扩增出HPV58 E6E7融合基因的全长序列,利用DNA重组技术将其定向插入原核表达载体pET-42a(+)中,构建pET-42a(+)-HPV58E6E7原核表达质粒,用限制性内切酶酶切和核酸序列检测对重组质粒进行鉴定;将其转入宿主菌大肠杆菌BL21进行诱导以表达HPV58E6E7融合蛋白,并用谷胱甘肽琼脂糖树脂纯化回收HPV58E6E7融合蛋白,用SDS-PAGE及Western印迹鉴定表达蛋白的相对分子质量及抗原性。结果:PCR、限制性内切酶酶切和核酸序列检测证实重组质粒中插入的目的基因大小、方向正确;HPV58E6E7融合蛋白得到高效原核表达及纯化,表达蛋白的分子大小正确,抗原性良好。结论:pET-42a(+)-HPV58E6E7原核表达质粒构建成功,HPV58E6E7融合蛋白得到高效表达及有效纯化,为检测HPV58型治疗性疫苗的免疫效果提供了抗原。     

HPV16+治疗性无佐剂蛋白疫苗—HPV16Z- Hsp65-E6/E7的构建、表达及纯化工艺研究

目的：研制针对我国宫颈癌高危相关的HPV16型的治疗性无佐剂蛋白疫苗。方法：应用PCR技术自我国山西宫颈癌高发现场分离到的毒株-HPV16z中获得E6/E7转化基因片段,自卡介苗菌株中克隆获得Hsp65基因片段,对E6/E7基因片段定点突变修饰,构建pET28a-Hsp65-E6/E7表达载体,在大肠杆菌BL21(DE3)中表达融合蛋白,并研究重组蛋白的纯化方案和工艺。结果：成功构建pET28a-Hsp65-E6/E7重组表达载体,E6/E7突变位点正确,融合蛋白在亲和层析柱上正确复性和初步纯化,经阴离子交换色谱纯化后蛋白纯度达到95%。结论：该研究为无佐剂治疗性重组蛋白疫苗Hsp65-E6/E7的进一步功能研究奠定了基础。     

HPv 病毒El 蛋白多克隆抗体制备及 在宫颈上皮病变检测的运用

目的：研制人乳头瘤病毒(HPV)E1蛋白抗体,并运用于组织病理学免疫组织化学检测。方法：通过基因重组、原核表达并纯化阳HPV E1蛋白片段;经免疫兔制备多克隆抗体,并经免疫印迹及基因转染鉴定特异性;免疫组织化学法检测13例宫颈病变中E1蛋白,经原位杂交验证。结果：将PCR扩增的E1蛋白保守功能域(第362～456aa)基因片断重组于原核表达载体pEK- 318的6×His标签下游,经诱导表达和亲合层析,纯化出14kD His-E1蛋白。制备的多克隆血清经免疫印迹法检测显示不仅可与His—El蛋白结合,也与HeLa细胞内源性及基因转染表达的天然E1蛋白反应。运用免疫血清检测7例宫颈尖锐湿疣和6例宫颈上皮内瘤病(CIN)Ⅲ级病例显示：7例宫颈尖锐湿疣6例为阳性染色,阳性反应主要分布于病灶中挖空细胞的胞核。同时6例CINⅢ级病变全部阳性,着色主要为非典型增生鳞状上皮细胞核。为了确定上述病例中E1蛋白免疫组化检测的准确性,运用原位杂交法进行了验证。结果显示：7例宫颈尖锐湿疣均为HPV/11型杂交阳性,6例CINⅢ级病变全部为HPV16型杂交阳性,显色部位与免疫组化基本一致。结论：本研究结果显示研制的HPV E1蛋白抗体可以用于病理组织学HPV病毒检测。     

前列腺素E分子网络对哺乳动物生殖的调控

磷脂酶A2、环氧合酶以及前列腺素E合成酶是前列腺素E合成途径中顺序起作用的重要酶类,其中前列腺素E合成酶有两种不同的亚型,分别介导不同的前列腺素E合成反应。前列腺素E可与其受体特异性结合,并通过旁分泌和自分泌两种形式调节细胞反应,参与多种生理过程。近来研究发现,前列腺素E受体不仅存于质膜,而在核膜上也大量存在。前列腺素E核受体介导的信号转导途径与膜受体介导的信号途径不同,对于基因转录的调控机制也不同。本文综述并探讨了上述分子所组成的网络系统在哺乳动物生殖,尤其是雌性生殖过程中所发挥的重要作用。     

Complexity of vitamin E metabolism

Bioavailability of vitamin E is influenced by several factors, most are highlighted in this review. While gender, age and genetic constitution influence vitamin E bioavailability but cannot be modified, life-style and intake of vitamin E can be. Numerous factors must be taken into account however, i.e., when vitamin E is orally administrated, the food matrix may contain competing nutrients. The complex metabolic processes comprise intestinal absorption, vascular transport, hepatic sorting by intracellular binding proteins, such as the significant α-tocopherol-transfer protein, and hepatic metabolism. The coordinated changes involved in the hepatic metabolism of vitamin E provide an effective physiological pathway to protect tissues against the excessive accumulation of, in particular, non-α-tocopherol forms. Metabolism of vitamin E begins with one cycle of CYP4F2/CYP3A4-dependent ω-hydroxylation followed by five cycles of subsequent β-oxidation, and forms the water-soluble end-product carboxyethylhydroxychroman. All known hepatic metabolites can be conjugated and are excreted, depending on the length of their sidechain, either via urine or feces. The physiological handling of vitamin E underlies kinetics which vary between the different vitamin E forms. Here, saturation of the side-chain and also substitution of the chromanol ring system are important. Most of the metabolic reactions and processes that are involved with vitamin E are also shared by other fat soluble vitamins. Influencing interactions with other nutrients such as vitamin K or pharmaceuticals are also covered by this review. All these processes modulate the formation of vitamin E metabolites and their concentrations in tissues and body fluids. Differences in metabolism might be responsible for the discrepancies that have been observed in studies performed in vivo and in vitro using vitamin E as a supplement or nutrient. To evaluate individual vitamin E status, the analytical procedures used for detecting and quantifying vitamin E and its metabolites are crucial. The latest methods in analytics are presented.     

高危型HPV 复制相关蛋白在宫颈组织中的研究

人乳头瘤病毒(Human Papillomavirus,HPV)复制机制的研究,对复制与宫颈病变的相关性可提供重要的依据。HPV是有衣壳包裹的小型环状双链DNA病毒。其基因组可分早期及晚期蛋白编码区和一个调控区。高危型HPV通过E1、E2蛋白及Ori序列启动复制。高危型HPV在宫颈上皮细胞中的复制是分化依赖型的,在高危型HPV感染的成熟的宫颈表皮细胞中,HPV E7蛋白使细胞再次进入增殖分裂期,HPV-DNA得以复制,但同时E7蛋白亦会诱发宿主细胞染色体不稳定,增加癌变风险。由此推理,高危型HPV的复制与宫颈癌的发病有一定相关性。目前有学者对高危型HPV的复制机制,复制与致癌的关系方面正开展相关研究。     

Two New Species and Rivision of two Specific names of Euonymus

In this paper,two new species of Euonymus are described from China. They are Euonymus jinfoshanensis Z. M. Gu and Euonymus xylocarpus C. Y.Cheng et Z. M. Gu. And the specific names of two species are revised.     

重叠PCR合成HPV16E6、E7基因并构建植物表达双元载体

HPV16型为主的多种HPV病毒可诱发机体发生宫颈癌等疾病,以重叠PCR法人工合成HPV16 E6、E7致癌基因的融合基因,以之为目的基因构建了无选择标记基因(Marker-Free)双元载体,期望转化番茄开发新型宫颈癌治疗性疫苗-转基因植物口服疫苗.通过生物信息学分析HPV16 E6、E7基因,设计并合成密码子优化的靶基因E6-E7融合基因;并在目的基因的上游引入分子佐荆LTB基因,与Kozak序列等表达元件相偶联,以提高目的基因在植物表达系统的表达水平、增强其诱导黏膜免疫的免疫原性.目前已构建pX6-LTB-E7和pX6-LTB-E7-E6两个番茄转化双元载体.采用番茄Marker-Free系统转化和表达HPV16 E6、E7目的基因可以在转化后代中剔除标记基因,从而消除由标记基因可能引起的转基因植物口服疫苗的安全性问题,为HPV转基因植物口服疫苗应用奠定基础.     

转录因子E2F1抑制CREG表达调控体外培养的人血管平滑肌细胞分化

为探讨转录因子E2F1在血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)表型转化中的作用及其对E1A激活基因阻遏子(cellular repressor of E1A-stimulated genes,CREG)表达调控的分子机制,应用生物信息学方法,定位人CREG(hCREG)基因启动子并确定转录因子E2F1在hCREG启动子区的结合位点,PCR方法克隆并构建hCREG基因启动子绿色荧光报告基因载体,以hCREG启动子区E2F1结合位点为模板,化学合成E2F1寡聚脱氧核苷酸(ODN)和错配E2F1ODN,利用转录因子"诱骗(Decoy)"策略,用E2F1ODN转染体外培养的VSMCs以阻断E2F1与hCREG基因启动子区的结合,蛋白质印迹(Western blot)分析检测阻断前后细胞内hCREG蛋白、报告基因绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)和平滑肌细胞分化标志蛋白SMα-actin表达变化.结果显示:分化表型HITASY细胞中E2F1表达下调伴出核转位,而增殖表型的HITASY细胞中E2F1蛋白表达明显增加且定位于核内.进一步应用FuGene6瞬时转染E2F1ODN和错配E2F1ODN于体外培养HITASY细胞中,蛋白质印迹分析发现,转染E2F1ODN后,HITASY细胞中hCREG、SMα-actin和GFP表达均较未阻断组及错配组细胞明显增加.上述研究结果证实,E2F1是hCREG基因转录的重要调控因子,能够直接结合于hCREG启动子区阻遏hCREG表达,参与hCREG蛋白对VSMCs表型转化的调控作用.     

New Taxa of Epimedium L. from China

Three new species and a new variety, Epimedium coactum, E. coactum var. longtouhum, E. trunctum, E. glandulosopilosum are described in this paper. The morphological characters of trichomes, cuticle of leaf surface and pollen grains of the new species and theirallies were studied under LM and SEM, and shown in plates 1-3.     

Late Pleistocene and Holocene equid remains from Israel

Equid remains–mostly isolated teeth–from archaeological sites in Israel are described. Particular attention is paid to dental enamel fold morphology and criteria are established tor separating several Old World Quaternary equid species. Eauus hydruntinus , which is here considered a zebra rather than an ass, was present until 12,000 bp in northern Israel, while at the same time E-asinus/hemionus inhabited the arid regions in the south. Inirequent remains of E. caballus are also described. By 4000 years ago ass, probably the domestic form, was present in northern Israel.     

Biological functions and metabolic fate of vitamin E revisited

Information accumulated lately has confirmed the essentiality of vitamin E for humans and provided a better understanding of its biological function and metabolic fate. The discovery of -tocopherol transfer protein, which preferentially binds to RRR--tocopherol, not only provides conclusive evidence of the essentiality of vitamin E for humans, but also sheds light on the superiority of RRR--tocopherol biologically over other isomers. The presence of tocopherol regeneration systems and multiple interdependent antioxidant systems is largely responsible for the lack of a widespread deficiency in humans and the difficulty to deplete vitamin E in the adult. The bulk of excess tocopherols consumed is excreted to feces unchanged or to urine with the side chain shortened but the chroman ring intact. The ability of dietary vitamin E to mediate mitochondrial superoxide generation affords a possible mode of action of vitamin E at the tissue levels. By decreasing the generation and/or the levels of reactive oxygen/nitrogen species, dietary vitamin E not only protects against oxidative damage, but also modulates the expression and/or activation of redox-sensitive biological response modifiers that regulate important cellular events.