漆酶Lac1338的酶学特性测定及定向突变对其酶解染料影响

为了获得表达量高、热稳定性好的漆酶,通过密码子优化合成漆酶基因lac1338、连接到pET-32a(+)载体上并在Escherichia coli BL21(DE3)中表达,获得HIS-Lac1338蛋白。酶学性质测定结果显示,以ABTS为底物时,HIS-Lac1338的比活力高达22.8 U/mg,Km和Vmax分别为567μmol/L和2.8 mmol/(L·min·g);HIS-Lac1338的最适反应温度为55℃,最适pH为6.0;在55℃以下保温2 h能保留50%的酶活性,在pH 4-8范围内孵育4 h仍保留50%以上的活性;HIS-Lac1338对Cu~(2+)抗性强,Ca~(2+)、Na~+、K~+对HIS-Lac1338有促进作用,而Co~(2+)、Fe~(2+)、Hg~(2+)、Ag~+等重金属离子对HIS-Lac1338有抑制作用。易错PCR方法得到的Lac1338的突变酶Lac16与HIS-Lac1338相比,对酸性紫7、溴酚蓝、考马斯亮蓝的降解率分别由10.9%、20%和25%提高到90.5%、67.8%和85%。结果表明,HIS-Lac1338具有较好的温度及pH稳定性,而通过易错PCR技术定向突变获得的突变酶Lac16的染料降解率大大提高。     

宏基因组来源耐Mn2+、热稳定细菌漆酶的分子克隆及酶学特性

【背景】漆酶和锰过氧化物酶(Manganese peroxidase,Mnp)是木质素降解的主要酶,二者有协同效应。Mnp活性依赖于Mn~(2+),而Mn~(2+)是大多数漆酶的抑制剂。【目的】获得耐Mn~(2+)的细菌漆酶用于木质素降解。【方法】构建许昌市某污水河污泥宏基因组文库,通过活性筛选获得细菌漆酶基因lac1542。使用大肠杆菌异源表达Lac1542,研究纯化后的重组蛋白酶学性质并进一步检测了含Lac1542复合酶系降解木质素能力。【结果】测序结果显示lac1542编码一个含513个氨基酸的蛋白。以ABTS为底物Lac1542最适反应pH为4.0,在pH 3.0-6.5范围内酶活性稳定。最适反应温度是75°C,在70°C以下酶活性稳定;100 mmol/L的Mn~(2+)仍能提高酶的活性。动力学参数研究发现,该酶的最适底物顺序为:ABTS丁香醛联氮儿茶酚2,6-DMP愈创木酚。Lac1542/Mnp复合酶系对木质素降解率为47.8%,比单独使用Mnp木质素降解率(22.4%)提高25.4%。Lac1542/Mnp/灰盖鬼伞过氧化物酶(Coprinus cinereus Peroxidase,CIP)复合酶系木质素降解高达71.5%,比Mnp/CIP酶系木质素降解率(48.9%)提高22.6%,加入Lac1542后的复合酶系能明显提高木质素的降解率。【结论】Lac1542的可溶性表达、耐受高浓度Mn~(2+)、热稳定性使得Lac1542可以替代一些经典的真菌漆酶应用于制浆、造纸、纤维素乙醇生产、染料脱色等工业。     

白腐真菌SYBC-L2漆酶的分离纯化及其在毛纺染料脱色中的应用

经过硫酸铵分级盐析、DEAE-cellulose离子交换层析、SephacrylTMS-200柱层析,从白腐菌株Phellinus sp. SYBC-L2所产的漆酶中纯化得到电泳纯漆酶Lac3,其纯化倍数为28.27,回收率为14.76%.Lac3为一种糖蛋白,糖含量29.66%,SDS-PAGE表观分子量约为64.3 kD;其催化氧化DMP(2,6-Dimethoxyphenol)的表观Km值和Vmax分别为1.01 mmol/L和186.2 U/mg蛋白.Lac3的最适温度为60℃,最适pH为3.5;在30℃～50℃和pH 4.5～9.0范围内稳定.Cu2+、SO42-、CO32-对Lac3具有一定促进作用,而Fe3+、Fe2+、NO3-则具有抑制作用.色素的最佳脱色条件为(Lac3终浓度为2 U/ml):媒介元PV在温度50 ℃、pH值3.0的条件下反应2 h,脱色率可达95.10%;弱酸蓝在温度40 ℃、pH值4.0的条件下作用3 h,脱色率为75.09%.     

丝孢菌Monodictys asperospera (Cooke & Massee) Ellis漆酶的分离纯化及其酶学性质

本研究首次发现Monodictyx asperospera(Cooke&Massee)Ellis具有较好的产漆酶能力.粗酶液经硫酸铵盐析、DEAE-纤维素层析及丙烯葡聚糖凝胶S-300层析纯化,纯化倍数为8.1,回收率为5.7%.漆酶分子量约为77kD,最适反应温度为55℃,最适反应pH6.0,以丁香醛连氮为底物时Km为0.163mm0l/L,Vmax为0.194 mmol(L·min),含糖量为18.14%,Cu2+对漆酶有明显抑制作用.     

短小芽孢杆菌LC01漆酶基因在毕赤酵母中的胞外表达及重组漆酶酶学性质研究

为了获得表达量高、稳定性好及染料脱色效率高的细菌漆酶,通过PCR扩增出短小芽孢杆菌LC01的漆酶基因并构建重组表达载体pPICZαA-lac,转化毕赤酵母菌株SMD1168H后利用甲醇诱导培养重组菌获得重组漆酶,纯化并分析了重组漆酶的性质。重组菌株产漆酶活性在第7天达到最高,为1 390 U/L。纯化的重组漆酶分子量为65 kD,以丁香醛连氮为底物的最适反应温度和pH分别为70℃和6.8。在pH 9.0放置10 d活性没有下降,在70℃保温10 h后仍保留36%的酶活。Al~(3+)、Fe~(3+)和Mn~(2+)完全抑制漆酶活性。在介体乙酰丁香酮参与下该漆酶能够有效脱色RB亮蓝、活性黑5和靛红,在pH 9.0时6 h的脱色率达到了90%以上,表明该重组漆酶能有效应用于染料废水的脱色处理。     

一株低温木质素降解菌的筛选、产酶优化及酶学性质

【背景】我国北方地区秋冬两季平均气温较低,低温环境使得秸秆更难自然降解。【目的】筛选高效低温木质素降解菌,探索其酶学特性并提高其产酶性能和秸秆降解效率。【方法】通过苯胺蓝法和酶活测定对菌株进行筛选,以Lip、Lac、Mnp酶活力为评价指标,采用单因素和响应面法进行产酶条件优化及酶学性质研究,通过固态发酵试验研究其对秸秆的降解效率。【结果】筛选到一株高效菌LS-1,经形态学和分子生物学鉴定其为嗜麦芽窄食单胞菌。菌株LS-1在木质素为碳源、蛋白胨为氮源、pH 8.0、培养温度15°C、培养时间3 d时产酶效果最佳,其中Lip酶活力为23.34 U/mL、Lac酶活力为9.37 U/mL、Mnp酶活力为50.89 U/mL。Lip和Lac最适作用温度为30°C且热稳定性良好,Mnp最适作用温度为50°C但热稳定性较差。Lac最适作用pH 4.0且耐酸性较好,Lip和Mnp最适作用pH 5.0;0.75 mmol/L Mg~(2+)和0.5%吐温-20对Lip有促进作用,1 mmol/L Cu~(2+)和丁香酸对Lac有促进作用,0.1%-0.5%吐温-20均对Mnp有促进作用。15°C固态发酵后,秸秆失重率达18.85%,木质素降解率达36.14%,比对照组提高约6倍以上。【结论】本研究为低温木质素高效降解提供了优质菌种资源,在秸秆降解方面具有良好的应用前景。     

几丁质酶基因的克隆表达及酶学性质

【背景】几丁质是自然界中储藏量仅次于纤维素的有机物,几丁质酶能降解几丁质生成几丁寡糖,实现废弃物的高值化利用,目前菌株产几丁质酶能力低限制了它的生产应用。【目的】克隆弧菌(Vibrio sp.)GR52的几丁质酶基因,实现其在大肠杆菌中的异源表达,对分离纯化的重组几丁质酶进行酶学性质研究。【方法】以弧菌GR52菌株基因组DNA为模板,克隆得到几丁质酶基因GR52-1,构建重组基因工程菌BL21(DE3)/p ET22b-chi GR52-1,诱导表达的产物通过Ni-NTA树脂纯化后进行酶学性质研究。【结果】重组酶的最适反应pH为6.0,在pH5.0-10.0范围内37°C保温1 h仍能保持85%以上的相对酶活力,具有较好的pH稳定性;最适反应温度为50°C,在45°C保温1 h其酶活力基本没有损失,在50°C保温1 h其残余酶活力仍达60%;在1 mmol/L浓度下,Cu~(2+)、Ca2+对该酶具有促进作用,Hg+对该酶具有明显的抑制作用;在5 mmol/L浓度下,Ni+对该酶具有一定的促进作用,Mn~(2+)、Co~(2+)、Li~+、Fe~(2+)、Hg~+、SDS(十二烷基硫酸钠)对该酶具有明显的抑制作用。以胶体几丁质为底物时,动力学参数Km、Vmax、kcat分别为0.85 mg/m L、0.19μmol/(m L·min)和7.02 s-1。底物特异性分析表明该重组酶能特异性降解几丁质。【结论】重组几丁质酶具有良好的酶学性质,为几丁质酶的开发应用奠定基础。     

粗毛栓菌诱变菌株SAH-12漆酶的分离纯化及酶学性质研究

粗毛栓菌Trametes gallica诱变菌株SAH-12是通过紫外诱变选育所得的漆酶高产菌株,Active-PAGE分析表明SAH-12在高氮低碳无机盐培养液(LM3)中至少分泌3种漆酶同工酶(Lac1、Lac2、Lac3)。采用硫酸铵盐析、透析和Sephadex-G75分子筛层析从其培养液中分离纯化得到电泳纯的Lac1,纯化倍数6.54,酶活性回收59.7%。Lac1经SDS-PAGE验证为一条带,其表观分子量为61.5kDa。Lac1为一种糖蛋白,含糖量11.6%,等电点pI4.40,催化氧化底物ABTS的最适反应温度为60℃,最适pH为2.6,Km值为25μmol/L。Lac1在40℃(pH4.0)以下和pH1.5～5.0(28℃)范围内稳定。金属离子Fe2+、Ag+、Hg2+和Cr3+与抑制剂DTT、SDS、EDTA和DMSO对Lac1有抑制作用,其中Fe2+和DTT完全抑制酶活,而Cu2+对酶有明显激活作用,Mn2+、Zn2+对酶活影响不大。Lac1不仅可使一些合成染料明显脱色,而且对苹果汁多酚祛除也有较好效果。40℃用该酶(1U/mL)处理苹果汁5h,其多酚含量可降低40%。     

海洋来源琼胶酶的分离纯化及酶学性质研究

采用Vibiro sp.ZC-1发酵制备琼胶酶,粗酶液经过中空纤维柱浓缩、硫酸铵沉淀、DEAE-阴离子交换层析,得到一个电泳纯的琼胶酶组分Aga ZC-1,其分子质量约为45k Da,比活力为114.613U/mg。对Aga ZC-1进行酶学性质分析,结果表明,其最适反应p H为7.0,在p H为5.0~9.0时保温1h仍能保持80%以上的酶活力;最适反应温度为50℃,在45℃条件下保温1h酶活力保持在60%以上。在高浓度(5mmol/L)下,Fe~(3+)、Cu~(2+)、Sn~(2+)和Zn~(2+)能完全抑制琼胶酶的活性,在低浓度(1mmol/L)下,Cu~(2+)、Ba~(2+)、Na~+、Zn~(2+)、Ag~+、Sr~(3+)、K+对琼胶酶活性具有明显抑制作用。琼胶酶的动力学参数K_m和V_(max)分别为0.538mg/ml和6.33μmol/(L·min),对琼胶底物具有高度专一性,降解产物主要为新琼四糖和新琼六糖。     

黏细菌漆酶序列筛选及其重组酶酶学性质

漆酶是一种应用广泛的绿色环保的多酚氧化酶。漆酶过去被认为广泛存在于植物、昆虫和真菌中,而近年来,越来越多的细菌中也发现了漆酶的存在。黏细菌是一类重要的资源菌,但与一般细菌相比,较难分离和纯化。文中利用生物信息学的方法,综合应用Blast和隐马尔可夫模型方法对黏细菌蛋白质组数据库进行搜索,并根据多铜氧化酶的保守铜离子结合位点进行进一步筛选,获得30个候选黏细菌漆酶序列。挑选其中9个,在大肠杆菌中进行重组表达。利用2,6-甲氧基苯酚(DMP)等常用漆酶底物检测重组酶的催化氧化活性,其中7个重组蛋白具有漆酶催化活性。选择1个对2,6-甲氧基苯酚(DMP)具有较高氧化活性的重组酶(命名为rSC-2),通过Ni-NTA亲和层析柱纯化rSC-2,测试其酶学性质。纯化的rSC-2蛋白分子量约57 kDa,在最适反应条件下,rSC-2催化DMP反应的比酶活为0.27 U/mg。催化DMP反应的最适温度为60℃,最适pH为7.0。rSC-2在pH 7.0-8.0有较高酶活,在60℃孵育1 h保留50%以上剩余酶活。低浓度的Ca~(2+)对酶活有一定的促进作用,而较高浓度的Fe~(3+)、Co~(2+)、Ba~(2+)对酶活的抑制作用较明显。这是首次对黏细菌漆酶序列进行系统性的生物信息学分析,并实现纤维堆囊菌Sorangium cellulosum序列来源的漆酶活性蛋白在大肠杆菌细胞中重组表达。     

一种pH稳定的黄色漆酶的快速纯化和性质特征

通过丙酮沉淀和 DEAE- cellulose DE52 柱层析, 快速、有效地从一株白腐菌 Trametes sp. SQ01 的发酵液中纯化了漆酶。纯化的漆酶并非传统漆酶那样呈现蓝色, 而是一种黄色蛋白。以 ABTS 为底物时, 该酶的最适 pH 和温度分别是 pH 4.5 和 70°C, Km 为 0.029 mmol/L。T. SQ01 漆酶在 pH 3.0~11.0时, 酶活相对稳定, 在 pH 5.0 时最为稳定, 是目前报道的 pH 稳定性最好的漆酶。低浓度的金属离子(1 mmol/L) Cu2+、Mg2+ 、Ca2+ 和Co2+ 对漆酶有促进作用, 而高浓度(5 mmol/L)的Co2+、Zn2+、 Mn2+、Mg2+ 却抑制漆酶酶活。SDS 对该酶有激活作用, 当其浓度为1 mmol/L时, 漆酶相对酶活达到128%。DTT对漆酶强烈抑制, 即使是浓度为1 mmol/L, 亦可完全抑制漆酶酶活。纯化后的漆酶对亮蓝(RBBR) (100 mg/L)的脱色能力显著, 0.5 U/mL 的漆酶在 10 min内即可达到 80%的脱色率。T. sp. SQ01 漆酶的快速纯化以及高效脱色的能力表明该酶在染料脱色降解方面有着广阔的应用前景。     

黑木耳漆酶纯化及部分漆酶特性的研究

黑木耳漆酶研究可为漆酶的进一步分离纯化、基因克隆表达和大规模生产应用奠定基础。对黑木耳"黑29"菌株漆酶粗酶液进行硫酸铵分级沉淀后,通过Native SDS-PAGE电泳检测,存在3种漆酶LacA、LacB、LacC,分子量分别为60,34,19 kD。经硫酸铵分级沉淀和DEAE-Sephacel柱层析技术分离得一纯化成分LacC,纯化倍数7.60,酶活性回收4.28%。对LacC的pH、温度、金属离子和Km值等部分酶学性质进行研究发现,该酶氧化ABTS的Km值为1.18×10-6mol/L,催化氧化底物ABTS的最适pH为3.8,在pH 3.0~4.6表现出较强的稳定性;最适反应温度为55℃,低于50℃时有较好的热稳定性;金属离子Ag+对漆酶有激活作用,而Fe3+、Mn2+、Co2+则有抑制作用。     

白灵侧耳漆酶分离纯化及其酶学性质研究

为了探索白灵侧耳Pleurotus eryngii var.tuoliensis漆酶性质,以白灵侧耳菌株00485为试验材料,从发酵液中分离纯化得到胞外漆酶并对其酶学性质进行测定。纯化流程依次为DEAE-Cellulose阴离子交换层析,CM-Cellulose阳离子交换层析,SP-Sepharose强阳离子交换层析以及Superdex 75凝胶过滤层析,获得胞外白灵侧耳漆酶(Pn Lac)。SDS-PAGE检测结果表明Pn Lac为65k Da的单一蛋白。Pn Lac经过胰蛋白酶水解得到3种肽段,经过NBCI-BLAST后发现它们与糙皮侧耳、环柄韧伞、刺芹侧耳等的漆酶具有同源性。底物为2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)时该种漆酶的最适反应温度和p H分别为50℃和3.0,Ca2+和Hg2+能够抑制它的活性,相反地Cu2+和Mn2+能够提高它的活性,米氏常数Km和Vmax分别是0.17mmol/L和1.76OD/min/U。     

甲壳素酶Chisb的定向进化及生物转化合成几丁寡糖

甲壳素酶具有广泛的工业应用前景,如可将虾壳、蟹壳和其他甲壳废物降解成以几丁寡糖为主的高附加值产品,但野生型甲壳素酶催化效率低,大大限制了几丁寡糖的生产。笔者在前期研究中表达了一个具有较高效催化效率的甲壳素酶Chisb,并对其酶学性质进行了初步研究。为进一步提高甲壳素酶Chisb的催化效率,以R13NprB-C-SP-H为亲本,采用易错PCR(Error-pronePCR)技术构建随机突变体文库,对甲壳素酶Chisb进行定向进化。经过96孔板初筛和摇瓶复筛,获得了两个催化效率进一步提高的突变体C43D和E336R。对突变体的酶学性质进行分析, C43D和E336R的最适催化温度为55℃, C43D的最适pH为5.0,E336R的最适pH为9.0;其催化效率相比对照分别提高了1.35倍和1.57倍;而E336R和C43D催化产几丁寡糖的含量分别为2.53 g/L和2.06 g/L,相比对照(0.89 g/L)分别提高了2.84倍和2.31倍;底物转化率分别为84.3%和68.7%,相比对照(29.7%)分别提高了54.6%和39%。研究表明,通过易错PCR引入随机突变的方法能够有效提高甲壳素酶Chisb的催化效率。上述研究获得的催化效率提高的正向突变体及其酶学性质分析对生物转化合成几丁寡糖具有重要研究意义和应用价值。     

蜗牛酶中一种β-葡萄糖苷酶的纯化及酶学性质的研究

通过DEAE-Sepharose离子交换层析和Sephadex G-100凝胶过滤层析的联用从中华白玉蜗牛消化酶中分离出1种具有人参皂苷Rb_1水解活性的β-葡萄糖苷酶.纯化后该酶在SDS-PAGE上呈单一蛋白质条带.反应最适pH为5.6,最适温度是80 ℃.pH稳定范围很广,在pH为4.0～11.0的溶液中和温度60 ℃以下保持长时间稳定状态,是一个耐碱和中等耐热的糖苷酶.Na~+、K~+、Li~+、Ca~(2+)、Mg~(2+)、EDTA、DTT和SDS不影响该酶活性,而Cu~(2+)、Ag~+和Fe~(3+)对该酶则具有明显的抑制作用.pNPG为底物的动力学参数Km和Vmax分别为0.182 mmol/L和0.189 μmol/(min·mg).     

毛木耳漆酶纯化及其部分漆酶特性的研究

对毛木耳AuriculariapolytrichaAP4的粗酶液进行PAGE电泳后发现含有三种漆酶同工酶,并且通过运用NativeSDS-PAGE获得三种漆酶的分子量大小分别约为:LacA(110kD);LacB(84kD);LacC(65kD)。对漆酶粗酶液通过硫酸铵分级沉淀和离子交换柱层析进行纯化,用SDS-PAGE证明获得纯化的单一漆酶LacB。LacB漆酶的反应的最适温度为30℃,最适pH为3.0。此酶氧化ABTS的Km值为6.64×10-mmol/L,金属离子对酶活的影响很大,其中5Ca2+,Mg2+,Zn2+,Na2+,Ag2+对漆酶LacB有明显的激活作用;Co2+,Hg2+,Fe3+,Fe2+,Ba2+等对酶活有明显的抑制作用。LacB和其它真菌漆酶一样具有底物专一性不强的特点,并且LacB对RB亮兰染料有很好的脱色作用。     

粗毛栓菌漆酶的诱导及其对中性染料和有机磷农药的降解

研究了不同初始培养pH和培养时间下,不同诱导剂对粗毛栓菌产漆酶诱导特性的影响及漆酶对中性染料、有机磷农药的降解.结果表明： RB-亮蓝、ABTS和邻联甲苯胺对粗毛栓菌产漆酶均有不同程度的诱导作用,其中ABTS的诱导作用最好,其诱导的最适初始pH为4.0,最佳时间为13 d;所产漆酶的适宜反应温度为38 ℃,酶在40 ℃保温20 min仍可保留786%的酶活力,稳定性较好;在ABTS介导下,漆酶降解6种中性染料的最佳温度分别为30 ℃(中性黑、中性枣红、中性桃红、甲基橙)和60 ℃(中性深黄、甲酚红),最适pH分别为6.0(中性黑)、2.0(中性枣红、中性桃红)和4.0(甲基橙、中性深黄、甲酚红),最佳降解时间分别为6 h(甲基橙、中性深黄和甲酚红)、12 h(中性桃红)和24 h(中性枣红).而漆酶降解乐果、毒死蜱、敌百虫、哒嗪硫磷4种有机磷农药的最佳温度均为25 ℃,最佳降解时间为9 h,最佳pH分别为10.0(乐果、毒死蜱、哒嗪硫磷)和8.0(敌百虫).     

一株木蹄层孔菌SO3高产漆酶发酵工艺及部分酶学特性研究

从采自新疆阿勒泰山的木蹄层孔菌(Fomes fomentarius)中筛选获得一株高产漆酶的SO3菌株,对其产酶发酵工艺进行优化,并对部分酶学特性进行了研究。结果表明:SO3菌株产漆酶的最佳碳、氮源分别为麦麸和酵母粉; Mn~(2+)、Ca~(2+)、Zn~(2+)和Mg~(2+)的添加对SO3产漆酶有一定的促进作用,而Cu~(2+)具有明显的抑制作用;没食子酸和单宁酸可使产酶高峰期提前2天;添加ABTS可使酶活由6 736 U/L提高至8 470 U/L;正交实验L_9(3~4)优化培养基最佳组分为:酵母粉0.5%、麦麸2.5%、葡萄糖0.5%,磷酸二氢铵0.5%,漆酶活性达到10 863 U/L。酶学特性结果表明:SO3菌漆酶最适反应温度为50℃,且在80℃仍具有漆酶活性,最适反应pH为3.0,在40℃,pH 4.0～5.0之间,酶活性最稳定;同时研究表明Mn~(2+)和Zn~(2+)对酶稳定性有一定的促进作用,Co~(2+)、Cd~(2+)、Cr~(2+)和Pb~(2+)对酶的稳定性具有明显的破坏作用;对菌体及发酵液进行了双向电泳检测,测定其等电点为4.1,获得了1个纯化酶蛋白质谱序列。结果表明,该蛋白为LaccaseE(Trametes sp.420)。SO3菌株具有潜在的应用价值。     

用pGAP启动子在P.pastoris中组成型表达漆酶

目的:用pGAP启动子在P.pastoris中组成型表达漆酶.方法:用PCR从枯草芽孢杆菌基因组中扩增漆酶基因lac2.用Not和EcoRⅠ双酶切将lac2基因重组于表达载体PGAP9K.通过电转法将其转化于P.pastoris基因组,筛选高G418抗性以及高表达Lac2酶的重组子作为工程菌Gs115( pGAP9k - lac2).用甘油作为碳源在50L生物反应器中表达重组漆酶Lac2.用ABTS法测定发酵液中的漆酶活力.结果:在发酵30h时,其Lac2酶的表达达峰值,其活性为136.67U/L.其峰值的Lac2酶的表达量为50mg/L.表达产物具有分解ABTs的活性.结论:成功克隆了漆酶基因lac2,并首次实现用pGAP启动子在P.pastorris中组成型表达漆酶,为用P.Pastoris规模化生产漆酶奠定了基础.