应用大肠杆菌染色体DNA在非洲爪蟾卵提取物实现诱导非细胞体系核装配

近年来我们实验室已成功地利用细胞核体外组装的实验模式,将多种生物的DNA在非洲爪蟾卵提取物中实现了非细胞体系核装配。但亲缘关系最远的原核生物的染色体DNA是否也能在此真核体系中进行核装配一直没有报道。我们以大肠杆菌染色体DNA为材料,研究了它诱导的非细胞体系核装配。在光镜与电镜水平观察了核装配的过程。显微分光光度计扫描显示DNA片段在核装配过程中经历了凝集-去凝集的变化。证明大肠杆菌染色体DNA也能诱导爪蟾卵提取物装配成具有典型结构的核。α-~(32)P-dCTP的掺入实验表明重建核具有较高的DNA复制活性。     

四膜虫(Tetrahymena shanghaiensis)大核核仁与去膜大核能诱导非细胞体系核重建

外源DNA或染色质在非洲爪蟾卵提取物中可以诱导细胞核样结构的重建。重建核除不具有核仁样结构外,在其它形态结构上与真核细胞核十分相似。前人的工作表明在重建核中具有核仁前体结构。但可能是由于缺少活性核仁组织者的缘故,这些核仁前体不能相互融合形成新生核仁。那么活性核仁组织者在重建核中是否能发挥其功能呢?为了研究这一问题,我们提取纯化了四膜虫的大核与大核的周边核仁。进一步去除大核的核被膜,并将去除核被膜的大核与大核核仁分别加入非洲爪赡卵非细胞体系中。通过电镜超薄切片观察,我们发现无论是与大核染色质相连的周边核仁还是分离纯化的核仁结构在非洲爪赡卵非细胞体系中都不能保持其原有结构特征,而是发生了典型核重建变化,并且在诱导形成的重建核中也看不到核仁样结构。这些结果说明具有活性的核仁组织者在加入非洲爪蟾卵提取物后既不能继续保持其原有的RNA转录功能也不能诱导新的核仁的出现。     

应用HeLa细胞染色体（簇）和蛙卵提取物进行细胞核体外重建试验

将ＨｅＬａ细胞中期染色体（簇）、非液爪蟾卵提取物和ＡＴＰ再生体系混合温育,能够促使细胞核自发重建。在此非细胞体系中重建的细胞核处于一般细胞核大小范围,具有典型的双层核膜、核孔复合体、染色质、核纤层、核骨架等结构;核重建具有一个明显的过程;发现环形片层通过与核膜融合方式参与核膜和核孔复合体组装。     

应用HeLa细胞染色体(簇)和蛙卵提取物进行细胞核体外重建试验

将HeLa细胞中期染色体(簇)、非洲爪蟾卵提取物和ATP再生体系混合温育,能够促使细胞核自发重建。在此非细胞体系中重建的细胞核处于一般细胞核大小范围,具有典型的双层核膜,核孔复合体、染色质、核纤层、核骨架等结构,核重建具有一个明显的过程;发现环形片层通过与核膜融合方式参与核膜和核孔复合体组装。     

体外细胞核组装中核纤层与核膜的关系

采用非洲爪蟾卵提取物非细胞体系,以外源Lambda DNA诱导细胞核的体外组装,以此实验模式为基础,研究了细胞核体外组装过程中核纤层的组装,结果表明核纤层蛋白参与细胞核的体外组装过程,核内骨架的组装与核纤层的组装在时间上是有序的,核内骨架的组装可能为核纤层的装配提供了先决条件.在非洲爪蟾卵提取物非细胞体系中加入抗核纤层蛋白抗体,抑制核纤层的正常装配过程,核膜组装发生异常.结果提示核纤层的组装与核膜的组装是密切相关的.     

诸葛菜去膜精子在爪蟾卵提取物中实现非细胞体系核重建

动物爪蟾(Xenopus laevis)卵提取物诱导植物诸葛菜(Orychophragmus violaceus)去膜精子实现非细胞体系核重建. 诸葛菜去膜精子在爪蟾卵提取物中温育30 min左右开始膨大, 随着温育时间的延长, 膨大的精子染色质逐渐去凝集. 电子显微镜观察和荧光显微镜观察均表明重建核有核膜的装配, 膜泡在去凝集的染色质周围逐渐融合形成双层核膜. 用细胞分级抽提整装电子显微镜技术观察到重建核中有核纤层和核骨架结构的装配.     

用DNA酶切小分子片段在非洲爪蟾卵提取物中实现非细胞体系核装配

用质粒ｐＢＲ３２２的ＤＮＡ酶切片段,长度分别为７５０、３７５和１８６ｂｐ作为外源ＤＮＡ在非洲爪蟾 卵提取物中实现了非细胞体系的核装配（核重建）。将分离纯化得到的 ＰＢＲ３２２ ＤＮＡ酶切后经低熔 点琼脂糖回收ＤＮＡ片段,长度为７５０、３７５和１８６ｂｐ,分别加入到爪蟾卵提取物再生系统中温育, 经ＤＡＰＩ染色、孚尔根染色及电子显微镜观察发现能装配大量的重建核。显微分光光度法研究表 明,ＤＮＡ片段在诱导形成重建核的过程中发生了明显的凝集－会凝集变化。α－３２Ｐ－ｄＣＴＰ掺入重建核 的液闪计数结果表明,ＤＮＡ酶切小分子片段诱导形成的重建核具有较高的ＤＮＡ复制活性,而且复 制活性在一定范围内与加入的ＤＮＡ片段长度呈正相关。实验结果表明,非细胞体系中诱导的核重 建不仅与外源ＤＮＡ的种类无关,与外源ＤＮＡ的长度也没有关系。     

四膜虫（Tetrahymena shanghaiensis）大核核仁与去膜大核能诱导非…

外源ＤＮＡ或染色质在非洲爪蟾卵提取物中可以诱导细胞核样结构的重建。重建核除不具有核仁样结构外，在其它形态结构上与真核细胞核十分相似。前人的工作 重建中具有核仁前体结构。但可以是由于缺洗涤戌一核仁组织者的缘故，这些核仁前体不能相互融合形成新生核仁。那么活性核仁组织 重建核中是否能发挥其功能呢？为了研究这一问题，我们提取纯化了四膜虫的大核与大核的周边核仁。进一步去除大核与大核核仁分别加入非洲爪蟾卵非细     

非细胞体系核重建并非必需核小体与染色质的装配

以质粒DNA在爪蟾卵提取物S- 1 5 0中进行核小体构建时形成的超螺旋结构检测核小体的形成 ;利用阳离子交换剂CM -Cellulose定量结合组蛋白H2A和H2B ;并结合小球菌核酸酶分析核小体的形成 ,研究了爪蟾去膜精子在去除H2A ,H2B的S- 1 5 0中的核重建过程 .结果表明CM -Cellulose可有效去除组蛋白并阻止质粒DNA的核小体构建和精子染色质的改建 .但处理后的S- 1 5 0与膜泡组分仍可诱导去膜精子进行体外核重建 ,进一步表明非细胞体系核重建与外源DNA长度无关 ;核小体及染色质的组装对于核重建并非必需 .     

鸡卯提取物促进293T细胞升高表达多能基因OCT4和NANOG

作者找到一种卵细胞提取物有促进293T细胞表达多能基因的作用,这将在细胞生物学有广泛的应用前景。提取鸡卵清、卵黄和全卵提取物,用于293T细胞的渗透诱导。在诱导后不同时间提取细胞的RNA,检测多能基因OCT4和NANOG的变化。在诱导后10d提取细胞的DNA,检测0c尉和NANOG基因甲基化位点的变化。卵清、卵黄和全卵提取物具有促进293T细胞生长的作用,三种提取物渗透诱导后的293T细胞OCT4和NANOG基因表达有不同程度的升高。OCT4和NANOG基因发生去甲基化,基因开放表达。鸡卵提取物具有促进293T细胞表达OCT4和NANOG基因的作用,有望成为诱导细胞向多能细胞转化的制剂。     

鸡卵提取物促进293T细胞升高表达多能基因OCT4和NANOG

作者找到一种卵细胞提取物有促进293T细胞表达多能基因的作用,这将在细胞生物学有广泛的应用前景。提取鸡卵清、卵黄和全卵提取物,用于293T细胞的渗透诱导。在诱导后不同时间提取细胞的RNA,检测多能基因OCT4和NANOG的变化。在诱导后10 d提取细胞的DNA,检测OCT4和NANOG基因甲基化位点的变化。卵清、卵黄和全卵提取物具有促进293T细胞生长的作用,三种提取物渗透诱导后的293T细胞OCT4和NANOG基因表达有不同程度的升高。OCT4和NANOG基因发生去甲基化,基因开放表达。鸡卵提取物具有促进293T细胞表达OCT4和NANOG基因的作用,有望成为诱导细胞向多能细胞转化的制剂。     

应用大肠杆菌染色素DNA在非洲爪蟾卵提取物实现诱导非细胞体系…

近年来我们实验室已成功地利用细胞核体外组装的实验模式,将多种生物的ＤＮＡ在非洲爪蟾卵提取物中实现了非细胞体系核装配。但亲缘关系最远的原核生物的染色体ＤＮＡ是否也能在此真核体系中进行核装配一直没有报道。我们以大肠杆菌染色体ＤＮＡ为材料,研究了它诱导的非细胞体系核装置。在光镜与电镜水平观察了核装配的过程。显微分光光度计扫描显示ＤＮＡ片段在核装配过程中经历了凝集－去凝集的变化。证明大肠杆菌染色体ＤＮＡ也     

甲藻染色体在非细胞体系核重建过程中核小体的组装

利用纯化的原始真核生物寇氏隐甲藻（Crypthecodinium cohnii E.）染色体,使之与非洲爪蟾（Xenopus laevis L.）S期卵提取物温育,发现甲藻染色体经历了一系列去凝集、再凝集的形态变化,最后形成类似典型高等真核生物的间期核结构。小球菌核酸酶酶切分析表明,不具备组蛋白和核小体结构的甲藻染色体在非洲爪蟾卵提取物中进行了核小体装配,此过程与DNA序列本身、核膜以及核纤层蛋白（Lamin）是否存在无关,但部分拓扑异构酶Ⅱ（TopoⅡ）参与了这个过程,说明核小体的组装并非为核重建所必需,决定染色体高级结构的因素并不在DNA本身,而可能是非细胞体系中的组蛋白和非组蛋白。     

核重编程机制的影响因素

哺乳动物体细胞核移植技术在农业、生物技术、医药生产和濒危动物保护等方面具有很大的潜力和应用价值,已成为目前发育生物学研究的重要方法。但是核重编程仍是核移植技术的关键因素,制约了重构胚胎干细胞的研究。只有供核发生完全重编程,重构胚胎才能正常发育。核重编程与供核者的年龄,供核细胞的组织来源、分化状态、细胞周期、传代次数,供核细胞的表观遗传标记以及供卵者的年龄、卵子的成熟度等因素有关。创造各种适于核重编程的条件有利于从更高的起点开展核移植胚胎干细胞的研究,提高重枸胚胎干细胞建系效率。     

c-Abl在DNA损伤反应中的功能

非受体酪氨酸激酶c-Abl在正常生理及病理条件下具有多种生物学功能。当电离辐射、顺铂、丝裂霉素C等DNA损伤诱导剂诱导DNA损伤反应后,c-Abl可参与DNA损伤反应后的细胞周期调控、基因重组修复及细胞凋亡调控等,进而决定细胞在DNA损伤反应条件下的状态。简要介绍了c-Abl在DNA损伤反应中的作用及其进展。     

酪氨酸激酶c-Abl与信号转导

c-Abl是一种非受体型酪氨酸激酶,在细胞核和细胞质中都有分布,通过调控多种信号通路的信号转导参与多种细胞活动。细胞核中的c-Abl在DNA损伤应激中被激活并参与调控细胞凋亡,细胞质中的c-Abl参与调控细胞增殖、细胞周期、黏附迁移和细胞凋亡等细胞活动。我们简要综述了c-Abl参与调控的信号通路。     

用DNA酶切小分子片段在非洲爪蟾卵中提取物中实现非细胞体系核装配

用质粒ｐＢＲ３２２的ＤＮＡ酶切片段,长度分别为７５０,３７５和１８６ｂｐ作为外源ＤＮＡ在非洲爪蟾卵撮以物中实现了非细胞体系的核装配。将分离纯化得到的ｐＢＲ３２２ＤＮＡ酶切后经低熔点琼脂糖回收ＤＮＡ片段,长度为７５０,３７５和１８６ｂｐ,分别加入到爪蟾卵提取物再生系统中温育,经ＤＡＰＩ染色,孚尔根染色及电子显微镜观察发现能装配量的重建核。     

体细胞核移植诱导的表观遗传学变化

体细胞核移植技术是指将一个分化的体细胞核置入去核的卵母细胞中,并发育产生与供体细胞遗传背景一致的克隆后代的技术。目前,世界上通过体细胞核移植技术已经产生了许多的克隆动物。但克隆过程中还存在着很多问题,比如,克隆效率太低、克隆个体常伴有表型异常和早亡等,从而使该技术应有的应用潜力不能得到充分的发挥。体细胞表观遗传学重编程的不完全或紊乱是造成核移植诸多问题的主要原因。近十多年来,人们对体细胞核移植后的重编程进行了广泛的研究,其核心内容包括核及核外结构的重塑、DNA甲基化模式的重建、基因印迹和x染色体失活、组蛋白乙酰化模式的重建、端粒长度恢复等,以期能够对其重编程加以人为干预,从而提高动物克隆效率。本文拟对体细胞核移植诱导的重编程研究进展加以综述,希望对体细胞重编程机制的阐明有所启发。     

利用非洲爪蟾精子染色质和卵提取物在体外重建细胞核

应用非洲爪蟾去膜精子染色质和卵提取物成功地进行了细胞核本外重建。当精子染色质加入卵提取物后,首先发生染色质去浓缩作用,染色质整体结构膨胀;膜泡在膨胀的染色质外周聚集并逐渐彼此融合成双层膜;核孔复合体以某种未知方式组装入双层膜而形成核膜结构,并逐渐完全覆盖膨大的染色质,最终形成典型的间期核结构。     

值得注意的细胞周期调节蛋白

细胞周期调节蛋白在细胞周期的G_1期和S期交界处开始合成,S期结束后消失。细胞内定位在核内,又称分裂细胞核抗原。细胞周期调节蛋白含量与细胞分裂状况直接有关。细胞周期调节蛋白为细胞DNA复制所必须,是DNA聚合酶δ的活化蛋白。因此细胞周期调节蛋白对于真核生物DNA复制的调控及细胞分裂具有重要意义,值得重视。