登革病毒2型E蛋白基因真核表达和DNA免疫的研究

将编码登革病毒2型(DV2)氨基末端80%的E蛋白的DNA片段克隆到真核表达载体pCXN2 AG强启动子下游,构建成DV2E重组真核表达质粒pCXN-E.间接免疫荧光显示其可在COS-7细胞中表达.ELISA法检测pCXN2-E DNA免疫BALB/c鼠血清中的E抗体变化和维持规律,结果显示三次免疫后2周已有抗体产生,15周时仍维持较高的水平;血清空斑减数中和实验显示其中和滴度高于1640;流式细胞计数仪(FACS)检测DNA免疫鼠CD4+、CD8+T淋巴细胞变化情况,与注射空载体pCXN2的阴性鼠相比,CD4+淋巴细胞水平略有上升,CD8+细胞水平有较大升高(p＜0.01);动物保护性实验结果显示,当用致死剂量登革病毒攻击免疫鼠时,其保护率为60%.以上结果表明pCXN2-E在实验动物内表达出的DV2E蛋白可以诱导免疫动物的体液免疫和细胞免疫应答,尤其是MHC-Ⅰ限制性杀伤性CD8+T淋巴细胞水平的提高对清除病毒是十分有利的.因此,DV2 E DNA免疫为登革病毒DNA疫苗的发展进行了有益的探索.     

登革病毒2型E蛋白基因真核表达和DNA免疫的研究

将编码登革病毒2型(DV2)氨基末端80％的E蛋白的DNA片段克隆到真核表达载体pCXN2 AG强启动子下游,构建成DV2E重组真核表达质粒pCXN-E。间接免疫荧光显示其可在COS-7细胞中表达。ELISA法检测pCXN2-E DNA免疫BALB/c鼠血清中的E抗体变化和维持规律,结果显示三次免疫后2周已有抗体产生,15周时仍维持较高的水平;血清空斑减数中和实验显示其中和滴度高于1:640;流式细胞计数仪(FACS)检测DNA免疫鼠CD4~+、CD8~+T淋巴细胞变化情况,与注射空载体pCXN2的阴性鼠相比,CD4~+淋巴细胞水平略有上升。CD8~+细胞水平有较大升高(p<0.01);动物保护性实验结果显示,当用致死剂量登革病毒攻击免疫鼠时,其保护率为60％。以上结果表明:pCXN2-E在实验动物内表达出的DV2E蛋白可以诱导免疫动物的体液免疫和细胞免疫应答,尤其是MHC-I限制性杀伤性CD8~+T淋巴细胞水平的提高对清除病毒是十分有利的。因此,DV2 E DNA免疫为登革病毒DNA疫苗的发展进行了有益的探索。     

戊型肝炎病毒DNA免疫的研究

利用PCR方法获得1163bp的戊型肝炎（Hepatitis E Virus,HEV）开放读码框架（Open Reading Frame,ORF）ORF2之3'大片段和369bp ORF3的完整片段,分别克隆到真核表达载体pcDNA3中,构建两种含有HEV主要抗原表位的质粒DNA：pcE2和pcE3,分别或混合免疫Swiss小鼠三次（0时,第2周,第4周）,观察其在小鼠体内诱发的体液免疫应答。ELISA检测结果表明,pcE2和pcE3在小鼠体内均可诱导出一定水平的HEV IgG抗体,且在第三次免疫接种两周后,100％的小鼠抗体阳转。与两和中质粒单独免疫相比,两者同时注射的抗体水平较高。本研究为HEV DNA疫苗的研究打下一定基础。     

羊痘病毒P32基因真核表达载体的构建、表达及其免疫原性

通过PCR方法扩增全长P32基因和截去跨膜区的P32基因(MP32),将其分别克隆到真核表达载体pcDNA3.1( )和已插入CpG序列的pcDNA3.1-CpG中,构建pcDNA3.1-P32、pcDNA3.1-CpG-P32和pcDNA3.1-CpG-MP32质粒;用脂质体法转染BHK-21细胞,通过间接免疫荧光(IFA)试验验证其表达效果;经肌肉免疫注射健康BALB/c小鼠,用间接ELISA法检测抗体;在免疫后的第3、5周取免疫小鼠的脾细胞,用流式细胞仪检测CD4 和CD8 T细胞亚群.结果所构建的真核表达载体在BHK-21细胞中都能表达P32蛋白;免疫小鼠血清在免疫第2周后均能检测到羊痘特异性IgG抗体;免疫组小鼠脾脏CD4 T细胞数目和CD4 /CD8 T细胞比值明显高于对照组.结果提示,所构建的真核载体可诱导小鼠产生特异性体液免疫应答,并能刺激小鼠产生较强的细胞免疫应答.     

戊型肝炎病毒DNA免疫的研究

利用PCR方法获得1 163 bp的戊型肝炎（Hepatitis E Virus,HEV）开放读码框架(Open Reading Frame,ORF)ORF2之3’大片段和369bp ORF3的完整片段,分别克隆到真核表达载体pcDNA3中,构建两种含有HEV主要抗原表位的质粒DNApcE2和pcE3,分别或混合免疫Swiss小鼠三次（0时,第2周,第4周）,观察其在小鼠体内诱发的体液免疫应答。ELISA检测结果表明,pcE2和pcE3在小鼠体内均可诱导出一定水平的HEVIgG抗体,且在第三次免疫接种两周后,100%的小鼠抗体阳转。与两种质粒单独免疫相比,两者同时注射的抗体水平较高。本研究为HEVDNA疫苗的研究打下一定基础。     

幽门螺杆菌Lpp20-IL2核酸疫苗免疫活性

【目的】观察pcDNA3.1(+)/Lpp20-IL2免疫C57BL/6小鼠后所产生的体液免疫和细胞免疫应答水平,为研制高效、新型的幽门螺杆菌核酸疫苗提供实验依据。【方法】构建pcDNA3.1(+)/Lpp20-IL2重组载体,并转染HeLa细胞,用Western-blot观察鉴定其在真核细胞得到表达后免疫C57BL/6小鼠,ELISA间接法测定小鼠血清中抗Lpp20IgG抗体水平,ELISA双抗体夹心法检测脾淋巴细胞培养上清中IFN-γ、IL4水平,MTT比色法检测脾淋巴细胞增殖反应,免疫荧光组化法检测Lpp20蛋白在小鼠肌肉组织中的表达情况。【结果】成功构建了pcDNA3.1(+)/Lpp20-IL2真核表达载体,且重组质粒能在HeLa细胞内有效表达目的蛋白;小鼠接种pcDNA3.1(+)/Lpp20-IL2核酸疫苗后能产生特异性IgG抗体,8w后ELISA测定血清抗体A450值明显升高。核酸疫苗pcDNA3.1(+)/Lpp20-IL2免疫组小鼠脾淋巴细胞经特异性抗原刺激后,培养上清中IFN-γ、IL4含量明显升高。pcDNA3.1(+)/Lpp20-IL2和pcDNA3.1(+)/Lpp20核酸疫苗组小鼠脾淋巴细胞经特异性抗原刺激后,刺激指数明显高于空质粒组和PBS组。Lpp20蛋白在小鼠肌肉组织中能够有效表达。【结论】幽门螺杆菌Lpp20-IL2融合基因核酸疫苗和Lpp20单基因核酸疫苗均能刺激机体产生较强细胞免疫应答和体液免疫应答,且前者能诱导更强的细胞免疫应答。     

冠状病毒HCoV-229E S1蛋白片段的免疫原性分析

目的表达和纯化HCoV-229E的S1蛋白片段（S1 417-547）,分析其诱导的免疫应答。方法将纯化蛋白免疫小鼠,ELISA检测小鼠血清特异性抗体以及血清IL-4和IFN-γ含量,流式细胞术检测小鼠脾脏T淋巴细胞亚群分布,观察其诱导的免疫应答。结果表达蛋白经金属螯合获得纯化,并诱导小鼠产生了高滴度的抗体。脾脏CD4^＋和CD8^＋比例均升高,CD4^＋/CD8^＋比值下降;免疫鼠血清IFN-γ和IL-4水平显著升高。结论成功构建了HCoV-229E S1蛋白的表达载体,并在BL21（DE3）中得到了高效表达,表达蛋白免疫小鼠后诱导了明显的细胞和体液免疫应答。     

携带HCV核心蛋白原核表达质粒与真核表达质粒的减毒伤寒沙门菌诱导小鼠免疫应答之比较

丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白是丙肝疫苗的重要候选抗原,然而,该蛋白因具有免疫调控作用而影响免疫应答的诱导。构建了HCV核心蛋白的两种表达质粒,一种是体内激活型原核表达质粒pZW-C,另一种是真核表达质粒pCI-C。将该两种质粒转化减毒鼠伤寒沙门菌SL7207,得到重组菌SL7207/pZW-C和SL7207/pCI-C,分别将重组菌口服接种小鼠,检测小鼠的免疫应答,结果发现:①SL7207/pCI-C免疫鼠的CD3 CD4 T细胞持续降低,而SL7207/pZW-C免疫鼠的CD3 CD4 T细胞无明显改变;②SL7207/pCI-C免疫只诱导低水平抗HCV核心蛋白抗体,加强免疫对抗体阳转率及抗体水平无明显影响,而SL7207/pZW-C免疫组所有小鼠均产生较高水平的抗核心蛋白抗体。③SL7207/pCI-C免疫鼠脾细胞的体外增殖活性、细胞毒性T细胞活性以及加强免疫对细胞免疫应答的增强作用均明显不及SL7207/pZW-C免疫鼠。结果提示:携带真核表达质粒pCI-C的沙门菌因在小鼠细胞内表达天然形式(结构以及磷酸化修饰)的HCV核心蛋白,可能通过对T细胞的免疫抑制作用而弱化免疫应答。而以携带原核表达质粒pZW-C的沙门菌免疫可避免这一问题,并具有接种方便,成本低廉等优点,从而可望作为基于HCV核心蛋白为靶抗原的HCV疫苗的候选免疫方式。     

梅毒螺旋体外膜蛋白Gpd基因的克隆、表达及其免疫活性研究

利用PCR技术从Tp Nichols株基因组模板中扩增梅毒螺旋体(Treponema pallidum,Tp)外膜蛋白Gpd基因,定向克隆构建真核表达重组体pcDNA3.1( )-Gpd,免疫印迹和免疫组化技术检测pcDNA3.1( )-Gpd在HeLa细胞中的表达;同时将真核表达重组体pcDNA3.1( )-Gpd免疫新西兰兔,检测其在兔体内的免疫应答效果。免疫印迹和免疫组化鉴定均显示重组体在HeLa细胞中能有效表达一个41kD的Gpd融合蛋白。新西兰兔接种核酸疫苗后,能产生特异性抗体,第3次免疫后2周抗体最高滴度可达1∶1024,免疫后兔脾细胞受Gpd蛋白刺激有明显增殖反应。所诱导的抗体水平和脾淋巴细胞增殖情况均显著高于空质粒对照组和空白对照组(p<0.05)。Tp真核表达重组体pcDNA3.1( )-Gpd的成功构建及能刺激新西兰兔产生较强特异的免疫应答,为Gpd蛋白生物学功能及梅毒DNA疫苗的深入研究奠定了一定的实验基础。     

HCV E2蛋白诱导的体液免疫及CTL应答研究

应用PCR方法扩增出HCVE2基因编码417a.a～750a.a的DNA片段,克隆到原核表达载体pQE30 LacZ启动子下游,转化JM109菌株.在JM109菌株中诱导表达出N端含6个组氨酸的E2融合蛋白,用Ni-NTA-Superflow亲和层析柱纯化作为抗原免疫实验兔和BALB/c鼠.定期取免血,采用间接ELISA方法检测兔子体内针对E2的抗体水平和维持规律.结果显示,距初次免疫14d兔子体内已有抗体产生,直至免疫第55d抗体水平持续上升,之后抗体水平保持稳定,抗体滴度达到13200.六周后,取鼠脾脏制备淋巴细胞,定向刺激扩增后与经过重组真核表达质粒pCE2转染的P815细胞作用,利用LDH释放试验检测作用效果.在ET=2001的情况下,杀伤率超过30%.这些结果表明工程菌株表达的HCV E2蛋白具有良好的免疫原性,可以诱发免疫实验动物机体产生较高滴度的抗体及特异性CTL应答.由此我们认为E2蛋白是发展HCV预防工程蛋白疫苗的合适候选者.