SELEX技术与适体

SELEX技术是从随机寡核苷酸评议库中筛选与靶分子特异结合序列的组合化学技术。随机寡核苷酸的多种空间结构是筛选基础。该技术对靶分子无特殊要求,筛选出的寡核苷酸被称为适体,适体最突出的特征是与靶分子的特异性高亲和力。     

Cell-SELEX技术研究进展

适配子是通过SELEX技术,即指数富集配体系统进化技术,经反复放大筛选得到的、与目标分子有高度亲和性的分子。SELEX技术常使用纯化的靶分子,目前活细胞也可用于筛选目标,这种技术称为细胞指数富集配体系统进化技术(CellSELEX),其优点是产生的适配子可以与活细胞中的靶分子的天然构象发生作用。细胞表面的跨膜蛋白也可作为适配子的目标。此外,在不知道任何细胞表面分子的情况下也可以得到细胞特异性适配子。对Cell-SELEX技术的应用及研究进展进行综述。     

新型蛋白质配体-亲和体研究进展

亲和体(affibody)是一种衍生于葡萄球菌A蛋白B结构域的人工蛋白质分子．B结构域含58个氨基酸,形成3个α螺旋结构,分子质量约为6.5 ku．其中第一及第二螺旋中的13个特定位点的氨基酸对其结构无明显影响,这些位点可被随机突变形成理论上可与任何靶分子结合的亲和体文库．筛选该文库可获得能与某一靶分子特异结合的亲和体．亲和体与靶分子的结合特性与抗体相似,但与抗体相比具有一些独特的优势,如：通过体外筛选即可获得,以化学合成方法或原核表达即可大量制备,分子质量小、在生物体内组织穿透性强、血浆清除率高,理化稳定性好,可以通过交联或融合表达与标记分子(如荧光蛋白、生物素等)结合而不影响其与靶分子的结合能力．亲和体可作为抗体的替代品,用于蛋白质识别、分离及纯化、实验诊断、分子显像及靶向治疗．     

泛素介导的植物膜蛋白转运及其研究方法

泛素(Ub)是一类小分子多肽, 可通过赖氨酸残基与靶蛋白结合, 进而决定靶蛋白的去向。泛素分子对靶蛋白进行特异性修饰的过程称为泛素化。相较于动物和酵母细胞, 植物细胞中泛素介导的蛋白动态循环, 尤其是膜蛋白胞吞动态循环研究相对滞后。随着生物化学以及显微技术的发展, 人们对泛素介导的植物细胞膜蛋白转运有了新的认识。该文阐述了泛素及类泛素在蛋白转运中的作用, 总结了泛素化(ubiquitylation)调控膜蛋白转运的分子生物学机制和常用的研究方法, 并对今后该领域的研究进行了展望。     

甲基化寡聚核苷酸作为靶基因抑制剂的研究进展

反义RNA对靶基因的抑制作用近来越来越受到人们的重视,这是因为反义RNA能在分子水平上有效地抑制有害的靶基因表达,为发展新一代治疗药物提供了可靠的理论基础。当反义RNA和靶mRNA的起始编码区(initiation coding region)互补结合或和一个靶mRNA前体的拼接区(splicing junction)互补结合形成三螺旋结构(triple stranded complexes),则这个mRNA的翻译或mRNA前体的拼接加工将被抑制,最后阻断这些靶基因正常表达。故反义RNA既可作为遗传分析的强有力的工具又可促进发展新一代基因型治疗试剂。因此,     

三链DNA的形成抑制转录因子与乙肝病毒核衣壳启动子的结合

合成的寡核苷酸可缠绕于DNA双螺旋大沟内并以氢键与其相互作用形成三链DNA结构,这类寡核苷酸常简称为TFO(triplex-form-ing oligonucleotide)。通过TFO与靶基因结合形成局部的三链结构来抑制基因转录的技术被称为反基因策略(antigene strategy)。我们选择乙肝病毒(HBV)核衣壳启动子(Cp)内一近似同聚嘌呤·同聚嘧啶序列(1734～1754,ayw亚型,以EcoR Ⅰ切点为 1)为靶序列,以嘌呤     

miRNA在肿瘤分子诊断和治疗中的研究进展

微小RNA(miRNA)是一类真核生物内源性、长18~25个核苷酸的小分子单链RNA,能够通过与靶mRNA特异性的碱基互补配对引起靶mRNA的降解或者翻译抑制,miRNA调节的紊乱将对细胞产生重要的影响。在肿瘤中,抑癌性miRNA的缺失会增加其靶向致癌基因的表达,而致癌miRNA(被称为oncomirs)的升高能够降低其靶向肿瘤抑制基因的表达。这一认识使得应用靶向致癌性miRNA与恢复抑癌性miRNA的功能来治疗肿瘤成为可能。随着临床研究的不断深入,miRNA不断为肿瘤分子诊断和治疗提供新的思路和治疗手段。     

Wnt/β-catenin信号通路对靶基因转录的调控

Wnt/β-catenin信号通路又被称为经典Wnt信号通路,在早期胚胎发育、成体组织稳态维持、干细胞干性调控和肿瘤发生等过程中均发挥重要作用.经典Wnt信号通路的核心信号转导因子β-catenin与核内转录因子TCF/LEF家族成员结合后,通过募集或替换一系列协同作用因子,诱导染色质结构变化,调控Wnt信号靶基因的转录.本文将从Wnt信号靶基因转录调控的基本模式、分子机制、表观遗传学调控和意义等方面,总结近年来有关Wnt信号靶基因转录调控的研究成果,方便读者更好地理解Wnt信号通路靶基因的转录调控.     

基于纳米金复合探针的基因芯片膜转印检测法

建立了一种基于纳米金复合探针的基因芯片膜转印核酸检测新方法。首先,用纳米金颗粒同时标记检测探针P2和两种长短不同且生物素化的信号探针 (T10,T40),其中检测探针与靶DNA 5￠端互补,两种信号探针起信号放大作用。当靶DNA分子存在时,芯片表面捕捉探针P1 (与靶DNA分子3￠端互补) 通过碱基互补配对原则结合靶DNA分子,将其固定于芯片上,同时检测探针通过与靶DNA 5￠端互补配对将纳米金复合探针结合于芯片表面,结果在芯片表面形成“三明治”结构,后通过链霉亲和素-生物素反应,使芯片表面对应有靶DNA分子的部位结合上碱性磷酸酶,最后利用BCIP/NBT显色系统使芯片表面信号结果镜面转印至尼龙膜表面。当检测探针和信号探针摩尔比为1∶10,T10和T40摩尔比为9:1时可以检测1 pmol/L合成靶DNA分子或0.23 pmol/L结核分枝杆菌16S rDNA PCR扩增产物,检测结果通过普通的光学扫描仪读取或肉眼直接判读信号有无。本芯片检测系统灵敏度高,操作方法简单、快速,不需要特殊仪器设备,在生物分子的检测方面具有较高的应用价值。     

T细胞受体富集区域的微小囊泡在免疫突触的极性释放

<正>T细胞与抗原呈递细胞(APCs)之间的识别过程介导了适应性细胞免疫和抗体应答反应。当T细胞表面的T细胞受体(TCRs)识别APCs表面的主要组织相容性复合体分子(pMHC)上结合的肽段(抗原)时,T细胞信号立即被启动。TCRs与pMHC的识别,加上细胞间黏附受体的参与,共同形成了T细胞和APCs之间的特殊结构,称为免疫突触。免疫突触能介导效应分子和胞内信号在突触间隙进行有效的传递。     

非编码RNA作为ceRNA在人癌症中的功能及机制

非编码RNA(non-coding RNA, ncRNA),即无编码蛋白质潜力的RNA,包括短非编码RNA,例如微RNA(microRNA, miRNA),长非编码RNA(long coding RNA, lncRNA)和环状RNA(circular RNA, circRNA)等,已被证明可以在RNA水平上调节细胞中多种生理及病理过程。miRNA是约18～22个核苷酸大小的内源性非编码RNA分子,可以通过MRE与靶基因的3′非翻译区(untranslated region,UTR)中的互补序列结合,抑制蛋白质编码基因的表达,并导致mRNA转录物的更新、转换或降解。2011年,Salmena等提出,非编码RNA与具有编码蛋白质能力的RNA(mRNA)之间存在一种被称为竞争性内源RNA(competing endogenous RNA, ceRNA)的相互作用机制假说,即含有miRNA反应元件(MRE)的ncRNA通过与miRNA结合,解除miRNA对靶基因的抑制作用。这一假说对基因表达调控的传统认知进行了补充,在RNA水平上将多种ncRNA的作用补充到经典的miRNA调控mRNA翻译的过程,将其延伸为ceRNA-miRNA-mRNA的网络调控模式。近年来研究发现,ceRNA机制广泛存在于胃癌、结肠癌和膀胱癌等各类癌症中,并且在肿瘤的基因调控及肿瘤细胞的增殖、侵袭、转移、凋亡、细胞周期等生物过程中发挥作用。本文将介绍ceRNA及其网络的机制与分子基础,并且结合两类非编码RNA——lncRNA及circRNA作为ceRNA分别在人类不同癌症类型中的近期研究进展作一综述,讨论该机制在肿瘤中的角色及作用,以期拓宽对肿瘤发生发展机制的视野,为癌症治疗提供新思路。     

多聚酶链反应——方法和仪器

<正>多聚酶链反应(PCR)类似体内DNA复制过程,在待扩增的“靶”或“模板”DNA双链分子的的两端各接一个引物,经一次循环后,可得到两个相同的双链靶DNA分子。DNA分子数随循环次数呈几何级数增长,30次循环后,靶DNA被放大2~(30)倍,其拷贝数可达10~9以上,在100ul PCB反应混合物中约产生2～3μ DNA。扩增的靶DNA分子长达10～18kb,但4kb抗更短的靶DNA最适宜PCR扩增,PCR能测出10~6基因组中的一个DNA拷贝。     

病毒microRNA研究进展

microRNA(miRNA)是一类存在于多细胞生物中长约21-24nt的非编码RNA分子,它们与靶mRNA分子互补结合抑制蛋白翻译或导致mRNA降解,从而调控靶基因表达。miRNA已被证实在多种代谢途径中发挥重要作用,调节包括细胞分化和分裂、细胞凋亡及癌症发生在内的多个细胞过程。利用生物信息学以及分子克隆的方法在线虫、哺乳动物以及植物中已发现超过4000条miRNA。最近在病毒中也发现有miRNA基因存在,通过对病毒miRNA靶基因的预测,推测其在病毒复制过程中发挥重要的调控作用。目前病毒编码的miRNA分子的特点、转录机制、功能、进化保守性以及病毒与宿主miRNA的关系都已有一定的了解。对于病毒相关miRNA研究的深入,必将对认识病毒-宿主相互作用以及相关疾病的治疗带来新的启示。     

适体酶的筛选及应用

适体酶也称为别构效应核酶或别构效应脱氧核酶,是一种新的人工合成酶,它兼具适体的靶物质特异性结合与核酶或脱氧核酶的催化活性优点。这种酶是从大量随机序列库中针对各种效应分子筛选获得的目的酶。适体酶为效应分子的定量分析提供了新的思路。适体酶不仅在基因组学和蛋白质组学研究中得到应用,而且在生物传感器和DNA分子逻辑研究中也具有潜在的应用前景。     

从噬菌体文库中筛选与表皮生长因子结合的多肽(英)

与许多疾病相关的血管生成作用是由一些血管生成因子介导的,其中就包括表皮生长因子.在肿瘤生长、关节炎等疾病中,表皮生长因子参与了其中的血管生成作用,拮抗表皮生长因子介导的血管生成就有可能对与其相关的疾病起到治疗作用,因此,表皮生长因子的拮抗剂可能具有重要的临床价值.拮抗表皮生长因子的作用可以通过许多途径,其中之一就是找到能与表皮生长因子结合并能干预其与受体结合的分子,因而表皮生长因子可作为药物靶分子.从噬菌体文库中筛选药物靶分子的拮抗剂和激动剂已被证明是一种有效的方法.以表皮生长因子作为药物靶分子,从多肽噬菌体文库中筛选与表皮生长因子结合的噬菌体多肽,这些潜在的表皮生长因子拮抗剂先导分子经过优化可能具有重要的临床价值.     

从噬菌体文库中筛选与表皮生长因子结合的多肽

与许多疾病相关的血管生成作用是由一些血管生成因子介导的 ,其中就包括表皮生长因子 .在肿瘤生长、关节炎等疾病中 ,表皮生长因子参与了其中的血管生成作用 ,拮抗表皮生长因子介导的血管生成就有可能对与其相关的疾病起到治疗作用 ,因此 ,表皮生长因子的拮抗剂可能具有重要的临床价值 .拮抗表皮生长因子的作用可以通过许多途径 ,其中之一就是找到能与表皮生长因子结合并能干预其与受体结合的分子 ,因而表皮生长因子可作为药物靶分子 .从噬菌体文库中筛选药物靶分子的拮抗剂和激动剂已被证明是一种有效的方法 .以表皮生长因子作为药物靶分子 ,从多肽噬菌体文库中筛选与表皮生长因子结合的噬菌体多肽 ,这些潜在的表皮生长因子拮抗剂先导分子经过优化可能具有重要的临床价值 .     

MicroRNA基因及其靶位点的单核苷酸多态性与疾病易感性

微小RNAs(MicroRNAs)是一类内源性19～25个核苷酸大小的非编码RNA分子,能够通过碱基匹配原则识别并结合于靶基因3'非翻译区的靶位点,从而抑制靶基因的翻译和/或促进靶基因降解。近年许多研究表明,单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms,SNPs)可影响m icroRNA对靶基因的调控过程。SNPs可发生在m icroRNA基因(指在pri-,pre-and mature-miRNA序列中),也可发生在靶基因的3'非翻译区的靶位点。这些SNPs通过影响microRNA对靶基因的调控过程,参与许多疾病如肿瘤、神经系统疾病、肌肥大、心血管疾病以及2型糖尿病的发生发展过程。本文拟对MicroRNAs及其靶mRNA的结合位点SNPs与疾病的相关研究做一综述。     

剪切流动法研究表面固定化配基与目标分子的相互作用力

基于剪切流动腔技术,以微球作为受力载体,设计了一套可用于研究表面固定化配基与目标分子特异性相互作用力的实验和分析方法,并以人免疫球蛋白 G (human IgG) 和羊抗人免疫球蛋白 G (goat anti-human IgG) 分别作为模型配基和模型目标分子进行了研究 . 基于平面 Poiseuille 层流模型设计了流场参数,以数值计算结果验证了设计的合理性 . 使用牛血清白蛋白 (BSA) 作为非特异性对照,判断微球与基片表面的结合力来自配基和目标分子的生物特异性相互作用,并由进一步的目标分子灭活对比实验确认了这一结论 . 实验观察到微球与基片表面的结合力受到配基面密度的影响,说明发生结合的是多对而非单对蛋白质分子 . 将 95 ％的微球被剥离时对应的壁面剪切率设定为临界剪切率,由大量实验结果拟合得到了临界剪切率与配基面密度间的定量关系 . 在受力分析模型中,考虑到多分子的结合,以及分子键位置不同造成的力臂长度的差异,最终计算得到单对配基与目标分子的平均结合力约为 342pN.     

一种拮抗HIV-1并靶向DC的融合基因的设计及表达鉴定

艾滋病病毒 (Human immunodeficiency virus,HIV) 通过与靶细胞膜的融合感染宿主细胞,研究表明阻断HIV与受体靶分子的结合可以阻止HIV进入宿主细胞,抑制HIV病毒的感染。设计合成了一个包含CD4和CCR5与HIV-1结合的主要功能结构区,及Flt3-L和Mip-3α分子的融合基因,构建了2个融合基因的真核表达载体pABK-CKR5-CD4/Flt3L-Mip3α (pABK-HIV-MF) 和pABK-CKR5-CD4 (pABK-HIV-MT),在人胚肾293细胞中进行了表达。RT-PCR、细胞免疫荧光技术、ELISA和Western blotting检测结果表明融合基因在真核细胞中获得了正确的表达,这为进一步研究其对于HIV-1的拮抗并靶向树突状细胞 (DC) 清除研究奠定了基础。