葡萄卷叶病毒的纯化,血清学研究及其在脱毒组培苗检测中的应用

将具有典型葡萄卷叶病(Grapevine leafroll diseas,GLRD)症状的葡萄组织,经差速和硫酸铯—蔗糖密度梯度离心,提纯了GLRV,并制备了兔抗血清。电镜下可观察到长度从600～2000nm的线形病毒颗粒,其中以1400nm左右为主。免疫电镜结果表明线形病毒颗粒能被美国的NY-1分离株抗血清(Ⅲ型)所修饰。在间接ELISA中提纯制品与GLRV的Ⅲ、Ⅳ、Ⅱ型抗血清均能产生免疫反应。与Ⅲ型抗血清产生较强的免疫反应,Ⅳ型次之,Ⅱ型最弱。在SDS-免疫双扩散实验中病组织韧皮部粗提液与GLRV的Ⅲ,Ⅳ、Ⅱ型抗血清均产生免疫沉淀线。从而推测我国葡萄园内的葡萄卷叶病很可能由2种或3种卷叶病毒感染所致.采用A蛋白夹心酶联免疫吸附试验(PAS-ELISA)检测葡萄试管苗,Ⅲ型抗血清和自制抗血清的平行测试结果基本相符,共获得11个生食葡萄和10个山葡萄品种的脱葡萄卷叶病毒和扇叶病毒的组培苗,扩繁后田间试种表现出良好的农艺性状。     

我国水稻条纹叶枯病病原性质的研究

病样经提纯后,在电镜下获得3nm丝状和8nm分枝丝状结构,病毒样在蔗糖密度梯度离心后产生三条沉降带。经过电泳分析表明:病毒外壳蛋白为单一组分,分子量约为3.69×10~4dalton;病毒核酸有三种大小不同的组分,分子量为0.9,1.0,1.4×100dalton(混合样)。用提纯的抗原制备抗血清。提纯病毒抗原与所制备抗血清、与我国过去研究制备的抗血清及与日本制备的条纹叶枯病单克隆抗体都有血清学反应。     

香蕉束顶病毒的纯化及理化特性

从具有典型香蕉束顶病(BBTD)症状的香蕉病组织中提纯了香蕉束顶病毒(Banana bunchy top virus,BBTV)。电镜下可观察到直径为18nm的球形病毒颗粒。最高紫外吸收在255nm,最低紫外吸收在240nm,A_(260)/A_(280)为1.30。用标准BBTV抗体通过ECL-Western转印法测定其外壳蛋白分子量为21kDa。其核酸经DNaseI、RNaseA和Mung Bean Nuclease分析,表明是约1kb的ssDNA。结果与国外文献报道一致。     

马铃薯卷叶病毒的分离、提纯及抗血清制备

同马铃署品种“小叶子×多子白”和“米拉”分离了马铃薯卷叶病毒。用0．2M磷酸缓冲液榨汁,滤渣经液氮冷冻,捣碎,匀浆以代替加入酶制剂,在差速离心后,用Scpbadex G—200凝胶过尊和蔗塘密度梯宝离心,从蚜虫接种的马铃薯和洋酸浆的茎叶中提纯了PLRV。其紫外最大吸收在260nm,最低吸收在240 nm,0．D 260／280nm 比值为1．70。 提纯能病毒粒体在电镜下观察为等轴20面体,表面形态亚单位清晰可见。粒体平均直径为23．9 8nm。用提纯的 PLRV免疫啄鼠阳家兔,在国内首次制备出高效价特异性的PLRV抗血清。用对流免疫电泳测得抗血清最高效价为1／4096。应用适当稀释的抗血清,以对流免疫电泳的方法,可直接诊断感染卷叶病的马铃薯茎叶中的PLRV。     

I型马立克氏病毒38kD磷蛋白与Ⅱ和Ⅲ型病毒间的交叉免疫反应

由致病性Ⅰ型马立克氏病病毒(MDV)特异性的单克隆抗体H_(19)制备亲和层析柱,从感染重组杆状病毒BP38Ⅱ的昆虫细胞系Sf9细胞中提纯MDV的pp38基因表达产物,以此免疫小鼠制备抗血清,测定其与不同型MDV毒株感染的鸡胚成纤维细胞免疫反应性,同时也用不同型MDV毒株(HVT,Z4)制备的抗血清和自然感染发病鸡血清分别与感染重组病毒的Sf9细胞进行免疫交叉反应.试验结果表明,完整的Ⅰ型MDV来源的pp38基因产物与所试Ⅱ型Z4株和Ⅲ型HVT Fc126毒株在抗原性上有显著交叉反应.这一结果表明,在Ⅱ型和Ⅲ型MDV毒株中可能存在着pp38的类似物.     

甘薯羽状斑驳病毒分离提纯及血清学特性

从感染有甘薯羽状驳病毒的牵牛（I．Nil）叶片,通过超速离心,Cscl密度梯度离心提纯SPFMV粒子,每千克叶片可得病毒13－15毫克。电镜观察病毒粒子长度范围在820－860nm,也可见到900nm以上的特长粒子。病毒提纯物的紫外吸收曲线呈典型核蛋白吸收曲线,OD260／OD280＝1．21,免疫电镜检查,该病毒与SPFMV抗血清起阳性反应。     

黑曲霉病毒的形态和特性及其在细胞内的表现

从产生糖化酶的黑曲霉(Aspergillus niger)菌株中分离到一种等轴对称、衣壳表面有突起、内含双链RNA的病毒颗粒。病毒颗柱在电镜下直径为28—33nm,呈六面体晶格排列。病毒在蔗糖密度梯度离心中有三个分部,分析超离心所得沉降系数为161S,118S和94S。病毒在凝胶电泳中为一条带,在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳中外壳蛋白分子量为90,000、82,000、76,000、52,0000、42,000 道尔顿。提取的病毒与其抗血清在免疫双扩散实验中出现一条沉淀线。病毒核酸有5个组分,与聚肌苷：聚胞苷[poly(1)：poly?]抗血清反应中出现一条沉淀线。在早期菌丝细胞超薄切片中,病毒颗粒多近似球状紧密聚集,外被以膜结构,聚生或散生于胞质中;后期菌丝细胞中病毒颗粒则多散生于胞质中。     

应用亲和层析法提纯鸡马立克氏病病毒pp38基因重组产物

利用鸡马立克氏病病毒(MDV)Ⅰ型特异单克隆抗体H_(19)致敏Sepharose 4B-CNBr,从感染重组病毒BP38Ⅱ的昆虫细胞中提纯鸡马立克氏病毒pp38基因重组产物,获得良好效果。提纯的蛋白质在SDS-PAGE中表现出一条分子量约为38kDa的蛋白质条带,在免疫印迹试验中该蛋白质条带也能被单克隆抗体H_(19)识别。利用该提纯的重组pp38免疫小鼠,所制备的小鼠抗血清在免疫荧光染色试验中不仅能与感染重组病毒的昆虫细胞Sf9反应,也能和Ⅰ型MDV型感染的鸡胚成纤维细胞反应。     

山东烟台小麦土传病毒病由小麦黄花叶病毒和土传小麦花叶病毒相关病毒复合侵染所致

在山东省烟台地区的小麦上发生一种由土壤中禾谷多粘菌Polymyxa graminis传播的病毒病,感病小麦植株表现矮化褪绿和花叶症状.我们于1997年4月从病区采集感病小麦植株,进行了病毒种类鉴定.直接电镜观察发现有二种病毒粒子,一种粒子呈棒状,占大多数,其长度约为300nm和150nm; 另一种粒子呈线状,数量较少,长度为500nm～700nm.免疫电镜结果表明,棒状病毒粒子仅与土传小麦花叶病毒(soil-borne wheat mosaic virus, SBWMV)抗血清反应,而不与小麦黄花叶病毒(wheat yellow mosaic virus,WYMV)抗血清和小麦梭条斑花叶病毒(wheat spindle streat mosaic virus,WSSMV)抗血清反应;反之,线状病毒仅与WYMV、WSSMV抗血清反应,而不与SBWMV抗血清反应.用WYMV和SBWMV两种抗血清同时进行修饰时,线状病毒粒子和棒状病毒粒子均发生反应.     

应用亲和层析法提纯 鸡马立克氏病病毒pp38基因重组产物

利用鸡马立克氏病病毒(MDV)1型特异单克隆抗体H19致敏Sepharose 4B—cNBr,从感染重组病毒BP38Ⅱ的昆虫细胞中提纯鸡马立克氏病毒pp38基因重组产物,获得良好效果。提纯的蛋白质在SDS—PAGE中表现出一条分子量约为38kDa的蛋白质条带,在免疫印迹试验中该蛋白质条带也能被单克隆抗体H19识别。利用该提纯的重组pp38免疫小鼠,所制备的小鼠抗血清在免疫荧光染色试验中不仅能与感染重组病毒的昆虫细胞Sf9反应,也能和Ⅰ型MDV型感染的鸡胚成纤维细胞反应。     

西葫芦黄化皱缩病CMV毒株的提纯及其理化性质的研究

西安西葫芦黄化皱缩病的黄瓜花叶病毒(CMV)毒株,以普通烟为繁殖寄主,将病叶组织经柠檬酸缓冲液匀浆抽提,PEG沉淀,三次差速离心循环,可成功地得到病毒提纯制备物,每公斤病叶组织的病毒产量为300—800 mg。电镜观察到直径约30nm的等轴病毒颗粒,病毒的沉降常数So20w=98,外壳蛋白亚基分子量为2．62×104道尔顿。     

烟草曲叶双生病毒的研究 I．广西分离物的生物学特性和血清学反应

烟草曲叶病已在广西九个产烟县(市)发生危害,一般为零星发生,局部地区平均发病率高达50％以上,造成严重经济损失。试验结果表明,此病仅可通过嫁接和烟粉虱(Bemisiatabaci)传染,而汁液摩擦、种子和中国菟丝子((Cuscuta chinesis)不传病。除普通烟(Nicotianatabacum)外,还可侵染枯斑三生烟(N.tabacum var.xanthi N)、番茄(Lycopersicon esculentum)和蔓陀罗(Datura stramonium)等鉴别寄主,产生典型的曲叶症状。ELISA检测结果表明,病烟叶提取液与非洲木薯花叶病毒(ACMV)的两个单抗(SCR 18和SCR 23)呈阳性反应,而与另外两个单抗(ACMV SCR 11和ICMV(印度木薯花叶病毒)SCR 52)呈阴性反应,用ACMV单抗SCR 18免疫吸附法制片,在电镜下观察到球状成对或单个的病毒颗粒,单颗粒直径为18nm,成对颗粒大小为15—18x 25—30nm。     

用琼脂双扩散法检测马铃薯卷叶病毒(PLRV)

马铃薯卷叶病毒(PLRV)早已在1916年发现,但由于植株体内病毒的浓度极低,提纯十分困难,使得血清学检测的研究进展很慢。1974年日本Murayama等首次制备了高效价的抗血清,也仅能与提纯的病毒制剂起反应。以后瑞士GugerIi、荷兰Maat等、美国Clarke和Hepp等以及张鹤龄等虽也相继制备出抗血清,但均不能用琼脂双扩散法进行检测,必须将病毒进行提纯或半提纯后才能见到反应沉淀线,使得这种     

苏云金芽胞杆菌cryⅡ基因的克隆和表达

分离的苏云金芽胞杆菌(Bacillus-thuringiensis)YBT-791对鳞翅目小菜蛾(Plutellaxylostella)有毒力,将其质粒DNA提纯,经HindⅢ酶切后与杀虫晶体蛋白cryⅡ基因探针杂交,显示出分子量分别为5kb和9．4kb两条DNA阳性片段。把5kb的DNA阳性片段克隆到pUCl8的HindⅢ位点上并转化大肠杆菌TGl,经酶切和杂交检测,证明斑点杂交阳性克隆子中含有5kb的cryI片段。把这个含cryⅡ基因的5kbHindⅢ片段进行亚克隆,将4kb的BamHI－Pstl酶切片段插入穿梭载体pXl61中,并用电脉冲法克隆于苏云金杆菌不产伴胞晶体的突变株中,得到产生单一cry Ⅱ基因编码的杀虫晶体蛋白的克隆菌株M一5。经电镜观察,该克隆菌株能形成出发菌YBT－791多种形态伴胞晶体中的一种方形伴胞晶体;经免疫双扩试验,它只能与Cry Ⅱ晶体蛋白抗血清形成沉淀线;经SDS—PAGE电泳,克隆菌的伴胞晶体只含有一种65kDa的晶体蛋白。生物测定结果表明它既对鳞翅目小菜蛾(Piutella xylostella)有毒性,又对双翅目致倦库蚊(Culex quinquefasciatus)有毒性。     

薄荷伪造桥虫NPV感染斜纹夜蛾幼虫分离的一种新NPV特性的研究

用薄荷伪造桥虫核型多角体病毒(Argroyamma agnata NPV)(以下简称Aa NPV)在室内感染斜纹夜蛾(Prodenia litura)幼虫,从死虫体内分离到一种NPV。经电镜观察,多角体蛋白分析、病毒核酸的限制性内切酶酶解分析等研究,证明此多角体直径为1.5—2.6/μm,病毒粒子为杆状,其大小为100—150×420nm,病毒粒子为多粒包埋型。提纯的多角体蛋白只有一种多肽,分子量为33,500d,提纯的病毒粒子的结构多肽至少有15种,其分子量范围为15,600     

应用亲和层析法是纯鸡马立克氏病病毒PP38基因重组产物

利用鸡马立氏病病毒（ＭＤＶ）Ｉ型特异单克隆抗体Ｈ１９致敏Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ－ＣＮＢｒ,从感染重组病毒ＢＰ３８Ⅱ的昆虫细胞中提纯鸡马立克氏病毒ＰＰ３８基因重组产物,获得良好效果,提纯的蛋白质的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ中表现出一条分子量约为３８ｋＤａ的蛋白质条带,在免疫印迹试验中该蛋白质带也能被单克隆抗体Ｈ１９识别。利用该提纯的重组ＰＰ３８免疫小鼠,所制备的小鼠抗血清在免疫荧光染色试验中不仅能与感染重组病     

广州地区GII.4 Sydney 2012[P31]型诺如病毒GZ2013-L10毒株病毒样颗粒功能和免疫原性鉴定

【背景】诺如病毒(Norovirus,NoV)是全球范围内引起急性胃肠炎暴发的主要病原体之一,其中GII.4型通过不断变异在人群中持续存在并占据诺如病毒感染的主导地位,尤其GII.4 Sydney2012[P31]变异株自2012年出现以来在全球各地持续流行至今。【目的】制备广州地区GII.4 Sydney2012[P31]型诺如病毒毒株GZ2013-L10的病毒样颗粒(virus like particle,VLP),并系统表征其功能及免疫原性特点。【方法】从毒株GZ2013-L10中扩增ORF2基因并克隆构建重组转座载 PFastBac1-L10-ORF2,进一步转化至大肠杆菌DH10Bac构建重组杆状病毒质粒,进而在昆虫细胞sf9中表达病毒样颗粒并通过超速离心纯化,最后经透射电镜、Western blotting和受体结合实验对病毒样颗粒进行表征。此外,将免疫小鼠获得的病毒抗血清通过间接酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)和受体结合阻断试验进行验证。【结果】成功构建了重组杆状病毒质粒Bacmid-L10-ORF2并获得病毒样颗粒,电镜结果表明病毒样颗粒直径约为30 nm,SDS-PAGE和Western blotting显示蛋白大小约为58 kDa。受体结合实验结果显示,病毒样颗粒能与A/B/O等分泌型唾液受体及猪胃黏膜蛋白结合,而与非分泌型唾液受体均不结合。免疫小鼠获得效价为1.3×105的抗血清,但ELISA结果显示其与不同基因型诺如病毒衣壳蛋白无交叉免疫活性。此外,抗血清对同型病毒样颗粒具有受体中和阻断作用,但对不同型别病毒样颗粒(包括GII.8、GII.17和GII.3)无中和效果。【结论】本研究制备并系统表征了广州地区GZ2013-L10毒株的病毒样颗粒及其抗血清,其研究结果可为解析其流行原因以及疫苗研发提供参考。     

小麦黄花叶病毒的分离提纯及其血清学等特性

应用梯度离心和超速离心浓缩获得部分提纯的病毒制剂,产量约为7.45g/kg病叶提纯的病毒制剂的紫外吸收曲线呈典型的核蛋白吸收曲线,OD260/OD242和OD260/OD280的比值分别为1.24和1.38。病毒粒子呈线状,宽13—14nm,长度主要分布于250—300nm和550—700nm之间,1000nm以上的粒子也有检到。病毒外壳蛋白仅由一个分子量约为30Kd的亚基组成。在免疫电镜试验中、病毒粒子与日本WYMV抗血清发生强烈的血清学反应。新鲜病叶的超薄切片中可看到大量风轮体和膜状体。     

我国13种天南星科作物上的芋花叶病毒

用直接负染和免疫电镜方法从我国浙江省(杭州、奉化、温州等地)、上海、北京、福建、湖南等地的13种天南星科大田作物:芋(Colocasia esadenta)、魔芋(Amorphophallus sinesis)、药用植物:半夏(Pinellia ternata)、掌叶半夏(P. cordata)、盾叶半夏(P. pedatisecta)以及观赏植物:马蹄莲(Zantedeschia aethiopica)、海芋(Alocasia macrorrhiza)、象耳芋(Colocasia gigantea)、台果芋(Syngonium podophygum)、黄金葛(Scindapsus aureus)、广东万年青(Aglaonema modestum)、花叶芋(Caladium bicolar)、剑叶喜林芋(Philodendium oxycadium)上均检测到芋花叶病毒(Dasheen mosaicvirus, DMV)。在免疫吸附-免疫修饰电镜水平上,该病毒与DMV抗血清和PVY抗血清均有强阳性反应。在人工接种条件下,DMV各分离物均不侵染烟草等非天南星科供试植物,但接种天南星科指示植物Philodendr…     

一株貂肠炎病毒某些特性的研究

采用猫肾传代细胞FK增殖华东地区分离的貂传染性肠炎病毒(mink infectious enteritis virus,MEV-S_1)能产生明显的细胞病变。浓缩的病毒液经Sepharose-4B柱层析提纯处理后置电镜下观察,可见典型的病毒粒子。经蛋白酶K、SDS裂解病毒,用苯酚-氯仿法抽提病毒核酸,二苯胺试验和酶消化试验表明该病毒核酸为DNA类型。吖啶橙染色试验表明该DNA为单链。甲酰胺法进行核酸分子展层,病毒核酸呈线状,长度为1.5～2.0/μm。