人脂皮素—1cDNA的克隆及其在大肠杆菌中的表达

脂皮素－1（LC－1）是钙依赖性的膜磷脂结合蛋白,介导糖皮质激素的抗炎作用。本研究采用RT－PCR法获取人LC－1cDNA,以pUC18为克隆载体、pBV220为表达载体,在DH5α菌成功表达了LC－1,免疫印迹实验证实了重组蛋白的免疫活性。     

人LC3B基因的真核表达及鉴定

目的:构建带HA标签的重组人LC3B基因的真核表达载体,获得HA-LC3B融合蛋白,并初步检测其生物学功能。方法:从人乳腺文库中通过PCR技术扩增LC3B基因编码序列,将其插入pc DNA3.0-HA载体,获得HA-LC3B真核表达载体;将重组质粒与空载体分别转染人胚肾293T细胞,通过Western印迹检测转染细胞的表达情况,免疫共沉淀实验证实其生物学活性。结果:双酶切和测序结果表明HA-LC3B真核表达质粒构建成功,Western印迹表明重组质粒转染293T细胞后获得表达;免疫共沉淀实验显示HA-LC3B融合蛋白可以和Atg4B蛋白相互作用,具有较好的生物学活性。结论:在真核表达系统中表达了带HA标签的人LC3B,为进一步研究细胞自噬奠定了基础。     

黄颡鱼自噬相关基因 LC3B和Beclin1的原核表达及多克隆抗体制备

为深入研究黄颡鱼Pelteobagrus fulvidraco自噬的发生过程和机制, 从黄颡鱼cDNA中克隆获得372和1344 bp的黄颡鱼LC3B(PfLC3B)和Beclin1(PfBeclin1)基因编码序列, 并成功构建了pET32a(+)-PfLC3B和pET32a(+)-PfBeclin1重组表达载体, 分别采用亲和层析和包涵体纯化的方法得到了纯度较高的重组PfLC3B和PfBeclin1蛋白; 以重组PfLC3B和PfBeclin1蛋白免疫Balb/C小鼠, 制备多克隆抗体。通过Western blot鉴定了PfLC3B和PfBeclin1抗血清可以分别特异性识别重组PfLC3B和PfBeclin1蛋白; PfLC3B抗血清可以特异性识别黄颡鱼内源性LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ蛋白, PfBeclin1抗血清可以特异性识别黄颡鱼内源性Beclin1蛋白。蛋白水平的组织分布显示, 黄颡鱼LC3和Beclin1蛋白在肝脏中表达水平均较高, 在肾脏和脾脏中的表达水平较低。综上所述, 研究成功制备了黄颡鱼LC3B和Beclin1的多克隆抗体, 为深入研究黄颡鱼自噬机制提供了有力工具。     

携带Flag标签的人自噬相关蛋白4B的真核表达及功能鉴定

目的:构建携带Flag标签的人自噬相关基因4B(ATG4B)的真核表达质粒,获得Flag-ATG4B融合蛋白,并检测其与LC3的相互作用。方法:以本实验室保存的乳腺文库为模板,采用PCR技术扩增获得ATG4B序列,并将其插入pc DNA3.0-Flag载体构建成重组质粒,转染HEK293T细胞后用Western印迹检测融合蛋白的表达,用免疫共沉淀检测ATG4B与LC3的相互作用。结果:菌液PCR和重组质粒的双酶切结果及测序均表明重组质粒构建成功,Western印迹表明融合蛋白在HEK293T细胞中获得表达,免疫共沉淀结果表明表达的ATG4B能与LC3结合。结论:构建了pc DNA3.0-Flag-ATG4B真核表达质粒,表达的ATG4B蛋白对LC3的切割至关重要,这为进一步研究ATG4B在自噬过程中的作用奠定了基础     

GFP-LC3B真核表达载体的构建及表达鉴定

目的:构建人自噬相关基因LC3B的真核表达载体p EGFP-C1-LC3B,并鉴定其表达。方法:以乳腺文库为模板,PCR扩增LC3B全长基因,将其克隆至p EGFP-C1表达载体,得到p EGFP-C1-LC3B重组质粒,酶切和测序鉴定后,转染ZR75-1细胞,Western印迹检测真核细胞中GFP-LC3B融合蛋白的表达,用倒置荧光显微镜观察自噬诱导剂雷帕霉素处理和未处理ZR75-1细胞质中GFP-LC3B的分布。结果:Western印迹可见GFP-LC3B融合蛋白表达条带;在荧光显微镜下,ZR75-1细胞内可见绿色荧光,雷帕霉素刺激后有明显绿色荧光聚集体形成。结论:人自噬相关基因LC3B的真核表达载体p EGFP-C1-LC3B构建成功,为进一步研究自噬在乳腺癌细胞中的作用机制奠定了基础。     

HIV-1 Vpu蛋白的原核表达、鉴定和纯化

目的：克隆、表达、纯化人免疫缺陷病毒Ⅰ型（HIV-1）Vpu蛋白,为其功能及免疫学研究奠定基础。方法：PCR扩增Vpu基因,纯化、酶切后克隆到原核表达载体pET32a中,转化大肠杆菌BL21（DE3）菌株获得表达工程菌株,IPTG诱导蛋白表达,免疫印迹鉴定目的蛋白,亲和层析纯化蛋白。结果：构建了HIV-1Vpu蛋白的原核表达载体Vpu-pET32a,并在大肠杆菌中高效表达,目的蛋白呈可溶性形式存在,免疫印迹检测显示为目的蛋白,经Ni—NTAAgarose纯化获得了高纯度的目的蛋白。结论：在原核表达系统中表达了可溶性HIV-1Vpu蛋白,为进一步进行HIV-1Vpu蛋白的免疫原性和功能研究奠定了基础。     

自噬相关基因LC3-I的基因表达及单克隆抗体的制备

目的：通过克隆LC3．I基因,体外原核表达LC3-I蛋白后制备抗LC3单克隆抗体,作为自噬研究中的标记分子检测自噬的发生和发展过程。方法：RT．PCR方法从RAW264．7细胞基因组中克隆LC3基因,亚克隆至pQE80L原核表达载体后转化E．cobDH5a进行诱导表达,SDS—PAGE电泳及Westemblot鉴定表达蛋白。蛋白纯化后免疫BALB／c小鼠。采用淋巴细胞杂交瘤技术,制备分泌抗LC3．I杂交瘤细胞株,体内诱生腹水制备mAb,间接ELISA法测定其效价,辛酸一硫酸铵沉淀法及亲和层析法纯化mAb。结果：成功克隆了LC3一I基因,并对其在E．coilDH5a进行诱导表达,SDS-PAGE分析表明在相对分子量Mr为20×10^3有特异条带,Westernblot验证表达产物具有一定的生物学活性。建立了3株稳定分泌特异性抗LC3-ImAb的杂交瘤细胞株,诱导产生的腹水获得的抗体效价在10^5-10^7之间,结论：在E．coli中对LC3-I进行表达,并制备特异性较强抗LC3-I蛋白的单克隆抗体。为自噬研究提供了良好的标记分子,可对自噬形成和发展进行有效的检测。     

应用LC3B-PLA2研究Atg4B对LC3B的切割作用

目的:构建带Myc标签的LC3B-PLA2基因的真核表达质粒,获得LC3B-PLA2融合蛋白,并应用LC3B-PLA2研究Atg4B对LC3B的切割作用。方法:以本实验室保存的乳腺文库为模板,PCR扩增获得LC3B序列,与PLA2G10拼接后插入pCMV-Myc载体,用构建的重组质粒转染HEK293T细胞,Western印迹检测融合蛋白的表达,用LC3B-PLA2与Atg4B共转染的方法检测Atg4B对LC3B的切割作用。结果:菌液PCR、重组质粒双酶切及测序均表明重组质粒构建成功,Western印迹结果表明融合蛋白在HEK293T细胞中获得表达,LC3B-PLA2真核表达蛋白能够应用于Atg4B对LC3B切割作用的研究。结论:构建了pCMV-Myc-LC3B-PLA2真核表达质粒,LC3B-PLA2融合蛋白在Atg4B对LC3B切割作用的研究中至关重要,为进一步研究Atg4B在自噬过程中的作用奠定了基础。     

Beclin-1 shRNA对低氧诱导的SH-SY5Y细胞自噬的影响

目的：构建Beclin-1基因短发夹干扰RNA（shRNA）慢病毒载体,感染人SH-SY5Y细胞,观察沉默Beclin-1基因后低氧对SH-SY5Y细胞自噬的影响。方法：构建特异性靶向Beclin-1基因的shRNA慢病毒表达载体和阴性对照序列慢病毒载体;再将载体转染入SH-SY5Y细胞;RT-PCR检测Beclin-1的mRNA表达;Western blot检测Beclin-1蛋白表达;CCK-8法测定Beclin-1 shRNA对SH-SY5Y细胞活力的影响。再将空白对照、阴性对照、转染型三种细胞分别以21%常氧及5%低氧培养,Western blot检测各组细胞LC3蛋白表达;电镜观察自噬小体。结果：Beclin-1 shRNA能明显抑制SH-SY5Y细胞Beclin-1的mRNA及蛋白的表达;沉默Beclin-1基因后,Beclin-1 shRNA组细胞存活率与阴性对照组相比无差异;成功建立了稳定表达Beclin-1 shRNA的SH-SY5Y细胞。5%低氧处理后,与阴性对照组相比较,Beclin-1 shRNA组细胞中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值下调,细胞内自噬小体数量减少。结论：慢病毒介导的Beclin-1shRNA对SH-SY5Y细胞的活力无影响,但可以抑制低氧诱导的自噬。     

自噬相关蛋白LC3Av1和LC3B在大鼠牙髓炎中的表达研究

目的研究自噬相关蛋白LC3Av1和LC3B在大鼠实验性牙髓炎组织中的表达。方法 30只8周龄SD大鼠左侧下颌第一磨牙开髓,封入大肠埃希菌LPS(5μg/μL)棉球,玻璃离子封闭髓腔。分别于开髓后0、6、12、24和48h处死大鼠,分离下颌骨。组织学处理后,HE染色观察牙髓组织炎症状况,免疫组织化学染色SP法检测LC3Av1和LC3B的表达及分布。结果正常牙髓组织中LC3Av1和LC3B少量表达。实验组中,LC3Av1在12、24和48h时表达量较0、6h时显著增高,差异具有统计学意义(P0.01);LC3B在6、12h时表达量较0、24和48h时增高,差异具有统计学意义(P0.05);两种蛋白表达分布均集中于成牙本质细胞及多细胞层中的成纤维细胞。结论自噬相关蛋白LC3Av1和LC3B在牙髓组织中的表达随炎症发展增加,提示自噬作用可能与牙髓炎的发生发展相关。     

六种藓类植物茎的比较解剖学研究

通过对6种藓类植物,即褶叶青藓(Brachythecium salebrosum(Web.et Mohr.)B.S.G.)、湿地匐灯藓(Plagiomnium acutum(Lindb.)Kop.)、侧枝匐灯藓(Plagiomnium maximoviczii(Lindb.)Kop.)、大凤尾藓(Fissidensnobilis Griff.)、大羽藓(Thuidium cymbifolium(Doz.et Molk.)B.S.G.)和大灰藓(Hypnum plumaeforme Wils.)嫩茎和老茎的石蜡切片和显微观察发现,同一藓类植株的嫩茎和老茎,茎结构稳定,不同种藓类植物茎横切面具有不同特征.植物体茎横切面形状、表层细胞的层数、细胞大小和细胞壁厚薄、皮层细胞大小和形状、中轴的有无以及比例等特征可以作为藓类植物的分科分类依据之一.