辣椒疫霉质外体疏水小蛋白SCR82编码基因的转录特征、异源表达和功能

【目的】分析PcF/SCR质外体疏水小蛋白SCR82编码基因在辣椒疫霉生长发育和侵染寄主阶段的转录特征,克隆其cDNA和基因组全长序列,分析蛋白性状及其序列保守性,利用大肠杆菌表达并获得纯化蛋白,分析其生物学功能。【方法】提取辣椒疫霉菌丝、游动孢子囊、游动孢子、萌发休止孢和7个侵染时间点(1.5、3、6、12、24、36、72 h)的本氏烟根部总RNA,利用半定量RT-PCR分析scr82的转录表达水平;通过高保真PCR从萌发休止孢cDNA和基因组DNA中克隆出该基因全长序列;利用软件对SCR82进行生物信息学分析,挖掘其他物种中的同源序列,预测蛋白性状;将c DNA全长序列克隆到含6×His-SUMO序列的p ET28a(+)中,在不同温度(22、37°C)和IPTG浓度(0.1、0.2、0.5、1.0 mmol/L)组合条件下利用大肠杆菌Rossette 2菌株表达该蛋白,利用Ni~(2+)亲和层析柱纯化蛋白;将蛋白浸润本氏烟和拟南芥叶片,分析它是否引起植物细胞死亡,蛋白浸润12、24h后利用RT-qPCR分析本氏烟中3个抗性相关基因(NbMC1、NbSOD、NbPOX)的表达量变化。【结果】scr82基因在辣椒疫霉萌发休止孢和侵染寄主阶段上调表达;该基因为辣椒疫霉中单拷贝基因,不含内含子,开放阅读框为249 bp;预测其编码82个氨基酸,包含长度为21个氨基酸的信号肽序列和7个半胱氨酸但不含有任何已知功能域,蛋白疏水性强,二级结构主要为α-螺旋和不规则卷曲,在疫霉菌中保守;含重组质粒的菌株在22°C经0.2 mmol/L的IPTG诱导过夜(～16 h)产生大小约24 kDa的融合蛋白,纯化获得30 mg/mL的可溶性蛋白;融合蛋白不引起本氏烟和拟南芥叶片的细胞死亡,但导致本氏烟抗性相关基因均上调表达。【结论】本研究获得了辣椒疫霉胞外疏水小蛋白SCR82的原核表达蛋白,该蛋白不引起植物细胞死亡,但触发植物的防卫反应。     

西瓜食酸菌Ⅲ型分泌效应物基因aopW功能初步分析

【背景】细菌性果斑病(bacterial fruit blotch,BFB)是葫芦科植物上一种严重的检疫性病害,其病原菌为西瓜食酸菌(Acidovorax citrulli)。目前已知Ⅲ型分泌效应物(typeⅢsecreted effectors,T3SEs)是该病菌的关键致病因子,但对其效应物功能和作用机制的认识非常有限。【目的】鉴定西瓜食酸菌Ⅲ型分泌效应物基因aopW,分析其编码蛋白质影响植物免疫的方式,为更深入地认识该基因在西瓜食酸菌致病机制中的作用奠定基础。【方法】利用生物信息学分析其序列特征;借助荧光定量PCR技术分析aopW的表达调控及其与抗病相关基因表达间的关系;利用基因突变及基因功能互补手段,通过分析致病性、寄主活性氧积累量等解析基因功能;采用瞬时表达技术了解AopW诱导非寄主hypersensitive response (HR)能力及其亚细胞定位情况。【结果】aopW基因启动子区存在Ⅲ型分泌系统(type Ⅲ secretion system,T3SS)核心基因结合位点,其编码的蛋白不存在信号肽和跨膜螺旋区,与Ⅲ型分泌效应物harpin蛋白同源;T3SS核心基因hr...     

蒺藜苜蓿MtROP10基因的克隆及其功能初探

目的:克隆并研究蒺藜苜蓿ROP基因的功能,为研究该基因家族在共生途径中的作用提供依据.方法:采用RACE方法,从蒺藜苜蓿中克隆MtROP基因,利用生物信息软件比对同源性及ROP蛋白特征结构分析,利用RT-PCR方法分析该基因的组织特异性表达,构建该基因的过表达载体并转化拟南芥.结果:获得了蒺藜苜蓿ROP家族中与拟南芥ROP10高度同源的MtROP10全长序列.氨基酸编码序列具有明显的ROP家族蛋白的结构域特征.该基因在花中高表达,根中低表达.拟南芥中过表达MtROP10,可导致根毛变粗、变短、分叉.结论:MtROP10属于植物ROP家族蛋白,可能在根毛的极性生长方面具有较为重要的功能.     

辣椒疫霉RXLR型效应子PcAvh2的序列多态性、基因转录特征及功能

【目的】分析辣椒疫霉中RXLR型效应子PcAvh2的序列多态性,研究该效应子在辣椒疫霉生长发育和侵染阶段的转录特征及其生物学功能。【方法】本研究通过高保真扩增,分析2个烟草疫霉、1个恶疫霉和31个辣椒疫霉菌株的PcAvh2序列;提取辣椒疫霉菌丝、游动孢子囊、游动孢子、萌发休止孢和7个侵染时间点(1.5、3、6、12、24、36、72 h)的本氏烟根部总RNA,利用RT-qPCR分析PcAvh2的转录表达水平;利用PVX瞬时表达系统,分析PcAvh2是否抑制6种效应子(BAX、INF1、PsojNIP、PsCRN63、PsAvh241、R3a/Avr3a)激发的植物免疫反应;利用CaCl_2-PEG介导的原生质体稳定转化技术,沉默PcAvh2基因,分析辣椒疫霉致病力的变化。【结果】PcAvh2为典型的RXLR效应子,在辣椒疫霉群体中该效应子具有10个等位基因,而且烟草疫霉和恶疫霉中也存在该效应子。该基因在辣椒疫霉的侵染阶段上调表达,它能够抑制6种效应子激发的植物免疫反应,进一步研究发现基因沉默导致辣椒疫霉的致病力显著下降。【结论】RXLR型效应子PcAvh2是辣椒疫霉中一个重要的侵染致病因子。     

苹果蠹蛾NAPDH-细胞色素P450还原酶(CPR)基因的克隆及表达模式分析

【目的】本研究通过克隆苹果蠹蛾Cydia pomonella CPR (CpCPR)基因cDNA序列,并对该基因的表达模式进行分析,为深入研究P450酶系在苹果蠹蛾对植物次生物质和杀虫剂解毒代谢过程中的作用提供理论基础。【方法】以近缘昆虫的CPR氨基酸序列作为询问序列,在苹果蠹蛾转录组(SRX371333)中进行筛查比对,获得了苹果蠹蛾CPR(CpCPR)基因的cDNA序列。采用RT-PCR技术克隆目的基因的开放阅读框(ORF)。利用生物信息学软件分析目的基因的序列特征、3D结构和与其他昆虫CPR基因的系统进化关系。采用RT-qPCR技术测定CpCPR基因在苹果蠹蛾不同发育阶段(卵、幼虫、蛹和成虫)及幼虫不同组织部位(头部、表皮、脂肪体、中肠和马氏管)的表达水平。【结果】克隆获得的苹果蠹蛾CpCPR基因的ORF为2 052 bp,编码683个氨基酸残基,预测的蛋白质分子量(Mw)为77.326 ku,理论等电点(pI)为5.65。CpCPR包含FMN区域、NADPH区域和FAD等昆虫CPR的典型特征。系统发育分析表明,苹果蠹蛾CpCPR与鳞翅目昆虫CPR基因聚在一枝。RT-qPCR结果表明,CpCPR基因在苹果蠹蛾的整个发育阶段均有表达,在幼虫期表达量最高;CpCPR基因在4龄幼虫的各部位均有表达,在中肠中的表达量最高。【结论】克隆获得了苹果蠹蛾CpCPR基因的ORF序列,该基因在苹果蠹蛾主要取食阶段和消化器官中高表达,表明其可能在苹果蠹蛾对植物次生物质和杀虫剂解毒代谢过程中扮演重要作用。     

广东虫草邻氨基苯甲酸合酶基因克隆及不同实验条件下的表达

【背景】邻氨基苯甲酸合酶(TrpE)广泛存在于植物和微生物中,参与色氨酸和生长素的生物合成,在生长发育及胁迫响应过程中具有重要的作用。广东虫草(Tolypocladium guangdongense)是华南地区特有的一种极具开发价值的虫草资源。【目的】明确TgtrpE基因特征,并探究该基因在不同发育时期和不同温度下的表达模式。【方法】从广东虫草中克隆TgtrpE编码区序列,并进行生物信息分析和系统发育分析,采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)分析TgtrpE在广东虫草中不同发育时期及温度胁迫下的表达模式。【结果】TgtrpE编码区序列长度为1613bp(DNA)和1563bp(cDNA),编码521个氨基酸,预测其蛋白分子量约为56.86kD。系统发育分析显示,TgTrpE蛋白与子囊菌中的TrpE蛋白聚为一个分支,与奇异弯颈霉(Tolypocladiumparadoxum)和头状弯颈霉(Tolypocladiumcapitatum)具有较高的相似性。RT-qPCR结果表明:在广东虫草原基和幼嫩子实体的发育过程中,TgtrpE显著上调,而在成熟子实体期该基因显著下调;在温度胁迫过程中,TgtrpE显著下调表达。【结论】TgtrpE可能在广东虫草原基形成、子实体发育及温度胁迫响应过程中具有重要调控作用。     

亚洲玉米螟卵黄原蛋白受体基因的克隆及在UV-A胁迫下的表达分析

【目的】本文旨在克隆亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis卵黄原蛋白受体(VgR)基因,分析其表达模式,探索UV-A胁迫对亚洲玉米螟VgR基因表达的影响。【方法】利用RT-PCR与RACE技术克隆亚洲玉米螟VgR基因的全长序列;运用生物信息学方法分析该基因特征;采用RT-qPCR技术检测不同发育阶段(卵、1-5龄幼虫、蛹、成虫)、雌成虫不同组织(头、足、表皮、卵巢、中肠、脂肪体)、雌成虫不同时长(0、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4和4.5 h)UV-A胁迫下该基因的相对表达量。【结果】克隆获得了亚洲玉米螟VgR基因,命名为OfVgR(GenBank登录号:MN058042),其全长6 289 bp,开放阅读框(ORF)5 490 bp,编码1 829个氨基酸,预测蛋白分子量为205.27 ku,N端前31个氨基酸为信号肽。序列分析显示,OfVgR具有2个配体结合域(LBD)、2个表皮生长因子前体同源域(EGFP)、跨膜域(TMD)和胞质尾域。系统发育树分析表明,OfVgR与鳞翅目昆虫VgR聚为一支,亲缘关系较近。RT-qPCR检测结果表明,OfVgR在亚洲玉米螟各发育阶段均有表达,其中在卵和雌成虫中高表达,并在雌成虫羽化24 h时表达量达到最高;雌成虫不同组织中,OfVgR在卵巢中表达量最高;OfVgR表达量随着UV-A照射时间的延长呈先下降后上升再下降的趋势,在3.0 h达到最高值。【结论】亚洲玉米螟OfVgR在不同发育阶段,雌成虫不同组织和UV-A胁迫不同时间的雌成虫中差异表达,对探索UV-A胁迫对亚洲玉米螟生殖的分子机制影响奠定基础。     

基于URA3基因快速构建表达载体及其在里氏木霉的应用

【背景】表达载体是基因工程必不可少的工具,对于真菌如里氏木霉(Trichoderma reesei)等,由于缺乏商品化的表达载体,使其基因工程蛋白表达既复杂又费时而难以开展。【目的】建立一种利用URA3序列快速构建表达载体的方法,解决真菌研究中难以简单、高效和快速构建表达载体的难题。【方法】基于URA3基因的序列,利用其启动子上游5′端序列和终止子下游3′端序列构建同源重组臂,通过同源重组臂定向同源重组到宿主基因组上,利用强启动子和终止子替换URA3基因,从而实现外源基因的表达。根据此方法构建pTRUC表达载体,将红色荧光蛋白基因mCherry克隆到该表达载体上,转化里氏木霉中并验证m Cherry的表达。【结果】阳性转化子在荧光显微镜下观察到强的红色荧光信号,在基因组PCR中检测到mCherry,Westernblotting结果表明红色荧光蛋白m Cherry能在里氏木霉中表达,以上结果说明该载体构建成功,使外源基因mCherry在里氏木霉中正确表达。【结论】基于URA3基因的快速构建表达载体及其构建方法切实可行,将成为推动真核表达系统表达异源蛋白的有力工具。     

南亚实蝇鞣化激素基因的克隆与表达分析

【目的】克隆南亚实蝇Zeugodacus tau鞣化激素基因,分析其分子特征及时空表达模式,为探索其生理功能奠定基础。【方法】利用同源克隆和RACE技术从南亚实蝇刚羽化成虫中克隆鞣化激素基因bursicon-α和bursicon-β的全长cDNA序列,并用邻接法(neighbor-joining method)与其他昆虫同源序列构建系统发育进化树。利用荧光定量PCR技术检测这两个基因在南亚实蝇不同发育阶段(卵、1-3龄幼虫、预蛹、蛹和刚羽化成虫)的表达特性。【结果】克隆获得南亚实蝇鞣化激素基因bursicon-α(GenBank登录号:MH421861)和bursicon-β(GenBank登录号:MH421862)。bursicon-α基因开放阅读框为551 bp,编码183个氨基酸;bursicon-β基因开放阅读框为467 bp,编码156个氨基酸。基于两个鞣化激素基因的氨基酸序列的系统发育树分析显示,南亚实蝇Bursicon-α与Bursicon-β均与瓜实蝇Zeugodacus cucurbitae的同源蛋白亲缘关系最近,且与其他双翅目昆虫的同源蛋白聚为一类,形成独立的分支。荧光定量PCR结果表明,两个基因在南亚实蝇各龄期均有表达,均在第5天蛹和刚羽化成虫翅伸展时期表达量最高。【结论】bursicon-α和bursicon-β基因在南亚实蝇不同发育阶段表达量不同,推测其在南亚实蝇成虫表皮鞣化和翅的形成中发挥着重要作用。本研究为进一步探索鞣化激素在南亚实蝇生长过程中表皮的骨化、翅的重建等方面的功能机制奠定了基础。     

川滇高山栎QaGDU3基因的克隆及遗传转化

以川滇高山栎(Quercus aquifolioides Rehd. et Wils.)叶片为材料,分别采用不依赖于连接反应的克隆法、农杆菌花序侵染、实时荧光定量PCR、图像分析等方法克隆了QaGDU3基因,获得QaGDU3转基因拟南芥(Arabidopsis thaliana(L.)Heynh.)并分析转基因植物的表型变化,利用生物信息学对QaGDU3蛋白与其他物种的GDU3蛋白序列间的差异和进化关系进行了分析。结果显示,GDU3是种子植物特有的基因;QaGDU3属于阴离子渗透酶ArsB/NhaD超家族成员,可能具有氨基酸转运功能。QaGDU3基因在拟南芥中过表达能够激活水杨酸(SA)途径中AtPR1、AtACD6、AtCBP60g和AtPAD4基因的表达,且转基因拟南芥莲座大小随着QaGDU3基因表达量升高而变小。研究结果说明GDU3是种子植物所特有的氨基酸转运蛋白并参与植物生长发育的调控。     

日本晚樱PrseSHP基因的克隆与功能分析

采用同源克隆方法结合RACE技术,从日本晚樱(Prunus lannesiana)品种‘大岛樱’中克隆到花发育调控相关的PrseSHP基因(GenBank登录号为GU362645)。PrseSHP基因序列全长1 223bp,包含1个长741bp的完整开放阅读框,编码246个氨基酸和1个终止密码子。分子系统发生分析表明,PrseSHP属MADS-box转录因子的PLE/SHP进化系,并与蔷薇科植物的SHP同源蛋白聚于同一进化分支;蛋白序列比对显示,该转录因子拥有M、I、K和C共4个结构域,且其C末端结构域中包含高度保守的AGⅠ和Ⅱ基序。基因表达分析表明,PrseSHP基因主要在‘大岛樱’的花瓣、雄蕊、雌蕊和幼果等器官中表达,在花萼中仅能检测到微弱的转录信号,在幼叶中不表达,与其他植物SHP同源基因的表达模式有一定的差别。功能分析显示,转PrseSHP基因拟南芥植株明显比野生型拟南芥弱小,转基因拟南芥在6~8片莲座叶后即抽薹开花,时间较野生型拟南芥(14~17片莲座叶后抽薹开花)明显提前,证明异位表达的PrseSHP基因能促进拟南芥早花,其在花发育过程中可能参与调控植物开花。     

飞蝗发育相关基因Omb的克隆、原核表达及时空表达分析

【目的】本研究克隆飞蝗Locusta migratoria发育相关的optomotor-blind(Omb)基因,并对其进行序列和表达分析,旨在更好地了解Omb基因在飞蝗翅发育中的作用及为进一步蝗灾的治理和防治提供新的理论依据。【方法】利用RT-RCR扩增飞蝗Omb基因cDNA序列,采用生物信息学软件分析该基因的核苷酸和氨基酸序列,利用MEGA 6. 0构建昆虫纲分子系统进化树;构建重组表达载体pET-30a/LmOmb,转化到大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)中,SDS-PAGE及Western blot鉴定重组表达蛋白;基于qPCR技术分析Omb基因在飞蝗不同发育时期及成虫不同组织中的表达谱。【结果】克隆获得飞蝗Omb基因部分cDNA序列,命名为LmOmb(GenBank登录号:MG867658),其长792 bp,编码264个氨基酸,在第37-219位氨基酸之间存在一个T-box superfamily保守结构域。同源序列比对分析表明Lm Omb与褐飞虱Nilaparvata lugens Nl Omb氨基酸序列一致性为93%。在IPTG诱导下目标蛋白以6×His标签融合蛋白的形式在宿主菌中得到稳定表达。荧光定量PCR结果显示LmOmb基因在飞蝗不同发育时期均有表达,其中胚胎期的表达量最高,进入若虫期后表达量下降,且各龄若虫之间表达量相对平稳。Lm Omb基因在雌性和雄性成虫的胸部、足、腹部和翅中都有表达,且雌性和雄性之间表达量明显不同。【结论】LmOmb基因可能参与了飞蝗的胚胎发育。研究结果为进一步研究飞蝗LmOmb的功能提供了依据。     

辣椒CaNAC36转录因子耐盐性分析

【目的】辣椒是中国种植面积最大的蔬菜作物,随着土地盐碱化问题的日趋严重,加强辣椒耐盐机制研究对促进产业可持续发展具有重要意义。因而,急需加快辣椒耐盐相关关键基因的功能研究。【方法】研究组前期挖掘到与辣椒耐盐性相关的转录因子CaNAC36,在此基础上,以耐盐辣椒PI201224和敏盐辣椒PI438643为供试品种,克隆获得CaNAC36全长gDNA和cDNA序列,通过荧光定量分析CaNAC36及可能的互作基因在盐胁迫条件下不同组织部位的表达情况,并进一步结合生物信息学分析探究CaNAC36及其互作基因之间存在的潜在关系。【结果】结果表明,CaNAC36序列在耐盐和敏盐材料中DNA和cDNA同源性分别为99.86%和100%;荧光定量的结果表明,CaNAC36在耐盐材料根和茎组织中表现为诱导上调表达,在敏盐材料根和叶中表现为诱导下调表达;对可能与CaNAC36存在互作关系的48个基因的注释信息进行分析后,发现跨膜蛋白、转运蛋白、水孔蛋白、氯离子通道蛋白、解毒蛋白等14个基因可能与CaNAC36存在功能互作。进一步分析发现,在PI201224和PI438643盐胁迫处理不同时间点、不同组织中,5个相关基因（Capana08g002748、Capana00g004514、Capana09g000275、Capana07g001450、Capana02g001031）的表达呈现显著差异。同时发现,CaNAC36及5个关联基因启动子域含有大量的逆境相关顺式作用元件。【结论】结合基因克隆、基因表达水平分析以及生物信息学分析,表明CaNAC36是辣椒响应盐胁迫的重要转录因子,并可能与其他基因相互作用以提高植株的耐盐性,可为深度研究辣椒耐盐性以及选育耐盐品种提供数据支撑。     

桔小实蝇肽聚糖识别蛋白基因BdPGRP-SB1的克隆及功能鉴定

【目的】为探究肽聚糖识别蛋白(PGRP)基因BdPGRP-SB1在桔小实蝇Bactrocera dorsalis免疫中的作用。【方法】本研究利用PCR克隆桔小实蝇BdPGRP-SB1全长cDNA序列;利用生物信息学软件对该基因核苷酸序列及其编码的氨基酸序列特征进行分析。采用RT-qPCR分析BdPGRP-SB1在桔小实蝇不同发育阶段(卵、幼虫、蛹、成虫)及5日龄成虫不同组织(中肠、马氏管、后肠、脂肪体、卵巢和精巢)中的表达模式;对桔小实蝇5日龄雌成虫分别注射大肠杆菌Escherichia coli 0111:B4肽聚糖(PGN-EB)和金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus肽聚糖(PGN-SA)后检测BdPGRP-SB1表达水平变化。利用RNAi沉默BdPGRP-SB1的表达,测定大肠杆菌和金黄色葡萄球菌诱导后桔小实蝇雌成虫的死亡率及大肠杆菌诱导后抗菌肽(AMP)基因attacin-A, defensin和diptercin表达变化情况。【结果】克隆获得桔小实蝇BdPGRP-SB1的全长cDNA序列(GenBank登录号: MN892482),开放阅读框长558 bp,编码185个氨基酸,其编码蛋白预测分子量为21.45 kD,等电点为8.57。序列分析表明,BdPGRP-SB1无跨膜结构域,具有PGRP保守结构域,前端具有信号肽,为分泌型蛋白;具有Zn²⁺依赖性酰胺酶活性和DAP型肽聚糖识别位点。系统进化分析发现,BdPGRP-SB1与辣椒实蝇B. latifrons的PGRP-SB1亲缘关系最近,氨基酸序列一致性达96%。发育表达模式表明,BdPGRP-SB1在桔小实蝇3日龄幼虫和成虫期高表达;组织表达谱结果显示BdPGRP-SB1在5日龄成虫各组织中均有表达,在脂肪体内表达量最高。PGN-EB和PGN-SA均能诱导桔小实蝇雌成虫体内BdPGRP-SB1表达水平变化。通过RNAi抑制BdPGRP-SB1表达后,注射大肠杆菌导致桔小实蝇雌成虫死亡率显著升高,以及attacin-A, defensin和diptercin表达量显著上调。【结论】结果说明桔小实蝇BdPGRP-SB1参与识别革兰氏阴性细菌,并可能参与桔小实蝇Imd途径调控其免疫反应。     

草地贪夜蛾组织蛋白酶L的基因克隆、原核表达及多克隆抗体制备

【目的】克隆草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda的组织蛋白酶L(cathepsin L,CatL)基因,分析该基因的序列特征并制备该酶多克隆抗体,为探析其生理功能奠定基础。【方法】根据甜菜夜蛾Spodoptera exigua的组织蛋白酶L基因开放阅读框(ORF)序列两端直接设计引物克隆草地贪夜蛾组织蛋白酶L基因。利用生物信息学软件分析该基因的序列特征,利用ClustalX2软件进行同源比对和进化分析,利用同源建模预测该酶三维结构。通过原核表达重组蛋白,多次免疫新西兰大白兔制备该酶多克隆抗体。【结果】克隆获得了草地贪夜蛾的组织蛋白酶L基因SfCatL(GenBank登录号:HQ110065),ORF序列长1 035 bp,编码344个氨基酸,预测N-末端含有长度为16个氨基酸残基的信号肽序列,去除信号肽序列后,预测成熟蛋白分子量为36.8 kD,等电点为6.69。SfCatL氨基酸序列与其他13个物种的组织蛋白酶L氨基酸序列比较有53.7%~96.8%的一致性,与甜菜夜蛾组织蛋白酶L氨基酸序列一致性最高,达96.8%。同源建模预测表明,SfCatL折叠成紧密而稳定的元宝状结构,含3个对结构有稳定作用的二硫键,亲水性氨基酸主要包被在蛋白的表面。原核表达、纯化SfCatL蛋白制备抗血清,其效价超过1∶40 000,Western blot鉴定结果表明抗血清与草地贪夜蛾Sf9细胞SfCatL蛋白能够特异性结合。【结论】获得了草地贪夜蛾SfCatL完整ORF序列,分析了其特征,经原核表达、纯化获得高纯度的融合蛋白,成功获得多克隆抗体。本研究为进一步研究该基因的功能并开发组织蛋白酶抑制剂类杀虫剂提供理论依据。     

枣ZjMADS1-box基因克隆与表达分析

以‘金丝4号’枣花蕾和叶片为材料,通过抑制消减杂交文库(SSH文库)的构建、RACE技术和半定量RT-PCR等方法,克隆了枣花发育基因并研究了其时空表达模式,为枣花发育机理研究奠定基础。结果表明:(1)从枣花SSH文库中鉴定出476bp的花发育B类PISTILLATA(PI)基因的EST序列,命名为ZjMADS1-box;通过RACE技术获得了枣ZjMADS1-box基因的全长cDNA序列。(2)枣ZjMADS1-box基因表现出PI基因的序列结构特征。其全长cDNA长度为957bp,编码220个氨基酸残基;在氨基酸序列水平上,该基因与巨桉EgM2(Eu-calyptus grandis M2)和白千层MqPI(Melaleuca quinquenervia PI)的相似性最高为72.6%,与辣椒CaPI(Capsi-cum annuum PI)的相似性最低为61.8%;系统进化树分析显示,枣ZjMADS1-box与MqPI和EgM2基因聚在一起;枣ZjMADS1-box基因编码蛋白的等电点为9.75,分子量为25 587.5Da,属亲水性的非分泌性蛋白。(3)Zj-MADS1-box基因在花器官中特异表达,在嫩茎、成熟叶、腋芽等营养器官中不表达;在4月30日和5月8日花蕾中的表达量略高于5月4日、5月12日、5月16日的表达量,但差异不显著。     

基于同位素标记相对和绝对定量技术研究耐铬(VI)菌株CM01的蛋白定量组学

【背景】六价铬[Cr(VI)]作为一种高毒性的重金属污染物,用微生物学方法还原Cr(VI)既经济又环保。【目的】探究耐铬菌株CM01中与耐受或还原铬Cr(VI)有关的蛋白或基因,从分子水平上阐述其耐铬Cr(VI)机制。【方法】运用同位素标记相对和绝对定量技术(isobarictagsforrelativeand absolute quantitation techniques,iTRAQ)分析耐铬菌株CM01在有无铬Cr(VI)胁迫下的蛋白表达差异。运用RT-qPCR技术验证4种与代谢途径有关的上调蛋白的m RNA表达量。运用紫外分光光度计测定细胞表面疏水性。【结果】共鉴定到2 570个蛋白,其中存在显著差异的蛋白数为646个,上调蛋白数量343个,下调蛋白数量303个。CM01中的Fe/Mn超氧化物歧化酶、甜菜碱醛脱氢酶、磷酸戊糖途径、磷酸肌醇代谢途径、氨基酸代谢共同参与了菌株对于外源性Cr(VI)的响应机制。RT-qPCR实验结果表明,与代谢途径有关的4种蛋白其基因转录水平和蛋白水平一致。对照组CM01的细胞表面疏水性高于实验组。【结论】初步探索了耐铬菌的Cr(VI)响应机制,为利用微生物治理环境污染提供了理论支持和新的研究思路。     

马铃薯WOX基因家族的鉴定及在离体再生和非生物胁迫中的表达分析

【目的】WUSCHE-相关同源盒（WUSCHEL-related homeobox, WOX）基因家族是植物特有的转录因子家族,在植物生长发育、干细胞分化调控、逆境胁迫响应等过程中扮演重要角色。开展马铃薯WOX基因家族鉴定与功能研究,将为马铃薯遗传改良提供优良基因资源与理论依据。【方法】基于拟南芥、番茄、烟草和水稻WOX蛋白序列,利用HMMER 3.0和BLASTP鉴定马铃薯WOX基因家族成员,使用MCScanX软件分析WOX基因家族成员在马铃薯种内及种间的共线性,并采用邻接法构建系统发育进化树。利用ExPASy、GSDS等软件分析马铃薯WOX基因家族成员理化性质、基因结构、蛋白motif、启动子区域转录因子结合位点。基于PGSC数据库中马铃薯转录组数据,分析StWOXs在不同组织和非生物胁迫下的表达模式;以可能参与离体再生过程的StWOX5作为候选基因,利用实时荧光定量PCR技术分析该基因在具有不同离体再生能力的4个马铃薯品种（系）再生过程中的表达情况。【结果】鉴定得到11个马铃薯WOX基因家族成员,分布在5条染色体上,分为WUS、中间和古老共3个进化分支,不同分支中StWOXs基因...     

双管基因枪介导的基因瞬时表达技术在拟南芥中的应用

基因瞬时表达是植物中研究目标基因功能的常用手段。在模式植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)中,相比原生质体和农杆菌介导的基因异源表达技术,利用粒子轰击进行基因瞬时表达一直鲜有报道。其主要原因是拟南芥叶型相对较小、基因枪操作相对烦琐以及基因表达效率差异较大。该研究通过优化双管基因枪系统,在营养生长旺盛的拟南芥莲座叶中实现GFP和GUS基因高效表达。同时,通过GUS报告基因明确了坏死诱导因子BAX、Avh238和ATR13/Rpp13激发拟南芥细胞坏死的表型。但在本氏烟(Nicotianabenthamiana)中明显诱导细胞坏死的Avrblb1/RB基因对,在拟南芥中却丧失了诱导细胞坏死的活性。由于双管基因枪系统每次轰击时设置平行对照,可有效降低转化实验中的样本变异度,为拟南芥及其突变体研究中准确评价基因功能和高通量筛选目标基因提供新的技术参考。     

植物GH3基因家族的生物信息学分析

植物生长素在植物的生长发育过程中至关重要,GH3基因家族是植物生长素早期应答的成员。本研究采用比较基因组学的方法,利用已经分离的拟南芥GH3(Gretchen Hagen3)蛋白为检索序列,在全基因组水平上搜索拟南芥、水稻、葡萄、白杨和苜蓿的GH3基因的同源序列。最终确定了59个GH3候选基因,其中拟南芥19个,水稻14个,葡萄9个,白杨14个,苜蓿3个。对同源序列作进一步的多序列联配、MEME、ESTs和系统发生表达分析,结果表明:GH3基因家族的基本特征在单双子叶植物分离之前就已经形成;GH3结构域在蛋白质间较保守,可以分为3个亚家族,其中个别蛋白发生了基序丢失;59个同源蛋白中的40个成员找到了ESTs的证据,且表达部位多样,不同成员之间的表达部位存在差异。该研究结果将为植物的GH3基因家族的研究提供参考。