基于URA3基因快速构建表达载体及其在里氏木霉的应用

【背景】表达载体是基因工程必不可少的工具,对于真菌如里氏木霉(Trichoderma reesei)等,由于缺乏商品化的表达载体,使其基因工程蛋白表达既复杂又费时而难以开展。【目的】建立一种利用URA3序列快速构建表达载体的方法,解决真菌研究中难以简单、高效和快速构建表达载体的难题。【方法】基于URA3基因的序列,利用其启动子上游5′端序列和终止子下游3′端序列构建同源重组臂,通过同源重组臂定向同源重组到宿主基因组上,利用强启动子和终止子替换URA3基因,从而实现外源基因的表达。根据此方法构建pTRUC表达载体,将红色荧光蛋白基因mCherry克隆到该表达载体上,转化里氏木霉中并验证m Cherry的表达。【结果】阳性转化子在荧光显微镜下观察到强的红色荧光信号,在基因组PCR中检测到mCherry,Westernblotting结果表明红色荧光蛋白m Cherry能在里氏木霉中表达,以上结果说明该载体构建成功,使外源基因mCherry在里氏木霉中正确表达。【结论】基于URA3基因的快速构建表达载体及其构建方法切实可行,将成为推动真核表达系统表达异源蛋白的有力工具。