松材线虫伴生细菌多样性的宏基组分析

摘要：【目的】松材线虫是松材线虫病的病原,且与其伴生细菌之间存在互作关系,它们构成一个微生态系统。本研究旨在揭示松材线虫-伴生细菌群落细菌多样性。【方法】采用16S rRNA基因文库和454测序对伴生细菌群落的宏基因组进行初步分析。【结果】依据97％序列相似性划分OTU（Operational Taxonomic Unit）,构建的16S rRNA文库包含25个OTU,分别属于Alphaproteobacteria、Betaproteobacteria、Gammaproteobacteria和Bacter     

松材线虫伴生细菌多样性的宏基因组分析

【目的】松材线虫是松材线虫病的病原,且与其伴生细菌之间存在互作关系,它们构成一个微生态系统。本研究旨在揭示松材线虫-伴生细菌群落细菌多样性。【方法】采用16S rRNA基因文库和454测序对伴生细菌群落的宏基因组进行初步分析。【结果】依据97%序列相似性划分OTU(Operational Taxonomic Unit),构建的16S rRNA文库包含25个OTU,分别属于Alphaproteobacteria、Betaproteobacteria、Gammaproteobacteria和Bacteroidetes,其中优势菌群为Gammaproteobacteria,特别是Stenotrophomonas maltophilia为优势细菌。在伴生细菌优势种群上,454测序结果与16SrRNA基因文库结果基本一致。【结论】松材线虫的伴生细菌多样性较高,这些细菌可能对松材线虫具有一定的生态意义。     

秦皇岛新开河河口邻近海域细菌多样性及其影响因子

【目的】分析秦皇岛新开河河口及其邻近海域3个站位的细菌多样性,了解入海口污染对微生物多样性的影响,为该海域微生物的生态功能研究提供理论基础。【方法】于2014年8月选取秦皇岛新开河入海河口(XKH)及其邻近海域(W1,W2)共3个站位采集水样,采用荧光显微镜计数以及构建16S rRNA基因克隆文库的方法,分析细菌群落结构多样性与海水环境条件的关系。【结果】邻近海域W1站位的细菌总数(2.62×10~6 cells/m L)和多样性均高于新开河河口XKH站位(细菌总数:6.62×10~5 cells/m L)和W2站位(细菌总数:2.02×10~6 cells/m L);从XKH、W1、W2 3个站位的16S r RNA基因克隆文库中分别获得57、89、87条有效序列,按97%的序列相似性分别划分为46、51、56个OTU,分别属于Proteobacteria、Cyanobacteria、Bacteroidetes、Firmicute、Actinobacteria、Planctomycetes和Verrucomicrobia七个门。其中在XKH和W2站位中,Proteobacteria门的克隆子分别占总克隆数的50.9%和75.9%,是最优势的类群,分属于Alphaproteobacteria、Betaproteobacteria、Gammaproteobacteria、Deltaproteobacteria和Epsilonproteobacteria纲;在W1站位中,Cyanobacteria门的克隆子占总克隆数的38.2%,是该站位的最优势类群,这些优势类群可通过利用水体中的氮等营养来调节水体生态环境。影响细菌群落分布的环境因子主要为溶解氧、p H和氮营养盐。【结论】秦皇岛新开河河口及其邻近海域的细菌具有丰富的多样性,处于河口海域过渡带的水样具有更高的多样性,细菌群落多样性的分布受氮营养盐的影响更为显著。     

免培养法对大鲵肠道微生物多样性的研究

【目的】了解大鲵肠道内生细菌的组成及多样性。【方法】采用美国Mo Bio公司试剂盒提取大鲵肠道内容物总DNA,选用细菌通用引物799F和1492R对总DNA进行16S rRNA基因特异性扩增,构建大鲵肠道内容物内生细菌16S rRNA基因克隆文库,对阳性克隆进行限制性内切酶片段长度多态性(PCR-RFLP)分析,并对HaeⅢ酶切带谱不同的菌液进行测序,构建系统发育树。【结果】根据酶切带谱分析和测序结果的不同,将随机挑取的101个阳性克隆归为28个不同的可操作分类单元(OTUs),系统发育分析表明这些克隆序列分别属于变形菌门(Proteobacteria)、梭菌门(Clostridia)、芽孢杆菌门(Bacilli)和衣原体门(Chlamydiae)4个门。其中,变形菌门(Proteobacteria,占克隆总数的92.08%)为最优势类群。序列比对结果表明这些克隆序列分别与已报道的20个属具有较高的相似性。此外,还有一个OTU在系统发育树上形成独立分支且未能确定其分类。【结论】大鲵肠道内生细菌多样性丰富,并且可能存在新的分类单元。     

新疆断裂带含硫冷泉泉水细菌群落结构多样性

摘要：【目的】为了解新疆断裂带含硫冷泉泉水中细菌群落结构的组成和物种多样性。【方法】采用免培养法直接从冷泉水中提取环境总DNA,采用细菌通用引物对泉水中细菌的16S rRNA基因进行PCR扩增,构建16S rRNA基因克隆文库。使用限制性内切酶Hae Ⅲ对随机挑选的阳性克隆子进行限制性片段长度多态性分析(Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP),选出具有不同酶切图谱的序列进行测序、BLAST比对和构建16S rRNA基因系统发育树。【结果】共从细菌16S rRNA基因文库中筛选了228个阳性克隆,RFLP分型得到33个不同的操作分类单元 (Operational Taxonomic Unites, OTUs),覆盖度 (Coverage C) 为92%。BLAST比对、RDP归类及系统发育分析将这33个OTUs归为：变形菌门 (Proteobacteria)、拟杆菌门 (Bacteroidetes) 和厚壁菌门 (Firmicutes)。变形菌门为绝对优势类群,占整个细菌克隆文库的98%,,其中20%左右的类群与硫化物代谢相关的光合自养和化能自养类群纯培养菌具有高的相似性 (>97%)。此外,还发现大量类群 (总文库的64%,其中57%为军团菌属Legionella spp., 类群)与GenBank中已存细菌16S rRNA基因相似性小于96%。【结论】新疆断裂带含硫冷泉泉水中细菌类群的多样性较低,但可能存在大量潜在细菌新种和新分类。另外,该泉水可能是潜在的新军团菌病传播源,因而可能对下游人畜健康存在潜在威胁。     

新疆红井子盐碱土壤非培养放线菌多样性

【目的】研究新疆红井子盐碱土壤中的放线菌物种多样性。【方法】应用基于16S rRNA基因序列系统发育分析的免培养方法进行放线菌物种多样性分析。利用放线菌特异性引物,以土壤样品总DNA为模板,扩增16S rRNA基因,构建16S rRNA基因克隆文库,并对文库中的插入序列进行RFLP分析。【结果】随机挑选的246个阳性克隆通过酶切筛选出61个不同图谱的重组克隆并测序。分析结果显示这61个克隆序列分属于42个OTUs,分布于放线菌纲(Actinobacteria)的放线菌亚纲(Actinobacteridae)、酸微菌亚纲(Acidimicrobidae)和红色杆菌亚纲(Rubrobacteridae);该环境中有71.4%的序列与已有效发表菌株的序列相似性小于97%,代表着放线菌新类群,其中部分序列形成了几个独立的进化分支,可能代表更高级的新分类单元。【结论】红井子土壤中的放线菌组成具有丰富的多样性,并有新放线菌分类单位的潜在资源,值得进一步进行开发研究。     

西藏米拉山土壤古菌16S rRNA及amoA基因多样性?分析

摘要：【目的】硝化作用在全球土壤氮循环中具有重要的作用,虽然细菌一度被认为单独负责催化这个过程的限速步骤,但是最近一些研究结果表明泉古菌具有氨氧化的能力。本文通过构建古菌16S rRNA 基因克隆文库和氨氧化古菌amoA基因文库,分析西藏米拉山高寒草甸土壤中古菌及氨氧化古菌群落结构组成情况,为揭示青藏高原高寒草甸土壤古菌的多样性提供理论基础。【方法】采用未培养技术直接从土壤中提取微生物总DNA,分别利用通用引物构建古菌16S rRNA 基因和氨氧化古菌amoA基因克隆文库。【结果】通过构建系统发育树,表明古菌16S rRNA 基因克隆文库包括泉古菌门和未分类的古菌两大类,并且所有泉古菌均属于热变形菌纲。氨氧化古菌amoA基因克隆文库中序列均为泉古菌。通过DOTUR软件分析,古菌16S rRNA基因和古菌amoA基因克隆文库分别包括64个OTUs和 75个OTUs。【结论】西藏米拉山高寒草甸土壤中古菌多样性比较丰富,表明古菌在高寒草甸土壤的氮循环中可能具有重要的作用。所获得的一些序列与已知环境中土壤、淡水及海洋沉积物中获得的一些序列具有很高的相似性,其古菌及氨氧化古菌来自不同环境的可能性比较大,可能与青藏高原的地质历史变迁过程有关。米拉山古菌及氨氧化古菌与陆地设施土壤中相似性最高,说明与西藏米拉山高寒草甸土壤的退化有关。     

新疆沙湾冷泉沉积物中免培养古菌多样性初步研究

【目的】了解新疆沙湾冷泉沉积物的古菌组成及多样性。【方法】采用免培养法,液氮研磨提取冷泉沉积物总DNA,使用古菌通用引物进行16S rRNA基因扩增,构建16S rRNA基因文库。对阳性克隆进行HhaI限制性酶切分型,选出具有不同酶切图谱的序列进行测序,将所得序列与GenBank数据库中序列比对并构建16S rRNA基因系统发育树。【结果】从冷泉沉积物古菌16S rRNA基因文库中随机挑选了121个阳性克隆,共得到22个不同的可操作分类单元,BLAST结果表明全部克隆子归属于泉古菌门(Crenarchaeote)中免培养类群。系统发育分析归类为Soil-Freshwater-subsurface group和MarinegroupI,2个亚群并且各占整个文库的50%。其中40%左右的克隆子与具有无机碳和硝酸盐同化能力的泉古菌有高的相似性。此外还发现40%的克隆子与低温泉古菌类群具有很高的相似性。【结论】新疆沙湾冷泉沉积物中古菌类群多样性较低,但存有大量高度适应此低温、贫营养环境的泉古菌类群。     

五氯酚厌氧生物降解体系中细菌的多样性分析

为了解五氯酚(PCP)降解过程中参与PCP降解的微生物多样性,本文应用16S rRNA基因克隆文库方法对PCP厌氧生物降解体系中细菌群落的组成和相对丰度进行了研究.结果表明,TM7类群的微生物在整个细菌群落中占有最大丰度(48.6%),检测到的序列与在三氯乙烯污染的地下水中检测的克隆子有一定的序列相似性(93.6%).丰度位居第二的微生物类群为β-变形菌纲(Betaproteobacteria)细菌,其中的一些克隆子(10.8%)与脱氯微生物Dechlorosoma suillum具有极高的序列同缘性(99.7%).此外,也检测到少数Clostridium属[厚壁菌门(Firmicutes)类群]的微生物.克隆文库中发现许多序列(占整个克隆文库的51.3%)与GenBank中已报道的序列具有较远的同源性(小于93.4%),它们可能代表新的微生物.本研究进一步拓宽了对PCP降解微生物多样性的认识.     

胜利油藏不同时间细菌群落结构的比较

利用聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)和构建16S rRNA基因克隆文库2种方法,对孤岛油田两口井(注水井G和采油井L)在相距9个月的2个时间点(A和B)所采集样品的细菌群落结构进行了比较。DGGE图谱聚类分析表明注水井在2个时间点的微生物群落结构相似性为48.1%,而采油井的相似性只有28.7%。16S rRNA基因克隆文库结果表明,A时间点样品G中的优势菌群为Betaproteobacteria、Gammaproteobacteria,还有Deferribacteres、Firmicutes、Bacteroidetes等;而样品L中,Gammaproteobacteria中的Moraxellaceae含量达到97%。B时间点G中除了优势菌Betaproteobacteria之外,Deferribacteres的数量显著增加,成为优势菌;而L在B时间点优势菌除Gammaproteobacteria外,还有Betaproteobacteria和Firmicutes。采油井中的微生物群落结构随时间发生了显著改变,而注水井变化不显著。这一结果部分揭示了微生物采油过程中地层微生物群落的变化规律,有助于进一步阐明微生物驱油的机理。     

Bacterial diversity of water and sediment in the Changjiang estuary and coastal area of the East China Sea

The Changjiang estuary and the coastal area of the East China Sea (ECS) represent important interfaces of terrestrial and marine environments. This study included analyses of water and sediments collected during different seasons in these regions to determine the composition of microbial assemblages by means of 16S rRNA gene clone libraries. We retrieved 1946 sequences and 779 distinct operational taxonomic units from 36 clone libraries. Shannon–Weaver diversity index values and rarefaction analysis indicated that bacterial diversity in the sediment samples was much higher than in the water samples. Proteobacteria (72.9%) was the most abundant phylum, followed by Firmicutes (6.4%), Bacteroidetes (4.6%) and Actinobacteria (4.1%). In the water, clone sequences related to Alphaproteobacteria were the most abundant, whereas in the sediment samples, sequences affiliated with Gammaproteobacteria were predominant. Principal coordinate analysis showed that water samples collected from the Changjiang estuary and the ECS clustered separately. However, this spatial pattern could not be observed in sediment samples, which were mainly distinguished from one another by the season. Bacterial diversity in the Changjiang estuary was higher than that in the ECS, which may be the result of the mixing of bacterial communities from the Changjiang River, the estuary and the coastal ocean.     

三氯乙烷污染地地下水中Dehalobacter属细菌定量与多样性分析

[目的]对某公司6个以1,1,1-三氯乙烷(1,1,1-Trichloroethane,1,1,1-TCA)为主要污染物的地下水样品中的降解微生物Dehalobacter spp.(Dhb)进行相对定量和多样性分析.[方法]采用气相色谱法测定6个样品中1,1,1-TCA、1,1-二氯乙烷(1,1-DCA)和氯乙烷(CA)的浓度;通过定量PCR法分别测定6个样品中Dhb占总菌的百分比;以16S rRNA基因通用引物和Dhb特异性引物扩增获得的PCR产物构建了6个样品的Dhb特异性克隆文库,所得序列与GenBank中的最相似序列构建系统发育树.[结果]6个样品中均有1,1-DCA和(或)CA的检出,推测此6处地下水中1,1,1-TCA可能存在生物降解.定量PCR结果表明,6个样品中Dhb丰度差异较大.6个Dhb特异性克隆文库获得41条序列,序列比对结果表明,与它们最相似的已知分类地位的序列全部属于Dhb属.这些序列按99％的相似性被划分成7个可操作性分类单元(OTU).其中24条序列属于OTU1,该OTU的序列与已知能阵解1,1,1-TCA的Dehalobacter sp.str.TCA1的16S rRNA基因序列相似性达98％;文库中的3个OTU与GenBank中16S rRNA基因序列同源性最高仅为95％-96％.[结论]该污染场地地下水中存在多样性较丰富的降解微生物Dehalobacter属细菌,它们可能与现场的1,1,1-TCA生物降解有关.     

黄河三角洲滨海湿地非培养放线菌多样性

【目的】利用免培养技术对黄河三角洲滨海湿地土壤中放线菌多样性进行分析。【方法】提取样品总DNA, 利用放线菌门特异引物扩增放线菌16S rRNA基因序列, 构建放线菌16S rRNA基因克隆文库, 文库经RFLP分析后挑选代表序列测序并进行多样性指数分析和系统发育分析。【结果】构建的放线菌16S rRNA基因克隆文库覆盖率(C)为96.3%, 116个测序序列可化分为46个OTUs, 58.7%的OTUs (27个)存在于放线菌亚纲(Actinobacteridae)放线菌目(Actinomycetales)的7个亚目中, 分布于10个科中, 其中弗兰克氏菌亚目(Frankineae)最多, 共7个OTUs, 有30.4%的OTUs (14个)存在于酸微菌亚纲(Acidimicrobidae)醋微菌亚目(Acidimicrobineae)中, 没有发现与红色杆菌亚纲(Rubrobacteridae)和科里氏杆菌亚纲(Coriobacteridae)亲缘关系较近的序列。有10.9%的OTUs序列与有效发表的所有类群无亲缘关系, 在进化树上成为一个独立的进化分支, 有可能代表新亚目或更高级分类单元的类群。【结论】黄河三角洲滨海湿地蕴含着丰富的放线菌物种多样性及潜在的放线菌新类群, 具有深一步研究的价值。     

智利海洋沉积物中放线菌多样性

【目的】认识智利海洋沉积物中放线菌的多样性。【方法】分别采用选择性分离培养和非培养的基于16SrRNA基因序列系统发育分析方法,对来自智利南部海域海洋沉积物中放线菌多样性进行研究。采用6种选择性分离培养基分离放线菌;利用放线菌特异性引物对样品总DNA进行16SrRNA基因序列扩增并构建了16SrRNA基因克隆文库。分别挑选不同培养特征的22株放线菌和59个基因克隆进行16SrRNA基因序列的系统进化分析;测定分离的放线菌对海水的依赖性及产生抗菌活性化合物的能力。【结果】共分离到328株放线菌;挑选的22株放线菌分别属于小单孢菌属、多形孢菌属、链霉菌属、迪茨氏菌属、气微菌属和短状杆菌属;挑取的59个克隆属于40个分类单元,其中60%分类单元属于放线菌门放线菌亚纲、酸微菌亚纲和红色杆菌亚纲,另外40%的分类单元在放线菌内形成几个独立的进化分支,有可能代表放线菌新类群。22株放线菌有19株具有抗菌活性,50%的生长依赖海水的放线菌也具有抗菌活性。【结论】智利海域沉积物存在丰富的放线菌系统发育多样性并能产生活性次级代谢产物,而且还蕴藏丰富的新类型的放线菌资源。     

珠三角养殖水体中参与氮循环的微生物群落结构

【目的】为了研究珠三角地区养殖水体中各种含氮化合物循环转化的特征及其相关功能微生物的群落结构。【方法】构建人工模拟养殖系统,采用15N-稳定性同位素探测技术(stable isotope probing,15N-SIP)标记参与氮素迁移的微生物,通过氯化铯-溴化乙锭密度梯度超高速离心法分离15N标记的DNA,并以此构建含15N-DNA的细菌和古菌16S rRNA基因克隆文库。【结果】15N标记的基因组DNA经过超高速密度梯度离心后成功与14N-DNA分离;对克隆文库序列的分析表明:细菌文库得到的19个可操作分类单元(Operational TaxaUnits,OTUs)分别归为变形菌门(Proteobacteria)和浮霉菌门(Planctomycetes)。变形菌门为绝对优势类群,占整个细菌克隆文库的99.2%,其中优势菌群为丛毛胞菌属(Comamonas)(15.7%)、亚硝化单胞菌属(Nitrosomonas)(12.4%)、肠杆菌科(Enterobacteriaceae)(11.5%)和硝化杆菌属(Nitrobacter)(11.5%);古菌文库得到的9个OTUs归为奇古菌门(Thaumarchaeota)、泉古菌门(Crenarchaeota)和广古菌门(Euryarchaeota)。【结论】将15N-SIP技术应用于珠三角养殖水体氮素循环微生物群落结构的研究中,得到了丰富的氮素循环微生物群落的组成,这些信息为进一步分离纯化氮素降解微生物提供了重要的参考,为营造健康的水产养殖环境提供科学依据。     

硝尔库勒湖沉积物中非培养放线菌多样性

[目的]认识和了解盐湖沉积环境中放线菌的多样性,为今后的开发和利用奠定基础.[方法]应用免培养技术和基于16S rRNA基因序列的系统发育分析对新疆硝尔库勒盐湖沉积物中放线菌的多样性进行了研究.实验采用SDS-CTAB法提取土样中总DNA,利用放线菌特异性引物对土样总DNA进行16S rRNA基因扩增,并构建16S IRNA基因克隆文库;对随机挑选的160个克隆通过酶切筛选出51个不同图谱的重组克隆,并对其测序.[结果]所获得的51个克隆序列属于39个OTUs,其中52.9%的克隆序列分布于放线菌门(phylum Actinobacteria)放线菌亚(Actinobacteridae)的5个亚目和酸微菌亚纲(Acidimicrobidae)中,并且在这两个亚纲中有大量克隆序列属于放线菌的新类群,另外47.1%的克隆序列以极高的自展值在放线菌门内支持形成一个独立的大分支,极有可能代表一个新亚目或更高级分类单元的类群.[结论]这些研究结果说明硝尔库勒盐湖中存在有较为丰富的放线菌系统发育多样性,并且潜藏着新类型的放线菌资源.     

Bacterial diversity in rock varnish of extreme arid region of Turpan Basin

The bacterial community composition and diversity in rock varnish of Turpan Basin were investigated by restriction fragment length polymorphism (RFLP) and clone library of the 16S rRNA gene. 114 positive clones were screened, which could be grouped into 28 phylotypes and then further divided into 23 different operational taxonomic units (OTUs). These were affiliated into 5 phyla (Acidobacteria, Proteobacteria, Chloroflexi, Firmicutes and Cyanobacteria). Clones from actinobacteria were the dominant, accounting for 67.5% of total clones in the library, followed by Proteobacteria (15.8%), Chloroflexi (13.2%), Firmicutes (2.6%) and Cyanobacteria (0.9%). Rubrobacter (accounts for 35%) in the phylum Actinobacteria was the dominant genus and contained many species which might be resistant to gamma radiation. A 70% of the library clone sequences showed less 97% similarity to 16S rRNA gene sequences of standard strains obtained by pure culture. Shannon–Wiener index value of this study is 2.52 and is lower than deep-sea sediments, soils, lakes and other environments. Results of this study showed that bacterial diversity in rock varnishes of Turpan Basin was low, but maybe exist a large number of new unknown taxons, especially species that could well adapted to drought and resist radiation.     

淡水富营养型湖泊沉积物亚硝酸还原酶基因(nirS)的多样性和系统发育

【目的】以亚硝酸盐还原酶基因(nirS)为分子标记,探讨富营养化湖泊武汉东湖沉积物中NirS类反硝化细菌群落的多样性及系统发育,并分析环境因子对群落分布的影响。【方法】在武汉东湖4个典型子湖郭郑湖、汤菱湖、团湖和庙湖采集沉积物样品,测定环境参数;提取沉积物中微生物群落基因组DNA,分别构建4个子湖的反硝化微生物的nirS基因文库,利用限制性片段长度的多态性分析(Restriction Fragment LengthPolymorphism,RFLP)技术初步分群,确定各群的代表菌株并测定其nirS基因序列;利用DOTUR软件计算各群落多样性和丰富度指数,以Neighbor-Joining法构建供试菌与参比菌的系统发育树。【结果】环境参数测定结果表明东湖4个子湖中庙湖沉积物总氮(TN)和氨态氮(NH 4+-N)含量最高,团湖最低,郭郑湖沉积物中NO 3-浓度最高。基于NirS序列的生物多样性和丰富度分析表明团湖生物多样性和丰富度指数最高而庙湖各项指数均较低。各子湖供试序列及其代表序列综合RFLP聚类分析表明,武汉东湖沉积物中NirS类反硝化微生物种群具有丰富的多样性。NJ系统发育分析表明东湖沉积物NirS类反硝化菌群可分成3个较大群体(群I-III)。群I占总群体的67.7%,广泛分布于不同的生态环境;来自郭郑湖代表菌的81%分布于群I,而庙湖的代表菌中65%分布于群II。比较分析发现来自于东湖和人工湿地两种生境的NirS群落间具有较高的相似性。【结论】武汉东湖淡水富营养型湖泊沉积物中亚硝酸还原酶基因(nirS)具有丰富的多样性。东湖沉积物中TN、NH 4+和NO 3-的浓度可能是影响NirS类反硝化微生物多样性和空间分布的重要因素之一。