光滑球拟酵母中α-酮戊二酸脱氢酶系生理作用

摘要：【目的】研究α-酮戊二酸脱氢酶系在光滑球拟酵母碳代谢流、能量代谢和氨基酸代谢中的生理作用。【方法】通过敲除光滑球拟酵母中编码α-酮戊二酸脱氢酶系中E1酶的基因kgd1,构建α-酮戊二酸脱氢酶活性缺失菌株T. glabrata kgd1::kan,并考察KGDH缺失引起TCA循环关键酶活性,碳代谢流量以及胞内氨基酸和能荷水平等方面的变化。【结果】光滑球拟酵母中α-酮戊二酸脱氢酶活性的缺失导致：(1)细胞启动乙醛酸途径,通过形成TCA-乙醛酸循环实现TCA循环的正常代谢;(2)胞内NADH/NAD+水平     

营养条件对光滑球拟酵母积累α-酮戊二酸的影响

以光滑拟球酵母为研究模型,研究α-酮戊二酸的浓度情况。通过单因素实验得到α-酮戊二酸积累最佳浓度的各单因素条件为：葡萄糖浓度140g／L,NH4Cl浓度5g／L。在碳源（30g/L葡萄糖初始浓度）匮乏条件下加入丙酮酸30g／L,在此条件下丙酮酸转化为α－酮戊二酸的转化率最高达53．7％。以30g／L丙酮酸为唯一碳源时在7L发酵罐中光滑拟球酵母可生成浓度为10．7g/Lα-酮戊二酸,外源丙酮酸的转化率可达66．9％。这一结果表明,T．glabrata具有将丙酮酸转化为α-KG的能力。     

光滑球拟酵母中AMP代谢对其生理功能的影响北大核心CSCD

【目的】研究光滑球拟酵母(Candida glabrata)中AMP代谢影响其碳流代谢和耐酸胁迫的生理机制。【方法】同源重组法敲除基因cgade12(ORF CAGL0K05027g)和cgade13(ORF CAGL0B02794g)构建双缺菌株cgade12Δade13Δ,与出发菌株(ATCC55)比较ATP水平、碳流代谢酶活性和中间代谢物含量变化分析和AMP代谢对其碳流代谢的影响,对比菌株有机酸胁迫下生长情况及胞内环境变化,研究AMP代谢变化对光滑球拟酵母酸胁迫耐受性的影响。【结果】与出发菌株ATCC55相比,cgade12Δade13Δ的ATP水平下降了12.50%。与ATCC55相比,cgade12Δade13Δ中柠檬酸合成酶、苹果酸脱氢酶、异柠檬酸脱氢酶、α-酮戊二酸脱氢酶的活性分别上升了31.26%、19.45%、28.96%、18.36%,柠檬酸、α-酮戊二酸、苹果酸、琥珀酸含量分别提高了44.11%、73.60%、50.00%、65.68%。胞内丙酮酸浓度下降20.00%,丙酮酸产量下降73.11%。与ATCC55相比,cgade12Δade13Δ在0.4%丙酮酸、0.6%苹果酸和0.2%乙酸胁迫下的菌体浓度分别提高了8.71%、11.21%和12.71%。在0.2%乙酸胁迫下,菌株cgade12Δade13Δ的H^+-ATPase活性、细胞膜完整度、细胞膜电势分别比出发菌株ATCC55上升了7.04%、8.71%、25.14%,ROS水平下降了19.51%。【结论】基因cgade12、cgade13的缺失导致菌株的ATP水平下降,TCA循环活性和有机酸耐受性上升。     

提高光滑球拟酵母乙酰辅酶A水平促进α－酮戊二酸合成

[目的]为了了解光滑球拟酵母中乙酰辅酶A含量对其碳代谢及其通量的影响.[方法]将来源于酿酒酵母中编码乙酰辅酶A合成酶ACS2基因过量表达于发酵法生产丙酮酸的生产菌株Torulopsis glabrata中,获得了一株乙酰辅酶A合成酶活性提高9.2倍(1.20 U/mg protein)的重组菌T. glabrataACS2-1.[结果]与出发菌株WSH-IP303相比,重组菌T glabrataACS2-1:(1)能以乙酸为唯一碳源在胞内积累0.94 mmol/(L·g DCW)的L酰辅酶A;(2)以葡萄糖为唯一碳源时胞内乙酰辅A浓度、α-酮戊二酸产量和Cα-KG,Cpyr是出发菌株WSH-IP303的3.22、2.05和2.52倍;(3)在葡萄糖培养基中添加4 g/L 乙酸,使乙酰辅酶A浓度、α-酮戊二酸产量和CαKG>>/Cpyr是出发菌株WSH-IP303的4.55、2.47和3.75倍,α-酮戊二酸浓度达到17.8 g/L.[结论]这一结果表明,改变细胞内关键辅因子的浓度能使碳代谢流的流向与通量发生改变,从积累丙酮酸转向过量积累α-酮戊二酸.     

微生物发酵生产α-酮戊二酸研究进展

α-酮戊二酸是微生物三羧酸循环中重要的代谢中间产物,是连接细胞内碳-氮代谢的关键节点,具有广泛的应用价值.文中从4个方面归纳了国内外关于α-酮戊二酸研究进展:能够过量积累α-酮戊二酸的原核和真核微生物的发现和筛选;硫胺素缺陷型和氮源饥饿引起的α-酮戊二酸过量积累的生理学特性;控制培养环境中的pH、溶氧和辅因子对生产α-酮戊二酸发酵过程控制与优化;调控辅因子再生和代谢途径改造高产菌株.最后,讨论了微生物法生产α-酮戊二酸存在的不足和今后研究的方向.     

过程优化提高解脂亚洛酵母积累α-酮戊二酸

目前,应用解脂亚洛酵母发酵生产α-酮戊二酸由于产量和底物转化率低、生产周期长等问题,仍未大规模工业化生产。为了解决这些问题,以研究室诱变选育获得的1株高产α-酮戊二酸的解脂亚洛酵母Yarrowia lipolytica WSH-Z06 C3为出发菌株,考察了该菌株在50 L发酵罐中转速、碳酸钙浓度、溶氧以及补料方式(多节点补料、恒速补料)等因素对α-酮戊二酸积累的影响。结果表明,当转速为300 r/min时,α-酮戊二酸和丙酮酸的产量分别为32.4 g/L和19.66 g/L;碳酸钙质量浓度为20 g/L时,α-酮戊二酸的产量提高至38.55 g/L,丙酮酸降低至8.28 g/L;控制溶氧水平在50%时,α-酮戊二酸产量为42.39 g/L,此时丙酮酸为6.22 g/L。比较高初始甘油浓度和不同的补料发酵策略,发现恒速补料效果最好,发酵144 hα-酮戊二酸产量达到66.27 g/L,丙酮酸产量为20.82 g/L。通过上述发酵过程参数的优化,α-酮戊二酸的产量和底物的转化率比未优化前分别提高了67.3%和4.56%,为解脂亚洛酵母工业化生产α-酮戊二酸提供一定参考。     

过氧化物酶体膜对各种光呼吸代谢物的透性和Percoll对其完整性的影响

利用氧极谱法测定依赖乙醇酸和乙醛酸的氧吸收,利用分光光度计测定转氨酶活性的方法,检查了光呼吸碳代谢中各种中间产物对过氧化物酶体膜的透性,结果表明,O2,乙醇酸,乙醛酸,丝氨酸,天冬氨酸,草酰乙酸,α－酮戊二酸能透过过氧体膜,过氧体膜可能有谷氨酸和NADH进入的屏障,过氧体悬浮液Percoll存在,很快使过氧体膜破坏,Percoll也使羟基丙酮酸还原酶和苹果酸脱氢酶的活性很快降低。     

过氧化物酶体膜对各种光呼吸代谢物的透性和Percoll对其完整性的影响

利用氧极谱法测定依赖乙醇酸和乙醛酸的氧吸收,利用分光光度计测定转氨酶活性的方法,检查了光呼吸碳代谢中各种中间产物对过氧化物酶体膜的透性,结果表明,O2,乙醇酸,乙醛酸,丝氨酸,天冬氨酸,草酰乙酸,α－酮戊二酸能透过过氧体膜,过氧体膜可能有谷氨酸和NADH进入的屏障,过氧体悬浮液Percoll存在,很快使过氧体膜破坏,Percoll也使羟基丙酮酸还原酶和苹果酸脱氢酶的活性很快降低。     

碳酸钙促进丙酮酸发酵过程中α-酮戊二酸的形成

在多重维生素营养缺陷型菌株光滑球拟酵母CCTCC M202019发酵生产丙酮酸的摇瓶和发酵罐实验中发现,CaCO₃的添加对发酵液中α-酮戊二酸（α-KG）的积累有重要影响。在维生素浓度不变且供氧充分的前提下,延迟CaCO₃添加时间可明显抑制α-KG的产生,并提高丙酮酸与α-KG的碳摩尔比(C_PYR/C_αKG);而增加培养基中的CaCO₃浓度会导致αKG积累的增加。用不同物质调节发酵液中pH的实验证实：在丙酮酸发酵过程中, Ca²⁺对αKG的积累起主要作用,CO₃^2-起辅助作用,两者对α-KG的积累具有协同效应。维持培养基中CaCO₃浓度不变,改变培养基中硫胺素的浓度,对αKG的积累,特别是对C_PYR/C_α-KG值没有影响;而增加培养基中生物素的浓度,则导致αKG的浓度不断上升且C_PYR/C_α-KG值不断下降。当有Ca2+存在时,胞内丙酮酸羧化酶的活性最高可提高40%,而丙酮酸脱氢酶系的活性没有明显变化。结果表明,丙酮酸发酵过程中α-KG的形成是由于CaCO₃促进了丙酮酸羧化反应,其中Ca²⁺可显著提高丙酮酸羧化酶的活性,而CO₃^2-则有可能作为丙酮酸羧化反应的底物。     

硫胺素及溶氧对解脂亚洛酵母联产酮酸的影响

α-酮戊二酸和丙酮酸是重要的酮酸,广泛应用于食品、医药等领域。以本研究室在前期的工作中诱变选育的Yarrowia lipolytica WSH-Z06 C3为出发菌株,高效联产α-酮戊二酸和丙酮酸。在摇瓶水平上初步确定了最佳氮源浓度以及接种密度。在此基础上,重点考察了在15 L发酵罐上硫胺素浓度以及溶氧控制参数对酮酸联产的影响。结果显示,硫胺素最佳浓度为0.2μg/L,α-酮戊二酸和丙酮酸分别高达24.5、53.7 g/L。与未优化的对照相比,酮酸总产量和丙酮酸总转化率均提高了57.9%。溶氧水平控制在50%,发酵96 h酮酸总产量高达53.2 g/L。通过两阶段溶氧调控,酮酸总产量高达64.7 g/L,比未调控前提高了21.2%。通过硫胺素与溶氧水平的优化,显著提高了酮酸的产量,进一步为酮酸的工业化生产提供参考。     

TCA循环中间产物对酿酒酵母胞内代谢关键酶活性的影响

对酿酒酵母在添加苹果酸、柠檬酸和琥珀酸的混合培养基与其在YEPD培养基中胞内丙酮酸激酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、异柠檬酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶、乙醇脱氢酶的酶活力差异进行了对比分析。结果表明:添加苹果酸使胞内丙酮酸激酶、异柠檬酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶、乙醇脱氢酶的酶活分别下降34.82%、57.23%、39.15%、12.10%;添加柠檬酸使胞内丙酮酸激酶、异柠檬酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶的酶活分别下降50.17%、42.20%、48.40%;添加琥珀酸使胞内丙酮酸激酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、异柠檬酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶、乙醇脱氢酶的酶活分别下降34.16%、34.16%、50.87%、50.87%、12.37%。丙酮酸激酶、异柠檬酸脱氢酶和苹果酸脱氢酶对3种有机酸的耐受性较差,葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、乙醇脱氢酶对3种有机酸的耐受具有选择性。     

桥联黄素再生NAD+耦联L-谷氨酸脱氢酶高效产α-酮戊二酸

在L-谷氨酸脱氢酶(EC 1.4.1.3,L-GluDH)催化L-谷氨酸氧化脱氨过程中涉及昂贵的氧化型烟酰胺辅因子NAD+,因此需要构建其再生体系以降低成本.通过构建桥联黄素(F4)耦联L-谷氨酸脱氢酶催化L-谷氨酸生产α-酮戊二酸(α-KG)的新型均相体系,桥联黄素能高效氧化天然还原型烟酰胺辅因子NADH至其氧化态N...     

NAD~+对小麦叶片线粒体甘氨酸氧化和三羧酸代谢的调节

外源NAD~+对小麦叶片线粒体内甘氨酸、苹果酸及α—酮戊二酸氧化都有促进作用。当几种呼吸底物同时存在时,其中甘氨酸的氧化抑制了其他底物的同时氧化,因为催化这两类废物氧化的酶对NAD~+的亲和力和对NADH/NAD~+比值的敏感程度有差异,催化甘氨酸氧化的甘氨酸脱羧酶对线粒体基质内可利用的NAD~+的亲和力分别比苹果酸脱氢酶和α—酮戊二酸脱氢酶的亲和力大约1或2倍。另外,甘氨酸亦可通过保持线粒体基质内高NADH/NAD~+比值来影响三羧酸环的正常代谢。     

过量表达NADH氧化酶加速光滑球拟酵母合成丙酮酸

[目的]进一步提高光滑球拟酵母(Torulopsis glabrata)发酵生产丙酮酸的生产强度.[方法]将来源于乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)中编码形成水的NADH氧化酶noxE基因过量表达于丙酮酸工业生产菌株T. glabrata CCTCC M202019中,获得了一株NADH氧化酶活性为34.8 U/mg蛋白的重组菌T. glabrata-PDnoxE.[结果]与出发菌株T. glabrata CCTCC M202019相比,细胞浓度、葡萄糖消耗速率和丙酮酸生产强度分别提高了168%、44.9%和12%,发酵进行到36 h葡萄糖消耗完毕.补加50 g/L葡萄糖继续发酵20 h,则使丙酮酸浓度提高到67.2 g/L.葡萄糖消耗速度和丙酮酸生产强度增加的原因在于形成水的NADH氧化酶过量表达,导致NADH和ATP含量分别降低了18.1%和15.8%.而NAD<' 增加了11.1%.[结论]增加细胞内NAD<' 含量能有效地提高酵母细胞葡萄糖的代谢速度及目标代谢产物的生产强度.     

施氏假单胞菌氮代谢调控蛋白GlnK与碳信号分子α-酮戊二酸的体外互作研究

细菌中PⅡ蛋白是一类氮代谢调控因子,可通过感知胞内碳氮信号变化调整自身与靶蛋白的相互作用,从而实现对下游基因的级联调控。α-酮戊二酸是胞内碳状态的重要信号分子,前期研究发现PⅡ蛋白可结合α-酮戊二酸感应细胞内的碳状态,但不同菌中二者的结合存在差异。施氏假单胞菌A1501（Pseudomononas stutzeri A1501）只含有1种PⅡ蛋白GlnK,其在A1501固氮调控中发挥重要作用,但具体碳信号感知与转导机制有待进一步探索。基于此,通过大肠杆菌外源表达GlnK蛋白,并通过微量热泳动（microscale thermophoresis,MST）方法研究GlnK蛋白与碳信号分子α-酮戊二酸的体外互作,发现二者可以体外结合,且进一步证实GlnK蛋白的第89位甘氨酸（G89,Gly89）可能与互作相关。研究结果为进一步解析α-酮戊二酸在A1501中的信号转导奠定了基础,也为深入解析固氮菌的碳氮代谢偶联机制提供了理论支持。     

解脂耶氏酵母诱变育种及发酵产α-酮戊二酸条件优化

对具有发酵产α-酮戊二酸能力的解脂耶氏酵母(Yarrowia Lipolytica)ZY-4进行了紫外诱变和NTG诱变育种,筛选得到产量提高的突变株,并对突变株的发酵培养基进行了优化,结果表明,紫外诱变和NTG诱变后筛选到的突变株分别比原始出发菌株产量提高了67.8%和110%。优化后发酵培养基成分为甘油8%,氯化铵5.0 g/L,硫胺素1.0μg/L,磷酸二氢钾1.0 g/L,七水硫酸镁0.5 g/L,培养基优化后α-酮戊二酸产量比原始出发菌株提高了232.4%。     

一些氨基酸对产甘油假丝酵母甘油生产的促进作用

以EMP途径与TCA循环中间代谢物的添加为对照,研究在尿素为氮源的产甘油假丝酵母发酵过程中添加氨基酸对甘油产量的影响。结果表明:对甘油产量有强促进作用的氨基酸有谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、甘氨酸、赖氨酸、酪氨酸、脯氨酸、组氨酸和丝氨酸,其最适添加浓度在0.26～0.45g/L之间,丙酮酸、α_酮戊二酸、草酰乙酸、柠檬酸和琥珀酸的最适添加浓度在0.24～0.42g/L之间;赖氨酸最适于在0h添加,丙酮酸和草酰乙酸在第14h,谷氨酸、谷氨酰胺、组氨酸、脯氨酸、天冬氨酸、酪氨酸、甘氨酸、α_酮戊二酸和琥珀酸在第30h,天冬酰胺、丝氨酸和柠檬酸在第48h;在最适条件下添加这些促进剂,甘油产量均呈显著增加趋势,转化率和增加率分别达到60%和16%以上。氨基酸的作用机理为其脱氨形成的碳骨架经特定的分解代谢途径进入TCA循环,使其强化,导致碳代谢流在3_磷酸甘油醛节点处发生转移,使甘油合成途径的代谢流增加。     

酿酒酵母对数生长后期代谢重构的全基因组表达谱芯片分析

为了探讨酵母进入对数生长后期以后酒精生产速度降低的原因,我们利用酵母表达谱芯片技术对酿酒酵母细胞从对数生长中期进入对数生长后期时的全基因组表达谱进行了分析,发现酵母在对数生长中期的表达谱非常稳定,而一旦进入对数生长后期.则出现明显的代谢重构现象.许多氨基酸合成和代谢相关的基因、离子转移以及与能量的生成和储存等功能相关的基因出现了不同程度的上调;而许多涉及酵母转座和DNA重组的基因则表达下调;一些中心代谢途径也发生了代谢重构.包括:琥珀酸和α-酮戊二酸生成途径基因的一致上调,都与氨基酸合成和代谢相关基因表达的结果相吻合.结果表明:由于氨基酸合成的需求量增加,进入对数生长后期酵母的代谢转向TCA循环和乙醛酸循环,导致酒精的生产速率降低.     

提高光滑球拟酵母乙酰辅酶A水平促进a-酮戊二酸合成

【目的】为了了解光滑球拟酵母中乙酰辅酶A含量对其碳代谢及其通量的影响。【方法】将来源于酿酒酵母中编码乙酰辅酶A合成酶ACS2基因过量表达于发酵法生产丙酮酸的生产菌株Torulopsis glabrata中,获得了一株乙酰辅酶A合成酶活性提高9.2倍(1.20 U/mg protein)的重组菌T. glabrata ACS2-1。【结果】与出发菌株WSH-IP303相比,重组菌T. glabrata ACS2-1：(1)能以乙酸为唯一碳源在胞内积累0.94 mmol/(L·g DCW)的乙酰辅酶A;(2)以葡萄糖为唯一碳源时胞内乙酰辅酶A浓度、a-酮戊二酸产量和Ca-KG/Cpyr是出发菌株WSH-IP303 的3.22、2.05和2.52倍;(3)在葡萄糖培养基中添加4 g/L乙酸,使乙酰辅酶A浓度、a-酮戊二酸产量和Ca-KG/Cpyr是出发菌株WSH-IP303的4.55、2.47和3.75倍,a-酮戊二酸浓度达到17.8 g/L。【结论】这一结果表明,改变细胞内关键辅因子的浓度能使碳代谢流的流向与通量发生改变,从积累丙酮酸转向过量积累a-酮戊二酸。     

异源表达NADH选择性氧化酶提高光滑球拟酵母酵解速率及丙酮酸生产强度

摘要：【目的】为进一步提高光滑球拟酵母(Torulopsis glabrata)葡萄糖代谢速率及丙酮酸生产强度。【方法】将源于荚膜胞浆菌(Histoplasma capsulatum)的编码选择性氧化酶的AOX1基因过量表达于T. glabrata中,获得了一株线粒体内NADH氧化途径发生改变且胞内总NADH 氧化酶活性提高1.8倍的重组菌株AOX。【结果】与出发菌株CON比较,细胞浓度以及发酵周期降低了20.3%和10.7%,而平均比葡萄糖消耗速率和丙酮酸合成速率分别提高了34.7%和54.1%。其原因