呼吸道合孢病毒在类淋巴传代细胞内繁殖的形态学研究

将从上海市婴幼儿下呼吸道疾病患者中分离到的呼吸道合胞病毒(RSV),接种在国內“建株”的类淋巴传代细胞(SL)上,证实该株细胞对RSV敏感,病毒在细胞内繁殖可迅速形成广泛典型的融合细胞病变,特征明显,易于观察。但对RSV在SL细胞内繁殖所致的细胞病变情     

浙江地区呼吸道合胞病毒G基因分子特征分析

收集2004年冬季浙江省儿童医院呼吸道感染患儿的鼻咽吸引物,进行呼吸道合胞病毒(RSV)分离,对分离株用特异性RT-PCR鉴定;对鉴定阳性的RSV毒株进行G蛋白全基因序列测定,并与RSV国际标准株及各地参考株的G蛋白基因序列进行同源性比较并构建基因进化树。结果表明,在4株RSV浙江分离株中,3株G蛋白基因ORF全长897bp,另1株为894bp;各分离株之间的核苷酸与氨基酸同源性分别为98.05%、97.06%;与A型RSV标准株的核酸同源性为95.69%,与B型RSV标准株的同源性为78.79%;其3’端基因高变区核苷酸序列与RSVGA2亚型的同源性最高。提示2004年冬季浙江省RSV流行株属于RSVGA2亚型。     

浙江地区呼吸道合胞病毒G基因分子特征分析

收集2004年冬季浙江省儿童医院呼吸道感染患儿的鼻咽吸引物,进行呼吸道合胞病毒(RSV)分离,对分离株用特异性RT-PCR鉴定;对鉴定阳性的RSV毒株进行G蛋白全基因序列测定,并与RSV国际标准株及各地参考株的G蛋白基因序列进行同源性比较并构建基因进化树.结果表明,在4株RSV浙江分离株中,3株G蛋白基因ORF全长897bp,另1株为894bp;各分离株之间的核苷酸与氨基酸同源性分别为98.05%、97.06%;与A型RSV标准株的核酸同源性为95.69%,与B型RSV标准株的同源性为78.79%;其3'端基因高变区核苷酸序列与RSV GA2亚型的同源性最高.提示2004年冬季浙江省RSV流行株属于RSV GA2亚型.     

急性下呼吸道感染患儿中RSV的分离鉴定及分析

目的对2015年兰州单中心急性下呼吸道感染患儿中呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)进行分离鉴定及分析。方法收集临床急性下呼吸道感染患儿痰分泌物226份,在HEP-2细胞中连续盲传培养3代,收获的培养物用半巢式RT-PCR进行检测,选取强阳性样品进行测序以确定其型别,并对其流行病学特征进行分析。结果 226份样品中RSV阳性样本为76份(阳性率为34%)。RSV阳性患儿中,男女性别比为3∶1;年龄分布6月龄患儿占45%,6月龄~2岁占35%,2~5岁的占20%。冬季为发病高峰。76例RSV阳性患儿中,临床诊断依次为毛细支气管炎31例(40.79%)、喘息性支气管炎21例(27.36%)、支气管肺炎20例(26.32%)和支气管哮喘4例(5.26%)。40份强阳性RSV样品经测序确定为B亚型。结论 RSV是引起婴幼儿急性下呼吸道感染的重要病原之一,2015年RSV的流行株主要为B亚型。     

西藏地区儿童急性呼吸道感染中呼吸道合胞病毒的初步研究

本研究为了解西藏地区儿童急性呼吸道感染中呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus,RSV)及基因型别。首先采用直接免疫荧光法检测2011年4～7月西藏自治区人民医院儿科病房因急性呼吸道感染住院患儿的鼻咽分泌物标本中7种常见的呼吸道病毒及人类偏肺病毒(Human metapneumovirus,hMPV)的抗原。然后对RSV抗原阳性的标本分别提取RNA,用逆转录-巢式聚合酶链反应法(Nest-PCR)确定RSV型别,同时用实时荧光PCR(Real-Time PCR)方法进行验证。再通过对G蛋白基因PCR扩增产物序列测定确定RSV的基因型。通过与GenBank中不同地区RSV分离株的G蛋白基因序列比对,了解西藏地区RSV G蛋白的结构特点及变异情况。结果表明,从167例标本中检测出呼吸道病毒抗原阳性的为65例,总阳性率为38.9%(65/167),其中RSV 45例,占阳性标本的69.2%(45/65),对其中42例RSV阳性标本进行了PCR分型,其中40例为A亚型,2例为B亚型。对7株A亚型RSV G蛋白基因PCR产物测序结果显示,全部为GA2基因型。西藏RSV与RSV原型株A2株核苷酸的同源性为90.7%～91.8%,氨基酸的同源性只有86.5%～87.2%。氨基酸的变异主要集中在胞外区一个高度保守序列的两端。7株西藏A亚型RSV G蛋白的核苷酸序列与GenBank中不同的RSV分离株相比同源性为90.7%～91.8%。西藏地区2011年春季小儿急性呼吸道感染的病毒病原主要为呼吸道合胞病毒,A亚型是2011年西藏地区的流行优势型别,其G蛋白胞外区基因具有较高的变异性。     

呼吸道合胞病毒Long株的培养及应用

建立可稳定收获高滴度RSVLong株病毒的培养方法 ,所获得的RSVLong株病毒液用于RSV抗体ELISA检测。RSVLong株病毒 33℃传至 4代后 ,病毒滴度升高 ,出现典型的细胞病变。以RSVLong株病毒液作抗原所建立的ELISA试剂盒能检测出RSV特异性抗体。     

呼吸道合胞病毒B亚型分离株的G蛋白基因分析

对一株长春地区B亚型分离株(CC169)的G蛋白基因进行了 序列分析,结果表明：我国呼吸道合胞病毒(RSV)分离株CC169同RSV B亚型原型株CH18537的 核苷酸同源性为94%,核苷酸的有义突变率达65%。由核苷酸推导出氨基酸序列的同源性为894%,氨基酸的变异全部发生在胞外区,并主要集中在一个高度保守区的两端,胞内区和跨 膜区保守不变。氨基酸的变异导致了分离株既有糖基化位点的改变,又有蛋白长度的变异。 此外还初步探讨了我国RSV B 亚型分离株CC169的G蛋白基因同原型株之间的变异与疫苗研制 中的意义。     

呼吸道合胞病毒感染不同气道上皮细胞的病变特点及易感性分析

为了比较几种不同气道上皮细胞对呼吸道合胞病毒（Respiratory syncytial virus,RSV）感染后病变特点及易感性。采用RSV A2株感染Hep-2、A549、16HBE、BEAS-2B细胞后,奥林巴斯倒置免疫荧光显微镜观察细胞病变效应,免疫荧光检测RSV N蛋白表达及空斑实验测定细胞培养上清液中病毒滴度。结果显示RSV A2株感染Hep-2细胞后最早形成典型的合胞病变,A549细胞次之,16HBE及BEAS-2B形成病变的时间最晚。免疫荧光检测到RSV N蛋白表达特点与细胞病变特点一致。RSV A2在Hep-2上产生的病毒滴度最高,A549细胞次之,在16HBE上产生的病毒滴度最低。提示Hep-2、A549细胞对RSV具有高度易感性,以Hep-2最为敏感。而16HBE、BEAS-2B细胞对RSV感染不敏感,其中16HBE最不敏感。本研究可为选择合适的上皮细胞进行RSV相关研究奠定基础。     

1987、1988年春南京地区婴幼儿呼吸道病毒感染病原研究

1987、1988年春南京地区婴幼儿呼吸道病毒感染明显增多,出现两次流行高峰,患儿90％在6个月龄内,3月龄内占65％,临床主要表现为细支气管炎、肺炎。本报告是从门诊及住院117名患儿采集咽分泌物及血液标本,分别进行病毒分离及间接免疫酶组化染色检查,确定两次流行均主要由呼吸道合胞病毒(RSV)感染所致。117份咽分泌物标本,接种Hep—2细胞共分离出29株病毒(阳性率24.8％)。经中和试验鉴定为呼吸道合胞病毒24株(82.8％),3型腺病毒4株(13.8％),腮腺炎病毒1株(3.4％)。29株病毒中25株于接种标本后12天内即出现明显的特征性细胞病变(CPE),最短的仅4天。117例患儿血清标本,酶染色阳性为32侧(阳性率27.4％),与病毒分离比较,两者均阳性者22例,均阴性者83例,符合率89.7％,病毒分离阳性,酶染色阴性者2例(均为发病后第二天入院抽血患儿)。酶染色阳性,病毒分离阴性者10例,表明酶染色法敏感性明显高于病毒分离。     

三叶青对呼吸道合胞病毒作用实验研究

为探讨三叶青在抗病毒中的作用,本文选取三叶青乙醇提取物正丁醇萃取部分和乙酸乙酯萃取部分,采用细胞病变抑制实验,以治疗指数(TI)为研究指标,研究各溶剂萃取部位、柱分离部分在MA104细胞中对呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)的抑制作用,从而筛选出三叶青抗RSV有效部位,分离活性成分。三叶青乙醇提取物正丁醇萃取部分和乙酸乙酯萃取部分的TI值分别为128和64,相对于阳性对照药利巴韦林(TI值为6.25)。说明三叶青乙醇提取物正丁醇萃取部分和乙酸乙酯萃取部分具有抗RSV的活性且明显优于利巴韦林。     

新的人轮状病毒株的分离

<正>人轮状病毒在任何培养系统中繁殖是很困难的。1980年Whyatt等经过在悉生小猪传代几次后获得了适应组织培育生长的人轮状病毒“Wa”株。1981年Sato和Urasawa等在细胞维持液中加入胰酶并使用旋转培养,直接从人粪便中分离到轮状病毒。1983年Birch等报导采用胰酶预处理粪样提取液,维持液中加入胰酶的旋转培养。成功地在HA—104和CV—1细胞上适应几株人轮状病毒。     

人呼吸道合胞病毒M蛋白非复制型重组腺病毒的构建和鉴定

人呼吸道合胞病毒（human respiratory syncytial virus, RSV)基质蛋白（matrix protein,M）在RSV形态发生上具有重要作用,因含有CTL抗原表位,在疫苗研究上具有一定意义。为此,应用RT-PCR 方法从感染RSV的HEp-2 细胞中扩增获得M蛋白基因,构建了含M基因的非复制型重组腺病毒并进行表达和鉴定。基因序列分析显示RSV M基因仅有一处碱基发生错义突变。非复制型重组腺病毒DNA分子FGAd/RSVM转染293细胞,观察到细胞出现CPE,RT-PCR发现M基因有转录,Western blotting及间接免疫荧光分析检测到M蛋白。成功克隆A亚型RSV Long株M基因,并获得一株可表达A亚型RSV M蛋白的非复制型重组腺病毒FGAd/RSVM,可用于体内研究观察其免疫效果及免疫保护作用。     

简讯

提高婴幼儿肺炎合胞病毒分离阳性率的因素1981年1—3月南昌地区婴幼儿喘憋性肺炎发病高峰期间,从54份住院患儿的咽拭子标本中,分离到合胞病毒45株,阳性率为83.3%。分离采用Hela传代细胞Bristol株的细胞管。营养液含199培养基2/3,0.5%水解乳蛋白Hank's液1/3,另加10%小牛血清和10%抗生素溶液(每毫升含青霉素1万单位,链霉素1     

稳定表达呼吸道合胞病毒非结构蛋白NS1细胞的构建及其生物特性研究

获得稳定表达RSV病毒NS1基因的HEp-2-NS1细胞株并对其生物学特性进行初步研究。采用RT-PCR方法从RSV病毒中获得NS1全长基因,克隆到逆转录病毒载体pBABE-puro中,重组载体与包装质粒PIK通过磷酸钙共沉淀法转染包装细胞293FT细胞,产生的逆转录病毒颗粒感染HEp-2细胞,经嘌呤霉素筛选后得到稳定表达细胞株,用QPCR、细胞病变染色法、RT-PCR和间接免疫荧光法检测细胞中NS1 mRNA和蛋白表达情况。结果表明重组逆转录病毒载体pBABE-NS1经双酶切及测序鉴定正确;筛选获得5株阳性单克隆细胞株,QPCR结果显示HEp-2-NS1细胞有NS1基因扩增,其中d株的相对表达量是正常细胞对照组的8 483倍;在外源干扰素作用下,HEp-2-NS1细胞仍对VSV病毒保持敏感,细胞感染病毒48h后染色结果显示全部死亡;对第3代及第30代细胞的RT-PCR和间接免疫荧光法检测结果显示,导入的NS1基因在HEp-2细胞中不仅能转录成相应的mRNA而且能成功稳定地表达。成功构建了稳定表达RSV病毒非结构蛋白NS1的HEp-2-NS1改造细胞株,为建立适用于临床分离的转基因细胞提供良好的基础。     

呼吸道合胞病毒感染诱导BALB/c鼠固有免疫细胞分泌IL-33

IL-33是新发现的细胞因子,在病毒感染所诱发的气道炎症反应中发挥重要作用。研究发现感染呼吸道合胞病毒的BALB/c鼠肺组织内IL-33水平明显升高。但RSV感染后分泌IL-33的免疫细胞类型,尤其是感染早期分泌IL-33的固有免疫细胞类型目前尚不清楚。通过分离培养BALB/c鼠肺泡巨噬细胞及树突状细胞,采用ELISA及实时荧光定量PCR法检测上述固有免疫细胞RSV感染后IL-33分泌水平的变化。结果显示,RSV感染72 h后BALB/c鼠肺泡巨噬细胞IL-33mRNA水平明显升高,而树突状细胞RSV感染24 h后IL-33mRNA水平开始上升,48 h达峰值。研究证实RSV感染诱导BALB/c鼠固有免疫细胞分泌IL-33,进而介导感染后炎症的发生发展。     

艾叶挥发油抗病毒作用的初步研究

通过微量细胞病变抑制法,初步研究艾叶挥发油对呼吸道合胞病毒(RSV),流感病毒(IFV)的体外抑制作用。从艾叶挥发油的最大无毒量(TD0 )开始,作连续倍比稀释6个浓度,每一浓度均做4孔,分别加入已感染RSV的单层Hela细胞和感染IFV的单层MDCK细胞中,并设立阴性和阳性对照, 37℃,体积分数为5% CO2 培养,连续动态观察,得到药物的半数有效量(IC50 ),并计算治疗指数(TI)。艾叶挥发油对RSV的IC50为3. 33mg·L-1,TI值为9. 4。对IFV没有抑制作用。结论:艾叶挥发油对RSV有一定的抑制作用,对IFV的抑制作用不明显。     

白藜芦醇减轻神经元氧化应激损伤的作用机制研究

目的:观察白藜芦醇(RSV)对过氧化氢(H2O2)所致的海马神经元HT22细胞损伤的保护作用,并探讨超氧化物歧化酶2(Mn-SOD)在其中的作用。方法:采用体外培养HT22小鼠海马神经元细胞系,H2O2作为损伤因素模拟氧化应激损伤。将细胞分为5组,分别为正常培养组(Control)、150μM H2O2损伤组(H2O2)、25μM白藜芦醇保护组(RSV+H2O2)、SOD2-si RNA干扰组(SOD2-si RNA+RSV+H2O2)和乱序RNA组(SC-si RNA+RSV+H2O2),药物暴露24 h后,应用MTT法检测HT22细胞活力、比色法检测乳酸脱氢酶(Lactate Dehydrogenase,LDH)释放量、相差显微镜观测细胞形态。结果:与对照组相比,H2O2组的活力显著下降(P0.05),LDH释放量明显增加(P0.05),细胞形态明显破坏;25μM的RSV显著恢复了HT22细胞的活力、减少了LDH释放、改善了细胞形态,而SOD2-si RNA显著逆转了RSV引起的上述保护作用,乱序RNA(SC-si RNA)未对上述保护作用产生明显影响。结论:白藜芦醇可能通过上调SOD2减轻H2O2对HT22细胞的氧化应激损伤。     

云南白纹伊蚊细胞株对登革热、基孔肯亚病毒敏感性及增殖规律的观察

自Singh建立蚊细胞以来,为虫媒病毒的研究提供了新方法。singh又进行了白纹伊蚊和埃及伊蚊细胞株的比较,认为白纹伊蚊细胞更敏感,应用于虫媒病毒的分离得到满意的结果。我所1978年建立了一株白纹伊蚊细胞株,对登革病毒增殖较好。1979年我们从当地扑获蚊虫,建立了一株云南白纹伊蚊细胞株(ACY7),对登革、基孔肯亚病毒进行敏感性及增殖规律的观察,现将结果报告如下:     

近平滑念珠菌形态多样性及毒力因子的分泌活性研究

目的比较近平滑念珠菌不同临床分离株的菌落和细胞形态及其分泌型天冬氨酸蛋白酶(SAP)酶活性,阐明该病原真菌的形态多样性及毒力差异。方法分别用Lee’s Glc NAc、Lee’s glucose、Spider 3种培养基于37℃培养7株近平滑念珠菌临床分离株,观察各菌株的菌落及细胞形态;用牛血清白蛋白培养基(BSA)于30℃培养7株近平滑念珠菌,通过观察形成晕圈能力的强弱确定其毒力因子(SAP)的分泌活性。结果 7株近平滑念珠菌临床分离株在不同条件下菌落表型有较明显的不同,菌落有光滑型、皱褶型及火山口样型,且染色程度不同,各分离株细胞在形成酵母相或菌丝相的能力方面呈现出不同程度的差异;SAP酶活性观察实验中检测到各菌株水解晕圈大小从2.55 cm到1.55 cm各不相等。结论近平滑念珠菌临床分离株具有形态多样性,各菌株SAP酶活性明显不同,提示菌株间的毒力有明显差异。