PSCA-HSP70融合蛋白在大肠杆菌中的表达与纯化

旨在大肠杆菌中表达PSCA-HSPT0融合蛋白,并对其进行纯化.克隆人PSCA基因及HSP70基因,构建表达PSCA-HSP融合蛋白的工程菌,优化表达及纯化条件,对重组蛋白进行纯化.结果表明,成功构建重组表达质粒PSCA-HSP,重组蛋白得到可溶性表达,优化纯化条件后获得90%以上纯度的重组蛋白.本研究成功实现了PSCA与HSP的融合表达,为下一步肿瘤疫苗的研制奠定基础.     

表达重组人骨形态发生蛋白-7工程菌的发酵及表达产物的纯化

目的:研究表达重组人骨形态发生蛋白-7工程菌的发酵和表达产物的纯化工艺。方法:利用16L发酵罐发酵培养工程菌,设定了溶氧、搅拌速度、诱导时机、补料和培养基pH值等发酵条件;通过包涵体洗涤、离子交换层析法纯化目的蛋白。结果:工程菌目的蛋白质表达量占菌体总蛋白质的30%以上,纯化后目的蛋白的纯度可达98%。结论:建立了大肠杆菌高效表达人骨形态发生蛋白-7的发酵及纯化工艺。     

低出血倾向、低免疫原性葡激酶mSAK(K130T,K135R)的表达、纯化与活性测定

为了有效降低葡激酶应用的副作用,构建低出血倾向、低免疫原性葡激酶突变体,高效表达纯化后进行活性鉴定,以野生型重组葡激酶基因为模板,PCR法引入突变位点(K130T,K135R),并将该片段克隆测序鉴定后,克隆至表达载体pBV220,构建低免疫原性葡激酶突变体.表达后的蛋白用Q-SepharoseFF柱与SephacrylS-200进行纯化,纤维蛋白溶圈法进行活性测定,体外抗体中和试验与豚鼠免疫试验测定突变体蛋白的免疫原性,同时进行动物体内出血倾向观察.测序结果表明,相应位点获得突变,无非特异性突变,将突变后的片段连接pBV220导入大肠杆菌热激诱导获得了高效表达,表达产物占菌体总蛋白的40%~50%.产物主要以可溶性形式存在,经两步纯化后的蛋白的纯度可达98%以上.活性测定试验表明,该突变体的活性较野生型葡激酶稍低,体外中和抗体试验和豚鼠免疫试验证明免疫原性大为下降,豚鼠的皮肤出血以及肺部病理切片均显示该突变体蛋白引起的出血倾向明显降低.     

vMIP-II-TfN融合蛋白在毕赤酵母中的表达和纯化

目的:构建pPIC-vMIP-II-TfN酵母表达载体,表达纯化vMIP-II-TfN融合蛋白。方法:利用PCR方法扩增编码人转铁蛋白N端半分子的基因片段,通过酶切、连接、转化等分子克隆方法构建pPIC-vMIP-II-TfN酵母表达载体;电击法转化X33酵母菌;用甲醇诱导重组酵母菌表达融合蛋白,利用硫酸铵沉淀、透析、Ni-NTA层析等技术进行蛋白纯化,SDS-PAGE和Western blot检测蛋白表达和纯化情况,利用趋化实验进行纯化蛋白活性检测。结果:经过两次PCR扩增了一个长约1.1kb的包含Xba I酶切位点的IgG3-TfN基因片段,插入pPIC-vMIP-II的Xba I酶切位点,经菌液PCR鉴定获得重组子,测序结果表明构建载体pPIC-vMIP-II-TfN的表达框正确无误,转化X33酵母菌,用甲醇诱导表达出48kDa的vMIP-II-TfN融合蛋白,经硫酸铵沉淀、透析、Ni-NTA纯化后得到纯度约为95%的vMIP-II-TfN融合蛋白。Western印迹结果表明融合蛋白能与转铁蛋白抗体特异性结合。活性检测表明经过诱导表达的vMIP-II-TfN融合蛋白具有趋化抑制活性。结论:成功构建pPIC-vMIP-II-TfN酵母表达载体,重组酵母工程菌经甲醇诱导成功表达出vMIP-II-TfN融合蛋白,纯化后的vMIP-II-TfN融合蛋白具有趋化抑制活性。     

基于重组溶葡球菌酶和ATP生物发光技术特异定量检测金黄色葡萄球菌

基于重组溶葡球菌酶和ATP生物发光法建立特异定量检测金黄色葡萄球菌的方法。优化设计合成溶葡球菌酶序列,构建重组表达载体pQE30-Lys,转化至大肠杆菌M15并诱导表达,镍柱纯化得到目的蛋白。利用重组溶葡球菌酶和ATP生物发光法特异定量检测金黄色葡萄球菌并与平板计数对比。成功表达了重组溶葡球菌酶,并建立了特异定量检测金黄色葡萄球菌的方法,与平板计数具有显著线性关系。本研究建立的将重组溶葡球菌酶和ATP生物发光法相结合的检测方法操作快捷简单,具有良好的应用前景。     

蛇毒锯鳞蝰素融合蛋白的发酵与纯化

研究大肠杆菌表达重组蛇毒锯鳞蝰素(Echistatin,Ecs)融合蛋白的发酵和纯化工艺。将Ecs基因插入表达载体pTXB1,转化E.coliBL21(DE3)构建工程菌。对工程菌进行补料分批培养并诱导表达,研究培养基、培养和诱导时间对工程菌生长和目的蛋白表达的影响,几丁质亲和层析纯化Ecs融合蛋白,经DTT裂解后,检测Ecs活性。发酵后菌体湿重可达75g/L,融合蛋白表达量约占总蛋白的35%,重组质粒在BL21宿主菌中传代稳定。亲和层析纯化后,得到Ecs单体,得率为28mg/L发酵液。生物学活性分析显示,重组Ecs能有效抑制血小板的聚集,其活性与天然Ecs相似。优化了Ecs融合基因工程菌的发酵和纯化条件,为规模化生产奠定基础。     

T4多聚核苷酸激酶的原核表达、纯化及初步应用

原核表达、纯化T4多聚核苷酸激酶,并尝试将纯化的T4 PNK用于短探针序列的连接。本研究以合成的pseT基因为模板,PCR扩增出带有NdeⅠ和Bam HⅠ位点的目的片段,构建pseT-pET-15b原核表达载体,并转入E. coli ER2566中诱导表达。Ni-Agarose亲和层析柱纯化重组蛋白后,再进行Western blot鉴定。用纯化后再浓缩的T4 PNK参与探针连接反应,并设置商品T4 PNK和阴性对照。PCR扩增成功获得大于900 bp的目的基因片段,原核表达载体pseT-pET-15b构建成功,经诱导表达的重组蛋白分子量大小约为35 kD,Western blotting确认蛋白表达正确,浓缩后的蛋白浓度达到826μg/m L。电泳结果显示,重组T4 PNK在探针连接中效果较好。本研究成功表达并纯化了可溶性的T4多聚核苷酸激酶,且具有较好的活性,该蛋白可进一步用于后续大批量探针连接反应或其他相关研究,具有一定实际应用价值。     

重组人组织型纤溶酶原激活剂突变体基因的克隆、表达与生物活性鉴定

目的：研究重组人组织型纤溶酶原激剂突变体(reteplase,r-PA)基因的克隆和表达,并对表达产物进行活性鉴定。方法：通过PCR的方法从t-PA基因上扩增得到r-PA基因的编码序列,并克隆到pUC19载体中,经DNA测序正确后,将该基因克隆到含有,T7启动子的高效表达质粒pJZ-100中,转化E．coli BL21(DE3),得到含有r-PA基因的工程菌。工程菌经IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测表达情况。提取包涵体,经过体外稀释法复性,亲和色谱层析纯化,测定产物的活性。结果：表达的重组蛋白约占可溶性总蛋白的20％,复性并纯化后测定活性为58000IU/mg。结论：成功构建了重组r-PA的表达质粒,表达产物具有良好的生物活性。     

重组阳离子抗肿瘤肽AIK的原核表达、纯化及活性测定

利用Gateway克隆技术构建重组抗瘤肽AIK的原核表达体系,建立表达及纯化重组AIK的最优条件,为深入研究和利用AIK奠定基础。首先,设计含AttB重组位点的引物,通过重叠PCR技术扩增出Att B-TEV-FLAG-AIK序列,利用BP重组反应将目的序列TEV-FLAG-AIK克隆到供体载体pDONR223中,构建入门载体,再通过LR重组反应,将目的序列转移到目的载体pDEST15中,构建GST-AIK融合蛋白原核表达质粒。随后,在BL21(DE3)工程菌中优化诱导融合蛋白表达的条件。以谷胱甘肽磁珠纯化GST-AIK融合蛋白,再以rTEV酶切除GST,获得FLAG-AIK重组蛋白。最后以MTS法检测FLAG-AIK对白血病细胞HL-60的细胞毒性。菌液PCR验证和测序分析表明成功构建了重组抗瘤肽AIK的入门质粒和原核表达质粒。在BL21(DE3)工程菌中实现了GST-AIK融合蛋白的高效可溶性表达。并测得在37℃下以0.1 mmol/L IPTG诱导工程菌(OD600=1.0)4 h,重组蛋白表达量占菌体总蛋白的30%以上。经GST亲和层析、rTEV酶切除GST标签及二次GST亲和层析获得纯度高于95%的FLAG-AIK蛋白。MTS法测得所制备的FLAG-AIK蛋白抑瘤活性与化学合成的AIK相当。总之,本课题应用Gateway克隆系统成功构建了抗瘤肽AIK的原核表达质粒,实现了GST-AIK融合蛋白的高效可溶性表达,经亲和层析获得了有生物活性的重组AIK多肽,为后续深入研究和大规模制备奠定了基础。     

纳豆激酶酶原基因和纳豆激酶基因的克隆及在大肠杆菌中表达

目的：构建可高效生产有活性的纳豆激酶的大肠杆菌工程菌。方法：将纳豆激酶酶原（pro-nattokinase,pro-NK)基因和纳豆激酶（natokinase,NK)基因,并分别克隆到表达融合蛋白的高效表达载体pJN上,构建出表达质粒pJNK1和pJNK2,并转化大肠杆菌BL21（DE3）。结果：IPTG诱导下,两个融合蛋白的表达量均达到30%,活性检测显示表达纳豆激酶酶原融合蛋白的菌株pJNK-1(BL)诱导后菌体破碎上清的溶栓活性比表达纳豆激酶融合蛋白的菌株pJNK-2(BL)高2-3倍,结论：纳豆激酶酶原融合蛋白部分自减切产生纳豆激酶成熟肽。     

Overproduction of staphylokinase in Escherichia coli and its characterization

A recombinant plasmid which directs the overproduction in Escherichia coli of staphylokinase from Staphylococcus aureus has been constructed by placing the staphylokinase gene, sak, under the control of bacteriophage lambda PR promoter in the plasmid. When an E. coli strain having the plasmid was induced, the staphylokinase activity in the periplasmic fraction increased about 60-fold and the 15.5-kDa protein corresponding to the mature form reached about 25% of the periplasmic proteins. At the same time the 18.5-kDa protein corresponding to the precursor form was accumulated in the membrane fraction, showing that the processing and translocation of the sak gene product were restricted during high level of its synthesis. By using this strain, the mature staphylokinase has been easily purified to near homogeneity. The purification steps consisted of extraction of the periplasmic proteins by osmotic shock and CM-cellulose column chromatography. Two species of staphylokinase were identified after CM-cellulose column chromatography. Although their isoelectric points and NH2-terminal amino acid sequences were different, their specific activities were almost equal. These results strongly suggest that the NH2-terminal portion of staphylokinase is not important for its activity.     

Design, production, and characterization of an engineered biotin ligase (BirA) and its application for affinity purification of staphylokinase produced from Bacillus subtilis via secretion

A major attraction in using Bacillus subtilis as an expression host for heterologous protein production is its ability to secrete extracellular proteins into the culture medium. To take full advantage of this system, an efficient method for recovering the target protein is crucial. For secretory proteins which cannot be purified by a simple scheme, in vitro biotinylation using biotin ligase (BirA) offers an effective alternative for their purification. The availability of large amounts of quality BirA can be critical for in vitro biotinylation. We report here the engineering and production of an Escherichia coli BirA and its application in the purification of staphylokinase, a fibrin-specific plasminogen activator, from the culture supernatant of Bacillus subtilis via in vitro biotinylation. BirA was tagged with both a chitin-binding domain and a hexahistidine tail to facilitate both its purification and its removal from the biotinylated sample. We show in this paper how, in a unique way, we solved the problem of protein aggregation in the E. coli BirA production system to achieve a yield of soluble functional BirA hitherto unreported in the literature. Application of this novel BirA to protein purification via in vitro biotinylation in general will also be discussed. Biotinylated staphylokinase produced in the study not only can act as an intermediate for easy purification, it can also serve as an important element in the creation of a blood clot targeting and dissolving agent.     

Construction and characterization of novel staphylokinase variants with antiplatelet aggregation activity and reduced immunogenecity

Thrombotic complication of cardiovascular diseases isa main cause of death and disability and consequently,thrombolysis favorably influences the outcome of such life-threatening diseases as myocardial infarction. Throm-bolytic agents are plasminogen activators that convertplasminogen, the inactive proenzyme in the blood, to pro-teolytic enzyme plasmin, which dissolves the fibrin ofblood clot [1]. Currently, thrombolytic agents approved orunder clinical investigation on patients with acute myo-…     

人呼吸道合胞病毒融合蛋白(F)片段原核表达、纯化和鉴定

目的克隆并表达人呼吸道合胞病毒(Human respiratory syncytial virus,HRSV)兰州株的融合蛋白(F)基因片段。方法利用PCR技术扩增HRSV兰州株的融合蛋白基因片段,克隆于原核表达载体pET-42b(+),转化大肠杆菌(Rosetta),经IPTG诱导表达,镍离子亲和层析柱纯化,SDS-PAGE和Western-blot分析重组蛋白的表达及其反应原性。结果 PCR扩增得到951 bp的DNA片段,重组质粒pET42b-F经酶切鉴定和测序分析,表明质粒构建正确。表达的重组蛋白的相对分子质量为68 710,表达的重组蛋白占总菌体蛋白的7%,纯化后蛋白纯度达80%。经Western-blot分析,重组蛋白与抗RSV的单抗呈专一性强阳性反应。结论成功构建了HRSV兰州株F基因片段原核表达载体,并在大肠杆菌Rosetta中获得了表达,表达的重组蛋白具有反应原性和特异性,为HRSV感染引起的疾病血清学诊断以及试剂盒的研发提供了材料。     

重组葡激酶对小型猪冠脉血栓的溶栓作用研究*

目的: 评价重组葡激酶的溶栓效力,并与相同作用方式的重组链激酶进行比较。方法: 30只中国实验小型猪分成5组,分别为溶剂对照组、阳性药对照组和三个重组葡激酶组,每组6只,采用麻醉动物、手术开胸、直流电刺激形成冠脉血栓;在冠脉血栓形成30 min后开始静脉给药,采用先推注、再蠕动泵恒速输注的方式给药;溶剂对照组静脉推注对照液,阳性药对照组静脉给予重组链激酶4 mg·kg^-1,三个重组葡激酶组分别静脉给予4 mg·kg^-1、2 mg·kg^-1、1 mg·kg^-1重组葡激酶,静脉推注体积为5 ml,1 min内注毕,输注速度为0.5 ml·min^-1,60 min内输毕,120 min后放血处死动物。于给药前及给药后30、60、120 min取静脉血,实验结束后取血栓形成部位的冠脉血管段,分别检测优球蛋白溶解时间(ELT)、血纤维蛋白原含量(Fbg)、纤维蛋白(原)降解产物(FDP)和伤口出血量,检测冠脉血栓溶解率、心肌缺血程度及缺血范围。结果: 与溶剂对照组相比,试验组ELT明显缩短(P＜0.05或P＜0.01),FDP 明显升高(P＜0.05或P＜0.01),较少量实验动物Fbg降解超过20%,对小型猪血压及心率无明显影响。与对照组相比,试验组高、中2个剂量组,最大血栓面积分别减少34.3%、15.4%(P＜0.05)。与等剂量的重组链激酶相比,重组葡激酶对电刺激引起的冠脉血栓具有更强的溶栓作用(P＜0.05或P＜0.01),引起的出血副反应少。结论: 重组葡激酶对小型猪冠脉血栓有较好的溶栓作用,相比重组链激酶,溶栓速度快、具有更高的纤维蛋白专一性,出血副反应较少。综合比较, 2 mg·kg^-1重组葡激酶具有较好的临床疗效和安全性保障。     

Purification of recombinant histidine-tag streptolysin O using immobilized metal affinity expanded bed adsorption (IMA-EBA)

In this report, we describe the recombinant SLO expression as a fusion protein with a C-terminal hexahistidine tag and its purification using immobilized metal affinity expanded bed adsorption (STREAMLINE(trade mark) Chelating). In order to facilitate downstream processing of the purification, an efficient fermentation process was developed focusing on the achievement of high yields of soluble protein. The purification strategy resulted in a 40% recovery of active recombinant SLO and the protein was purified eight-fold. SDS-PAGE and Western-blot analysis of the purified protein revealed the presence of a 75 Mr form, which was the estimated relative Mass of the recombinant SLO.     

重组人钙网蛋白的克隆与原核表达

［摘要］目的: 克隆人钙网蛋白（calreticulin,CRT）并在E.coli中原核表达和纯化。方法：采用RT-PCR 法从人非小细胞肺腺癌A549细胞总RNA中克隆人钙网蛋白cDNA,构建CRT原核表达质粒（pET-15b/CRT）并转化E.coli 的Rossetta菌株。IPTG诱导后,表达蛋白在变性条件下经Ni-NTA 树脂亲和层析纯化,然后透析复性。分别用SDS-PAGE和Western blotting法鉴定CRT表达和纯化状态。结果：从A549细胞总RNA中成功获得人CRT cDNA克隆,重组质粒pET-15b/CRT构建正确。转化pET-15b/CRT的E.coli Rossetta诱导性表达重组人CRT蛋白,该蛋白可经Ni-NTA树脂亲和层析高度纯化。结论：成功建立了CRT原核表达和纯化的实验方法,该方法为后续的CRT蛋白功能研究奠定了基础。     

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的表达及其活性检测

目的:构建肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)高表达工程菌株,以获得具有生物学活性的重组TRAIL蛋白.方法:合成TRAIL基因,转到大肠杆菌中,IPTG诱导获得成功表达;进一步优化,增加可溶形式的蛋白质.利用硫酸铵对发酵液进行沉淀,经Ni柱、阴离子和阳离子交换柱层析,最终获得蛋白质纯品,对其进行体外活性检测.结果:经过IPTG诱导后,TRAIL达到菌体总蛋白的30％;经过优化,可溶形式蛋白达到55％.纯化获得纯度高于95％的TRAIL样品,体外测活结果表明:TRAIL蛋白能有效抑制多种肿瘤细胞增殖,抑制率达到70％-92％.结论:重组TRAIL以可溶形式得到高效表达,且具有较好的生物学活性,为其开发成药用蛋白奠定基础.     

金黄色葡萄球菌LDH多克隆抗体制备及其交叉反应性

目的:在原核载体中表达、纯化金黄色葡萄球菌乳酸脱氢酶,免疫小鼠获得多克隆抗体,使用多克隆抗体分析与其它菌种的交叉反应性。方法:复苏p ET28a-ldh/Bl21重组菌,IPTG诱导重组融合蛋白表达、以抗HIS标签的单克隆抗体进行western-blot鉴定重组蛋白。使用纯化的重组蛋白以及相应的佐剂免疫小鼠,利用ELISA测定血清抗体效价,并使用小鼠抗血清进行免疫印迹法鉴定重组蛋白的反应原性及其与金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、肺炎链球菌、粪肠球菌、大肠埃希菌的交叉反应性。结果:SDS-PAGE电泳在39 KDa处可见目的条带,免疫印迹法验证了重组LDH的表达,纯化后获得2.8 mg重组蛋白。纯化蛋白免疫小鼠能诱导产生特异性体液免疫应答,ELISA检测特异性Ig G效价为1:50000,western-blot鉴定显示所制备的多克隆抗血清能分别识别金黄色葡萄球菌重组及天然乳酸脱氢酶,但不识别表皮葡萄球菌、肺炎链球菌、粪肠球菌、大肠埃希菌中天然乳酸脱氢酶。结论:纯化的LDH具有良好的免疫活性,免疫小鼠获得高滴度的多克隆抗体。使用多克隆抗体western-blot显示与其它菌种LDH不存在交叉反应性,为后续使用该重组蛋白进行金黄色葡萄球菌感染的诊断研究奠定基础。