盾叶薯蓣内生真菌及其对宿主培养物生长和皂苷元生产的影响

从盾叶薯蓣根状茎中分离并鉴定了9株内生真菌,经悬浮培养14d,分别制备灭活菌丝和菌液浓缩物。其中,内生尖孢镰刀菌Dzf17能有效地提高盾叶薯蓣无菌苗和培养细胞薯蓣皂苷元的含量和产率,且灭活菌丝的诱导效果要强于菌液浓缩物。Dzf17灭活菌丝处理无菌苗,薯蓣皂苷元的产率为78.697mg/L,是对照(27.471mg/L)的2.865倍;用Dzf17菌液浓缩物处理无菌苗,皂苷元产率为41.822mg/L,是对照的1.522倍。Dzf17灭活菌丝处理培养细胞,薯蓣皂苷元的产率为1.391mg/L,是对照(0.691mg/L)的2.013倍;用Dzf17菌液浓缩物处理培养细胞,皂苷元产率为1.214mg/L,是对照的1.757倍。结果表明,在盾叶薯蓣无菌苗或细胞培养中添加一定量的内生真菌灭活菌丝或菌液浓缩物对于提高薯蓣皂苷元含量和产量将是一种有效的方法。     

镰刀菌诱导子对盾叶薯蓣离体培养物中薯蓣皂素合成的影响

研究了镰刀菌(Fusarium solani)诱导子对盾叶薯蓣离体培养物中薯蓣皂素合成的影响。结果表明:当培养基中诱导子糖含量达到30 mg GE/L时能使薯蓣皂素的含量明显提高;薯蓣皂素含量的最大值出现在镰刀菌诱导子处理后的第35 d,达到对照的2倍左右;盾叶薯蓣离体培养物PPO、SOD活性以及可溶性蛋白含量在添加诱导子后呈现一定的规律性变化。     

内生真菌Berkleasmium sp.寡糖对盾叶薯蓣培养细胞和幼苗防御相关酶活性的影响(英文)

从内生真菌Berkleasmium sp.Dzf12多糖(EPS、WPS和SPS)分别制备出相应的寡糖(EOS、WOS和SOS),研究寡糖对宿主盾叶薯蓣(Dioscorea zingiberensis)培养细胞和幼苗防御相关酶活性的影响。对于培养细胞,浓度为0.25 mg/m L的EOS处理24 h,苯丙氨酸解氨酶(PAL)和多酚氧化酶(PPO)活性达最大值,分别为对照的6.19倍和7.16倍;浓度为0.05 mg/m L的EOS处理48 h,过氧化物酶(POD)活性达最大,是对照的4.63倍。对于幼苗,浓度为2.5 mg/m L的EOS,处理48 h,PAL活性达最大值,为对照的6.21倍;处理24 h,PPO活性达最大值,为对照的4.80倍;处理48 h,POD活性达最大值,为对照的6.09倍。在3种寡糖中,EOS是最有效的诱导子。结果表明,用内生真菌Berkleasmium sp.Dzf12寡糖处理宿主盾叶薯蓣培养物能有效提高防御相关酶的活性,激活其防卫机制。     

从盾叶薯蓣组培苗中高压酸解制备薯蓣皂苷元

采用正交试验法对盾叶薯蓣(Dioscorea zingiberensis)组培苗中薯蓣皂苷元的高压酸解制备工艺进行了研究。以薯蓣皂苷元的含量作为评价指标,选用正交表L16(45),以样品用量、硫酸浓度、提取时间为因素,设计了3因素4水平的正交试验。结果表明:高压酸解提取薯蓣皂苷元的最佳工艺条件为:样品用量25 mg、硫酸浓度0.5 mol/L、提取时间2 h,在此条件下提取物中薯蓣皂苷元的平均含量为9.12 mg/g。     

盾叶薯蓣悬浮培养细胞生长及薯蓣皂苷元合成

研究了盾叶薯蓣细胞悬浮培养过程中细胞生长、薯蓣皂苷元合成、蔗糖和磷酸盐的吸收利用以及酸性磷酸酶活性与薯蓣皂苷元合成的关系。结果表明,对数生长期细胞最大比生长速率μm为0.19 d-1;倍增时间为3.68 d;薯蓣皂苷元的形成与细胞的生长相关,培养6 d时薯蓣皂苷元质量分数和产量分别为0.20%和25.93 mg/L;蔗糖利用率达到95.65%,磷酸盐吸收率达到最大,为90.36%。盾叶薯蓣细胞悬浮培养过程中酸性磷酸酶活性动态变化规律与薯蓣皂苷元的动态合成规律基本一致。此外,研究还发现在相同供磷水平下,酸性磷酸酶活性高低与薯蓣皂苷元合成能力呈正相关;而在不同供磷水平下,酸性磷酸酶活性高低与薯蓣皂苷元合成能力没有相关性。     

内生Bacillus svelezensis HBB5菌株发酵盾叶薯蓣产薯蓣皂苷元的研究

目的探讨内生Bacillus svelezensis HBB5菌株发酵宿主植物盾叶薯蓣产薯蓣皂苷元的能力。方法接种内生B.svelezensis HBB5及B.subtilis ATCC 6633菌株(0.35×10~8 CFU/mL)至含盾叶薯蓣地下茎组织的液体培养基,32℃、165~185 r/min连续发酵108 h,检测发酵液细菌、pH、淀粉、麦芽糖、葡萄糖、淀粉酶(α-amylase)及薯蓣皂苷元溶出率等指标。结果内生B.svelezensis HBB5菌株有较强的酸、碱耐受力[pH(4.8±0.2)~(8.4±0.2)],相比B.subtilis ATCC 6633[pH(5.2±0.2)~(8.7±0.2)]差异不明显;前者达峰值生长量(60×10~(8±2) CFU/mL)明显高于后者(32×10~(8±2) CFU/mL)。发酵36~60 h时,B.svelezensis HBB5、B.subtilis ATCC 6633菌株发酵液的淀粉、麦芽糖、葡萄糖浓度达峰值,分别为(37.41±3.12)、(27.83±2.14)ng/mL,(21.06±1.25)、(16.54±1.08)ng/mL,(54.33±3.12)、(36.65±2.10)ng/mL,前者均高于后者。同时,B.svelezensis HBB5菌株维持高的α-amylase酶活性及薯蓣皂苷元溶出率。结论内生B.svelezensis HBB5菌株拥有较强的耐酸碱、降解淀粉、提高薯蓣皂苷元溶出的能力,为工业生产薯蓣皂苷元提供了一个新的方法。     

内生芬芳镰刀菌Dzf2中两个抗菌活性成分(英文)

采用活性追踪的方法从盾叶薯蓣内生芬芳镰刀菌Dzf2中分离到两个抗菌活性成分,通过物理化学性质和波谱学特征鉴定为镰刀菌酸(1)和9,10-脱氢镰刀菌酸(2)。采用多孔板-MTT-比色法和孢子萌发法测定了化合物的抗菌活性。镰刀菌酸和9,10-脱氢镰刀菌酸对供试细菌的半抑制浓度(IC50)值为35.35μg/mL至171.29μg/mL;对稻瘟菌孢子萌发的IC50值分别为28.83μg/mL和27.06μg/mL。     

生物技术在薯蓣皂苷及其苷元生物合成中的应用

薯蓣皂苷及其苷元来源于药用植物盾叶薯蓣块茎,是合成甾体激素类药物的重要原料.由于野生盾叶薯蓣资源日渐枯竭及薯蓣皂苷及其苷元制备生产中的严重污染等问题,使其开发和生产面临严重的挑战.本文探讨了薯蓣皂苷及其苷元生产研究进展及存在的问题,概述了薯蓣皂苷及其苷元的代谢途径研究进展,展望了生物技术在薯蓣皂苷及其苷元生物合成中的应用前景.     

与盾叶薯蓣细胞共生培养的内生真菌分离及其生物学特性

从盾叶薯蓣根状茎中分离到一株与盾叶薯蓣细胞共生培养的内生真菌（RE0105）。测定了该菌ITS1-5．8S rDNA—ITS2序列并构建了系统发育树,发现RE0105与Libertella属形成一个类群,具有较近亲缘关系。该真菌能产生与宿主植物相同的代谢产物——薯蓣皂苷元。对RE0105培养特性研究表明：富含有机营养的培养基有利于其生长;盾叶薯蓣细胞提取物可明显刺激其生长;20μmol／L生长素NAA和2,4-D能够促进RE0105的生长。200μmol／L细胞分裂素KT和BA对RE0105生长具有一定的促进作用,但与生长素相比,细胞分裂素对RE0105生长的刺激作用较小。蔗糖、葡萄糖、果糖、乳糖、木糖和NH4NO3是RE0105生长的良好C源和无机N源,但NH4Cl和（NH4）2SO4对该菌生长具有明显抑制作用,并且显著影响其形态特征。     

高效转化黄姜皂苷为薯蓣皂苷元菌株的筛选及转化条件优化

薯蓣皂苷元是甾体激素类药物重要的生产原料,在制药工业中有广泛应用。传统的生产方法是黄姜酸解法,污染严重。为寻找更清洁高效的生产方式,从本实验室保藏的菌株中筛选出一株赤霉菌Gibberellaintermedia WX12(层出镰孢菌Fusarium proliferatum的有性阶段),能将黄姜中的皂苷转化为薯蓣皂苷元。采用统计学实验设计方法对其转化培养基进行研究,优化的转化培养基配方为(g/L):葡萄糖20.6;酵母膏5.0;氯化钠1;磷酸二氢钾3;硫酸锌1.5;黄姜酶解物3。采用以上优化参数,薯蓣皂苷元的得率提高到(31±0.3)mg/g干黄姜,较优化前提高了3倍。这是目前关于赤霉菌转化黄姜中皂苷的首次报道。     

用盾叶薯蓣生产薯蓣皂苷元预发酵与水解条件优化

采用RP-HPLC法检测薯蓣皂苷元,对薯蓣皂苷元提取过程中影响产率的多种因素,分预发酵、水解2部分分别用单因素和正交设计的方法进行优化.结果表明:40℃预发酵16 h,加6%浓H2SO4,料液比为1∶6,温度为121～126℃,水解5 h,产率高达3.62%,说明预发酵与水解条件优化可以提高盾叶薯蓣(Dioscorea zingiberensis C. H. Wright)生产薯蓣皂苷元的产率.     

盾叶薯蓣内生真菌Dzf12挥发性成分及其抗细菌活性

采用水蒸汽蒸馏法提取盾叶薯蓣内生真菌Dzf12的挥发性成分,得率为菌丝鲜重的0.276%。用GC-MS鉴定出30个成分,占挥发性成分总量的95.47%,其中含量较高的有棕榈酸甲酯(22.63%)、(E)-9-十八碳烯酸甲酯(8.30%)、(E,E)-9,12-十八碳二烯酸甲酯(8.12%)、2,6-二叔丁基对甲基苯酚(6.79%)、正十四烷(6.69%)、正十二烷(5.88%)等。测定了该挥发性成分对8种细菌的抑制活性,最低抑制浓度(MIC)值在0.75mg/mL至2.00mg/mL之间,抑制中浓度(IC50)值在0.62mg/mL和1.55mg/mL之间。对番茄疮痂病菌的抑制活性最强,MIC和IC50值分别为0.75mg/mL和0.62mg/mL。     

药源植物盾叶薯蓣甾体皂苷及皂苷元的研究进展

盾叶薯蓣是重要的甾体激素类药源植物,其根茎中薯蓣皂苷元含量居薯蓣属植物之冠,为我国的特有种。为了寻找高含量的资源、筛选新的生理活性成分,多年来我国学者做了大量的研究工作。主要概括了盾叶薯蓣的资源分布、薯蓣皂苷元的提取工艺、化学成分、药理、含量测定等方面的研究。     

激素对盾叶薯蓣愈伤组织细胞生长和薯蓣皂甙元合成的调控

不同生长素对盾叶薯蓣 (DioscoreazingiberensisC .H .Wright)愈伤组织细胞生长量的影响差异是NAA >IAA >2 ,4 D ,而对薯蓣皂甙元合成的影响是 2 ,4 D >IAA >NAA。在有生长素存在的条件下 ,光照 2 4h ,另加 0 5mg LKT促进愈伤组织细胞的生长 ,而附加 0 5mg LBA促进薯蓣皂甙元的合成 ;相反 ,光照 12h ,另加 0 5mg LBA促进生长 ,附加 0 5mg LKT促进合成。愈伤组织生长越旺 ,薯蓣皂甙元积累越少。低浓度的生长素促进薯蓣皂甙元的合成。     

不同倍性盾叶薯蓣营养器官解剖结构比较

运用石蜡切片法对三个倍性盾叶薯蓣营养器官的解剖结构进行比较研究。结果表明,不同倍性盾叶薯蓣的结构差异主要表现在叶片厚度、栅栏组织厚度、栅栏组织厚度/海绵组织厚度(P/S)、栅栏组织厚度/叶片厚度(P/L)、茎维管束中导管所占比例(VR)以及根状茎周皮厚度,其中栅栏组织厚度、P/S、P/L和VR在三倍体植株中表现最高,叶片厚度和周皮厚度则是四倍体植株表现最高,多倍体植株的表现总体优于二倍体植株。     

内生菌液体发酵提高穿山龙提取物中薯蓣皂苷元的含量

目的:分离提取穿龙薯蓣内生真菌,筛选能够发酵提高穿山龙药材提取物中薯蓣皂苷元含量的功能菌种.方法:采用PDA培养基分离纯化穿龙薯蓣内生真菌,将内生真菌与灭菌后穿山龙药材提取物在恒温振荡培养箱中,120 r/min,28℃培养7天.以高效液相法测定发酵物中薯蓣皂苷元的含量,并与原药材提取物、灭菌药材提取物以及未灭菌药材提取物的发酵物进行比较.结果:分离提取穿龙薯蓣内生真菌102种,其中C39菌能够稳定提高灭菌后穿山龙提取物中薯蓣皂苷元的含量,提高幅度达原药材提取物的20％-30％.结论:经液体发酵,穿龙薯蓣内生真菌C39能够稳定提高穿山龙药材提取物中薯蓣皂苷元的含量.     

盾叶薯蓣花药培养及单倍体植株的获得

以处于单核期的盾叶薯蓣花药为材料,经愈伤组织途径成功获得单倍体盾叶薯蓣新材料。对盾叶薯蓣花药培养、植株再生过程的研究表明:来自不同居群的外植体对花药愈伤组织诱导有显著影响;W14是适合花药愈伤组织诱导的基本培养基;花药愈伤组织增殖和分化的适宜培养基为:MS基本培养基 BA2.0mg/L IAA0.2mg/L;生根培养基为添加了IBA2.0mg/L、NAA0.4mg/L和0.5g/L活性碳的MS培养基。以流式细胞仪和根尖染色体压片法检查花培植株的结果表明,有8%～12%的个体为单倍体。实验结果为进一步开展单倍体育种及相关理论研究提供了材料和技术基础。     

盾叶薯蓣中薯蓣皂甙元不同提取方法的比较

为提高盾叶薯蓣(Dioscorea zingiberensis C.H.Wright)中薯蓣皂甙元得率,在实验室条件下,以薯蓣皂甙元含量为评价指标,采用4因素4水平的正交试验,用高效液相色谱法对16种提取方法所得的薯蓣皂甙元含量进行了比较分析.结果表明,硫酸的浓度对薯蓣皂甙元含量有极显著影响,在实验室条件下,可采用10 g样品加2.0mol·L-1硫酸200 mL水解4 h,水解物用石油醚回流提取5 h,能快速准确提取盾叶薯蓣中的薯蓣皂甙元.     

盾叶薯蓣响应低磷胁迫的生理代谢及基因表达特征分析

为探讨盾叶薯蓣在低磷胁迫下的生理变化、甾体皂苷类成分代谢及基因表达的响应特征，本研究选取河南南阳产盾叶薯蓣进行模拟低磷胁迫实验，在不同时期对根际基质中的磷含量(全磷、速效磷、磷酸铝盐、磷酸铁盐、磷酸钙盐)和土壤酸性磷酸酶(soil acid phosphatase, S-ACP)活性、植株根系发育特征(总根长、总投影面积、总表面积),各部位过氧化物酶(peroxidase, POD)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)活性及甾体皂苷类成分含量等指标进行分析，确定盾叶薯蓣响应低磷胁迫的关键时期，并利用RNA-Seq测序对关键时期盾叶薯蓣根茎、叶片、地上茎3个部位中的基因表达特征进行分析。研究发现低磷胁迫处理后盾叶薯蓣根际基质中易吸收态磷含量显著降低，其抗氧化酶(POD、SOD)与酸性磷酸酶活性均显著升高，根系发育受阻；低磷胁迫可明显影响盾叶薯蓣中甾体皂苷的合成与积累，且不同部位响应特征不同；胁迫初期为盾叶薯蓣响应低磷胁迫的关键时期；响应低磷胁迫关键时期的盾叶薯蓣基因表达存在明显的组织特异性，对三个处理组不同部位基因表达量与代谢通路进行分析，分别从盾叶薯蓣...     

1株盾叶薯蓣植物内生烟曲霉菌的分离鉴定

从药用盾叶薯蓣地下茎组织中分离内生菌。选取盾叶薯蓣地下茎核心组织,32℃恒温孵育,分离菌株;依据形态学、分子生物学特征鉴定菌株;通过纸片扩散法检测分离株与同种植物内生Bcillus subtilis SWB8菌株的拮抗作用。结果显示,孵育48 h后,培养基表面呈现扁平、白色或深绿色绒毛状菌落,显微镜下见孢子囊和圆形分生孢子;ITS序列分析显示,分离株ITS基因序列与GenBank数据库中烟曲霉菌同源性为100%,鉴定为烟曲霉菌(A.fumigatus YHY01)。拮抗实验显示,其与B.subtilis SWB8菌没有明显相互抑制现象。首次从盾叶薯蓣植物中分离出A.fumigatus,推测其与B.subtilis SWB8菌株间存在共生关系。