云南省4种伊蚊的乙型脑炎病毒分离物的研究

在云南省西南边境９县市捕获伊蚊属雌性成蚊１６种１９３６７只,用细胞法和乳鼠法分离病毒。从１８５批６４９１只白纹伊蚊中分离到病毒２株,从５０批１６０５只剌扰伊蚊中分离到病毒２株,从２３批７７２只窄翅伊蚊中分离到病毒２株,从４批１０３只阿萨姆伊蚊中分离到病毒１株。其它１２种共１０３９６只伊蚊的病毒分离物为阴性。分离到的７株病毒经免疫荧光、酶免疫、血凝抑制和中和试验鉴定,均为乙型脑炎病毒（ＪＥｖｉｒｕｓ）。白纹伊蚊是野外竹林的优势蚊种。分析认为白纹伊蚊在当地乙型脑炎病毒保存和传播中起重要作用,刺扰伊蚊、窄翅伊蚊和阿萨姆伊蚊亦可参与该病毒的传播。     

云南省4种伊蚊的乙型脑炎病毒分离物的研究

在云南省西南边境9县市捕获伊蚊属雌性成蚊16种19367只,用细胞法和乳鼠法分离病毒.从185批6491只白纹伊蚊中分离到病毒2株,从50批1605只剌扰伊蚊中分离到病毒2株,从23批772只窄翅伊蚊中分离到病毒2株,从4批103只阿萨姆伊蚊中分离到病毒1株.其它12种共10396只伊蚊的病毒分离物为阴性.分离到的7株病毒经免疫荧光、酶免疫、血凝抑制和中和试验鉴定,均为乙型脑炎病毒(JE virus).白纹伊蚊是野外竹林的优势蚊种.分析认为白纹伊蚊在当地乙型脑炎病毒保存和传播中起重要作用,刺扰伊蚊、窄翅伊蚊和阿萨姆伊蚊亦可参与该病毒的传播.     

登革2型病毒E蛋白结构域III的表达及多克隆抗体制备

登革病毒(Dengue virus,DENV)属于黄病毒科(Flaviviridae),黄病毒属(Flavivirus),为单股正链RNA病毒,有4个不同的血清型(DENV-1,2,3,4),主要通过埃及伊蚊(Aedes aegypti)和白纹伊蚊(Aedes albopictus)传播,可引起登革热、登革出血热、登革休克综合征等多种疾病[1,2]。E蛋白是位于DENV表面的结构蛋白,由495个氨基酸组成,它既含有黄病毒亚群特异的和登革病毒血清型特异的抗原表位,又有与中和,血凝抑制作用有关的抗原表位,是病毒颗粒的主要包膜蛋白[3]。Modis等研究表明,DENV-2型E蛋白以延伸的二聚体形式平铺在病毒表面,折叠成3个不…     

福建省白纹伊蚊中登革病毒的分离与鉴定

近年来福建省登革热(Dengue fever,DF)输入性病例持续存在,且登革热的主要传播媒介白纹伊蚊在全省内广泛分布,为了解福建省福州市登革热的媒介白纹伊蚊携带登革病毒(Dengue virus,DENV)状况,2017年10月7日在福州市台江区元一花园小区内开展伊蚊监测,采用双层叠帐法捕获255只白纹伊蚊蚊体研磨液上清提取核酸后用实时荧光RT-PCR法检测DENV特异性核酸,将检测阳性的蚊体研磨液上清接种C6/36细胞进行病毒分离,成功分离到1株DENV病毒株mosquito13/Fujian/2017;经实时荧光RT-PCR法鉴定所分离病毒株的血清型为I型;利用型特异性引物通过RT-PCR扩增病毒E基因并测序进行分子遗传特性分析;E基因核苷酸和氨基酸同源性分析显示,该毒株与2017年10月17日同小区本地登革热病例血清中分离得到的登革毒株E基因序列完全一致,与越南2014年分离株KT825033/Vietnam/2014核苷酸(99.7%)和氨基酸(99.8%)同源性最高;系统进化树分析表明所分离登革病毒毒株的基因型为I型,与东南亚地区的越南,泰国,柬埔寨等国家进化关系相近,可能输入来源于东南亚国家。本研究证实了登革热外潜伏期的存在以及白纹伊蚊在登革热疫情传播过程中的媒介作用,提示在登革热的防控工作中媒介登革病毒监测、检测的重要性,也提示福建省需要加强输入来源监测,特别是东南亚入境人员的监测。     

白纹伊蚊抗溴氰菊酯品系的筛选及其对登革病毒的易感性

【目的】建立白纹伊蚊Aedes albopictus抗溴氰菊酯的蚊虫品系,对比白纹伊蚊敏感株和抗性株对登革病毒的易感性差异。【方法】采用浸渍法测定溴氰菊酯对白纹伊蚊幼虫的半数致死浓度(LC_(50));再以LC_(50)水平的溴氰菊酯对白纹伊蚊幼虫进行群体筛选至第11代,并通过接触筒法检测各代成蚊抗性。以白纹伊蚊敏感株和获得的抗性株(第9代)雌蚊吸食含2型登革病毒(DENV-2)的血餐,于感染后0,4,7和10 d解剖蚊虫,收集中肠、卵巢和唾液腺,通过RT-PCR和实时荧光定量PCR分别检测各组织的DENV-2病毒感染率和感染量。【结果】白纹伊蚊经溴氰菊酯筛选至第9代后抗性趋于稳定。第9代抗性株幼虫的LC_(50)为0.053 mg/L,抗性倍数为10.58,成蚊生测的蚊虫死亡率为80%,已达到中度抗性。感染后0 d,所有蚊虫的中肠均可测得DENV-2,而且抗性株的平均病毒感染量高于敏感株;后续时间点敏感株与抗性株蚊虫中肠均保持92.75%~97.18%的病毒感染率,且二株之间无显著性差异(P0.05)。感染后4 d,两株蚊虫的卵巢中均可检测到DENV-2,感染后7 d和10 d的卵巢病毒感染率均显著高于4 d时(P0.05),但在7 d和10 d两个时间点,敏感株和抗性株之间均无统计学差异(P0.05),然而抗性株平均病毒感染量在每一个时间点都显著高于敏感株(P0.05)。蚊虫唾液腺于感染后7 d检测到DENV-2,10 d时唾液腺的病毒感染率无明显升高且两株蚊虫之间病毒感染率和感染量均无统计学差异(P0.05)。【结论】经溴氰菊酯的筛选使白纹伊蚊幼虫及成蚊抗性水平逐渐升高,建立了白纹伊蚊抗溴氰菊酯的实验室品系。DENV-2对白纹伊蚊抗性株和敏感株各个组织的感染率相近,但感染量有所不同,说明对溴氰菊酯有中度抗性的白蚊伊蚊对登革病毒的易感性在一定程度上发生了改变。     

登革Ⅱ型病毒经白纹伊蚊滞育卵的传递

采用C6/36细胞培养分离病毒的方法检测感染登革Ⅱ型病毒的白纹伊蚊Aedes albopictus滞育卵孵化的F₁代蚊虫感染率,从第一个生殖营养周期子代蚊虫中未分离到病毒,第二与第三生殖营养周期子代蚊虫最低感染率没有显著性差异（χ²=0.01,P＞0.0 5）,感染子代的批阳性率为9.1%,最低感染率为1∶330;间接免疫荧光检测结果表明感染登革Ⅱ型病毒的白纹伊蚊滞育卵孵化的子代成蚊能通过叮咬将登革病毒传播给敏感乳鼠。这些研究结果表明登革病毒能在媒介滞育卵内存活并传至子代,子代蚊虫能通过叮咬敏感宿主水平传播病毒。     

标记抗体技术与病毒快速诊断

病毒性感染的快速诊断技术通常检测体液标本中的微量病毒抗原和早期IgM抗体,在病毒感染后几天内就可作出诊断。检测微量病毒抗原和早期IgM抗体,要求检测技术敏感性高,特异性强,重复性好,方法简便。近几年来发展起来的标记抗体技术能够满足上述要求。 荧光素、酶或核素能与抗体结合成标记抗体,标记抗体仍然具有与特异性抗原结合的免疫学特性,形成一种标记的免疫复合物。这种标记的免疫复合物可以用仪器来检测。 标记抗体技术包括免疫荧光技术、免疫酶技术和放射免疫分析。 一、免疫荧光技术 将荧光素与特异性抗体共价结合,成为荧光抗体。荧光抗体再与标本中抗原形成抗原抗体复合物,借助荧光显微镜观察标本中所显示的荧光。免疫荧光技术用于检测细胞内微量病毒抗原,对不产生细胞病变的病毒更具有诊断价值。也可用于病毒抗原的定位和检测体液中的特异性抗体。在几小时内可获得实验结果,已广泛用于病毒实验室快速诊断。 常用的荧光素有异硫氰酸荧光素和罗丹明,异硫氰酸荧光素的荧光呈黄绿色;罗丹明的荧光显红色。     

登革Ⅱ型病毒在白纹伊蚊体内分布的研究

利用蚊虫连续石蜡切片免疫组织化学技术,对登革Ⅱ型病毒(DEN-2)感染白纹伊蚊Aedes albopictus后的散播时间、程度及组织器官的感染顺序进行监测,以了解DEN-2在媒介白纹伊蚊体内的分布规律。结果表明：大剂量感染登革Ⅱ型病毒后,在蚊虫消化道的主要部位以及大多数组织器官包括神经及内分泌系统在内,如涎腺、脑、神经节等亦检测到病毒抗原。登革Ⅱ型病毒一旦感染并逸出中肠会迅速侵染其它组织。从各组织感染率的高低推断,病毒逸出中肠后通过血淋巴传播到其它组织的顺序通常为：前肠、涎腺、咽部神经节、脑及食管下神经节、后肠及复眼的小眼等。     

白纹伊蚊扩散距离和飞翔能力的观察

<正> 白纹伊蚊Aedes albopictus Skuse是登革热的传播媒介,它的飞翔能力和扩散范围与登革热流行有直接关系。我们于1984年6月在广东番禺县沙头区,用金粉、银粉、金银粉混合染色标记白纹伊蚊进行扩散距离和飞翔能力的观察,其结果如下。 一、材料和方法 1.蚊种 由中山医科大学寄生虫教研组提供的广州株,从1980年驯化至现在。 2.蚊卵收集 按常规饲养、收集蚊卵待干后,放入玻璃干燥器备用。 3.用金粉和银粉作标记 将麻醉的白纹伊     

白纹伊蚊和埃及伊蚊经卵传递登革病毒的研究

白纹伊蚊和埃及伊蚊通过吸食病毒液或叮吸有病毒血症的小鸡血后,能感染登革１－４型病毒,并能在蚊体内增殖,对感染雌蚊了１和子２代幼虫,雌性或雄性成虫４５５９只,分１０１批进行了病毒检测,白纹伊蚊子１代的批阳性率;登革１型为１０％（１／１０）２型为２２．２２％（２／９）３型为３３．３３％（４／１２）,４型为２８．９５％（１１／３８）登革１～４型的最低子代感染率依次主国０．２０％,０．７１％,０．７０％和     

RNA干扰抑制登革病毒复制的研究

为了研究RNA干扰(RNAi)对Ⅰ型登革病毒(DENV-1)在白纹伊蚊C6/36细胞内复制的影响,本研究设计并合成针对I型登革病毒Pr M基因的小干扰RNA,以脂质体法转染入C6/36细胞后,用DENV-1感染已转染的细胞,观察细胞病变效应,MTT法检测细胞存活率,荧光定量RT-PCR检测登革病毒RNA含量。结果表明:转染siRNA的C6/36细胞在受登革病毒攻击7天后仍无明显细胞病变效应,细胞存活率比对照组提高2.26倍,细胞内登革病毒RNA拷贝数比对照组降低约97.54%。说明利用RNA干扰技术能有效抑制登革病毒核酸在C6/36细胞内复制,并对细胞具有一定保护作用,为登革热的防治提供了新的思路。     

白纹伊蚊垂直传播乙型脑炎病毒的研究

用５株乙型脑炎病毒（ＪＥｖｉｒｕｓ）经口感染白纹伊蚊,证明该蚊能感染和传播乙型脑炎病毒,对感染雌蚊的１和子２代卵３４４３粒,幼虫７０２１只和成虫４８５３只,分１７１批检查乙型脑炎病毒,子１代的批阳性率,卵为４６．６７％（１４／３０）,幼虫为２１．２１％（７／３３）。雌性成虫为２３．７８％（９／３８）,雄性成虫为１５．００％（３／２０）;子２代幼虫,雌性和雄性成虫和批阳性率依次为２３．５３％（４／１     

灭活贝氏柯克斯体免疫小鼠抗登革病毒感染的实验研究

目的 研究灭活贝氏柯克斯体增强小鼠非特异性抗登革病毒感染的免疫效能。方法 用灭活贝氏柯克斯体全细胞疫苗(WCV)免疫BALB/c小鼠,每只小鼠皮下注射50μg WCV,初次免疫后第5周及第7周分别腹腔注射20μg WCV加强免疫。1周后,用10~5 TCID_(50)剂量的登革病毒2型经尾静脉注入感染小鼠,于感染后48、72h分别解剖小鼠.自血和脑组织提取RNA样本,用实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测样本。结果 用登革病毒特异的定量PCR检测感染小鼠血RNA样本,结果显示感染72h血样本中病毒含量显著低于48h样本,但免疫小鼠与未免疫小鼠之间无显著差异。检测脑组织RNA样本,未免疫小鼠和免疫小鼠的感染48h样本检出病毒均为少量;但未免疫小鼠感染96h样本检出病毒量明显增加,显著高于免疫小鼠。结论 灭活贝氏柯克斯体可诱导机体产生非特异的免疫应答,具有一定增强小鼠抗登革病毒感染的能力,但具体机制有待进一步研究。     

应用反向间接血凝法早期诊断流行性出血热

1985年我们研制了流行性出血热(EHF)抗体致敏的诊断血球,建立了检测EHF抗原的R-PHA方法。用此法检测本所分离的EHF病毒株感染的VeroE_6细胞培养上清液,以及人工感染EHFV的小白鼠乳鼠脑悬液等,均获得良好结果。以后又应用此法检测了EHF早期病人血清、白细胞冻融液及人工感染EHFV的小白鼠乳鼠血清等,并作了特异的EHF抗体阻断试验,现将结果报告如下:     

C_3和C_4植物叶片内双磷酸核酮糖(RuDP)羧化酶之免疫荧光定位

我们用从菠菜提纯的RuDP 羧化酶制备兔抗RuDP 羧化酶抗体,用荧光免疫直接法在典型的C_3和C_4植物叶片横截面的冰冻切片内定位RuDP 羧化酶。抗RuDP 羧化酶抗体是用异硫氰荧光素(FITC)标记的。观察结果说明在C_4植物(玉米)叶切片中,特异荧光绝大部分集聚于维管束鞘细胞的叶绿体内。在C_3植物(小麦、大麦)叶切片中,特异荧光呈现在叶片叶肉细胞的叶绿体部位。两种植物中特异荧光分布的不同显示了它们的RuDP 羧化酶分布的不同。     

原核细胞表达的肾综合征出血热病毒核蛋白免疫原性及免疫保护作…

对原核细胞表达的肾综合征出血热病毒核蛋白的免疫原性及免疫保护作用进行好研究,结果发现表达的核蛋白具有很强的免疫原性,免疫小白鼠血清中抗肾综合征出血热病毒荧光抗体滴度达１：１２８００;用免疫小鼠脾细胞和血清做被动免疫保护实验,结果显示脾细胞对部分乳鼠肾综合征出血热病毒的致死感染有保护作用,保护率可达３８％,而血清可具有免疫保护作用;同时也未观察到核蛋白免疫血清具有感染的保护作用,保护率可达３８％,而     

肺炎支原体感染鼠P1特异抗原的动态检测

通过实验动物模型探讨肺炎支原体感染动物肺泡灌洗液中特异抗原检出率的动态变化,为肺炎支原体感染的临床诊断提供理论依据。小鼠经鼻自然感染肺炎支原体,分别采集感染后不同时间点小鼠的支气管灌洗液,应用量子点标记肺炎支原体P1蛋白抗体,直接免疫荧光法检测感染鼠肺泡灌洗液中肺炎支原体P1特异抗原,同时通过PCR检测肺组织肺炎支原体DNA及肺组织病理切片观察肺部炎性变化确定小鼠感染。结果显示,感染鼠肺炎支原体特异抗原在感染后第3天检出阳性率为75%,第7天达高峰为83%,之后随病程延长,抗原检测的阳性率逐渐下降,在感染后第14、21天检出阳性率分别为58%和25%。肺炎支原体特异抗原在感染早期检出率高。应用量子点标记肺炎支原体P1蛋白抗体,直接免疫荧光法检测肺炎支原体特异抗原可应用于肺炎支原体感染的早期诊断。     

原核细胞表达的肾综合征出血热病毒核蛋白免疫原性及免疫保护作用的研究

对原核细胞表达的肾综合征出血热病毒核蛋白的免疫原性及免疫保护作用进行了研究,结果发现表达的核蛋白具有很强的免疫原性,免疫小白鼠血清中抗肾综合征出血热病毒荧光抗体滴度达１：１２８００;用免疫小鼠脾细胞和血情做被动免疫保护实验,结果显示脾细胞对部分乳鼠肾综合征出血热病毒的致死感染有保护作用,保护率可达３８％,而血清不具有免疫保护作用;同时也未观察到核蛋白免疫血清具有促感染乳鼠早死作用。表明核蛋白能诱导细胞免疫保护但不诱导抗体介导的免疫保护,同时也不引起抗体介导的早死,这就为肾综合征出血热病毒核蛋白作为该病毒基因工程疫苗的成分提供了一定的理论基础。     

小鼠感染细小病毒的临床特征分析

目的分析小鼠细小病毒(MVM)在人工感染小鼠体内的分布规律、排毒和抗体变化,以及自然条件下小鼠感染MVM的情况。方法对33只BALB/c小鼠腹腔接种0.2 m L MVM悬浮液,每天观察动物的外观、行为、饮食和精神状态,在接种第0~60天共12个时间点各对2~3只动物进行安乐死,并采取组织、粪便和血清样本进行检测。荧光定量PCR(QPCR)方法检测组织和粪便的病毒核酸,ELISA方法检测血清抗体。同时,采取100只SPF小鼠、76只开放饲养小鼠检测MVM核酸,采取1463只SPF小鼠、82只开放饲养小鼠检测MVM抗体。结果实验小鼠接种MVM后外观、行为、饮食和精神状态未见异常,剖检无明显病变。各组织在接种后都能检出病毒核酸,并在接种后4~7 d达到峰值,且到60 d仍可检出病毒核酸。各组织间比较,病毒峰值最高的组织是肝,其次是肾、脾、胃、心脏、肺、盲肠和脑。粪便排毒在接种后11 d可达到峰值,之后迅速下降,但到60 d还可检到。血清抗体在病毒接种后7 d开始产生,之后抗体效价逐渐升高,21 d就可以达到32倍左右,之后至60 d一直处于64倍左右。临床样本中,核酸检测SPF小鼠未检出,开放饲养小鼠的检测阳性率为14.5%,经过测序比较确认为MVM病毒感染;抗体检测SPF小鼠有较低的检出率(0.3%),开放饲养小鼠检出率为68.3%。结论 MVM感染小鼠后一般呈隐性感染状态,可长期排毒,主要组织脏器、粪便、血清都能用于MVM的检测,实验小鼠感染MVM可以通过病毒核酸和血清抗体检测方法进行病原检测。     

原型(祖先)森林登革病毒与外溢感染

登革病毒是蚊源性病原,保持于森林(非人灵长类/森林蚊子)和地方性流行(人类/城市/家周蚊子)循环中。由蚊媒介的人-人的传播在亚洲和美洲是病毒循环的通用方式,而在西非森林循环占优势。登革病毒的地方性流行方式源于森林登革病毒对家周/城市蚊子的适应。在2004-2007年,马来西亚在登革1型流行中分离到1株原型森林登革1型病毒。该病毒与哨猴株间外膜基因序列——核苷酸序列相似性97%,氨基酸序列相似性99%。在55位点上仅有1个氨基酸差异,猴株是缬氨酸,人株是异白氨酸。病毒能被流行登革病毒1型感染的患者血清中和。该病毒的罕见分离表明来自只限于森林循环的一种有限的外溢感染。估计患者株序列进化率是5.2×10-4取代/位点/年。尼日利亚1965年从发热患者分离到3株森林病毒,遗传发生树表明不同于地方流行登革病毒并均在森林登革病毒区块内,表明外溢流行。埃及伊蚊在西非森林中表现偏动物倾向,在登革病毒森林扩大循环中的作用有限。