大肠杆菌可溶性核糖核酸结构的研究 Ⅱ.可溶性核糖核酸的RNase Ⅰ降解产物的双向电泳层析图谱

(一)应用双向电泳层析图谱法分析了大肠杆菌S-RNA的RNase I降解产物。结果表明成堆排列的嘧啶核苷酸占核酸重量的17.1%;二核苷酸占12.7%。成堆排列的嘧啶约占嘧啶总量的45—60%左右,证明在S-RNA分子中核苷酸的分布是不均一的。(二)在76个核苷酸链中成堆排列的嘧啶核苷酸残基,—PypCpNp—,—PypUpNp—分别是13.7和5.5;在低聚核苷酸中,—GpCp—,—ApCp—,—GpUp—和—ApUp—分别是2.5,2.O,1.4和1.1。Pyp(?)Up占1.1。(三)核苷酸在S-RNA链中的排列形式不符合按无规排列的计算结果,说明核苷酸的排列具有一定程度的规律性。     

大肠杆菌可溶性核糖核酸的研究 Ⅲ.可溶性核糖核酸5’-磷酸单酯末端核苷酸的排列

(1)比较了E.coli DNP-S-RNA和S-RNA的紫外光谱,并研究了DNP-S-RNA的RNase I的降解条件,结果表明两者无显著差别。(2)对DNP-S-RNA的RNase I降解产物的双向电泳层析图谱进行了分析,并与S-RNA图谱进行了比较,两者图谱中光吸收点的分布一致,相应点经洗脱后,由光谱分析与核碱组成测定证明均含有相同的核苷酸组成。(3)在DNP-S-RNA和S-RNA于同一条件下得到的图谱中,前者的某些光吸收点中含有不同量的DNP-。根据DNP-可以标记S-RNA末端5′-磷酸单酯,分析了DNP-结合物,说明在E.coli S-RNA分子中,B末端核苷酸除pGp…以外,尚有pAp…,pCp…以及痕量的pUp…。和末端相邻的核苷酸排列形式,随特异S-RNA而有不同,有pGpUp…,pGpCp…,p(GpGpAp)Up…,p(GpAp)Up…+pGpGpUp…,p(GpAp)Cp…,pApUp…和pApCp…。其他四核苷酸以上多核苷酸未分析。由于电泳和层析后原点部分标记了DNP-,估计末端核苷酸排列有五、六核苷酸以上的多嘌呤核苷酸的排列形式,其中以G为主。     

核酸化学结构的研究——Ⅰ.1-氟-2,4-二硝基苯与可溶性核糖核酸的反应

(一)本工作报告了FDNB与RNA的作用条件,并研究了不同断裂程度的RNA和FDNB的反应。(二)对DNP-在大肠杆菌S-RNA分子中的结合位置通过紫外线吸收光谱和牛胰RNase以及蛇毒磷酸双酯酶的降解作用做了探讨,由实验结果推断:DNP-似结合在S-RNA末端5′-G核苷酸的磷酸单酯上。(三)本文说明DNP-的结合量可以用来计算S-RNA的链长及分子量;也可以利用DNP-标记pG末端,以便利于该末端核苷酸排列顺序的研究。     

可溶性核糖核酸的研究 Ⅰ.金属离子对可溶性核糖核酸酶解稳定性的作用

(1)各种金属离子对大腸杆菌RNase活力的影响不同,Mg~++不仅沒有抑制作用而且是大腸杆菌RNase表現活力的必需因素。Ca~(++)与Ag~(++)相似,Co~(++)对酶活力影响較小,而Ni~(++)則有抑制作用。(2)在Mg~(++)、Ca~(++)或Na~+等存在下,大腸杆菌RNase和牛胰RNase降解SRNA的速度远比HRNA为慢;利用Mg~(++)对这两种RNase活力的影响不同,在Mg~(++)存在与否下,比較SRNA与HRNA降解速度的結果指出,SRNA的二級結构是其酶解緩慢的主要原因,而Mg~(++)等金属离子对稳定其二級結构起着重要的作用。这种作用在60℃仍然存在。(3)SRNA影响RNase对HRNA的降解。这种現象可能用酸溶性核苷酸与RNA一起沉淀的作用解释,但也不能完全排除两个結构相似底物(SRNA与HRNA)同时存在相互竞爭的可能性。(4)对SRNA不能为其他核酸降解酶完全降解或降解速度緩慢的原因及其生理意义进行了討論。     

可溶性核糖核酸的研究——Ⅱ.脱氨作用对可溶性核糖核酸性质的影响

(1)脫氨SRNA的ε(p)及超离心沉降行为皆与SRNA相似。脫氨SRNA的紫外吸收高峰及低峰皆稍向短波长方向移动。Mg~(++)使SRNA产生紫外低吸收效应,尿素使SRNA的光吸收值增高;在同样条件下,Mg~(++)及尿素对脫氨SRNA紫外吸收值影响极小。脫氨SRNA易为Ba~(++)等金属离子所沉淀,在pH5—7.2范圍內,0.083MBaCl_2即可使脫氨SRNA沉淀約90%,而SRNA的沉淀尚不足10%。脫氨SRNA經碱或牛胰RNase水解后,則不再能为BaCl_2所沉淀。温度对BaCl_2沉淀脫氨SRNA与SRNA有显然不同的影响。(2)用大腸杆菌RNase和牛胰RNase两种酶水解脫氨SRNA与SRNA时,Mg~(++)可以提高这两种酶对前者的降解速度,而对后者起稳定作用。(3)大腸杆菌RNase降解脫氨SRNA可以得到黄嘌呤、次黄嘌呤及尿嘧啶三种单核苷酸,降解SRNA可以得到腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤及尿嘧啶四种单核苷酸。     

可溶性核糖核酸的研究 Ⅲ.酵母可溶性核糖核酸中抗碱二核苷酸的分离与鉴定

利用Tomlinson和Tener的DEAE-纤维素柱层析方法,我们从酵母SRNA的碱水解产物分得抗碱二核苷酸的层析峰。将抗碱二核苷酸混合物用大肠杆菌碱性磷酸单酯酶处理后,纸层析分离可得到四个部分,分别称A_1,A_2,A_3及A_4。经鉴定A_1为2′-O-甲基鸟便嘌呤核苷-3′-磷酸-5′-鸟便嘌呤核苷(G'pG),A_2主要为2′-O-甲基胞嘧啶核苷-3′-磷酸-5′-鸟便嘌呤核苷(C'pG,纯度约为87%),A_3则至少合2′-O-甲基胞嘧啶核苷-3′-磷酸-5′-腺嘌呤核苷(C'pA)和2′-O-甲基鸟便嘌呤核苷-3′-磷酸-5′-腺嘌呤核苷(G'pA),A_4较为复杂,未最后鉴定。因此酵母SRNA中至少含有下列四种抗碱二核苷酸:2′-O-甲基鸟便嘌呤核苷-3′-磷酸-5′-鸟便嘌呤核苷酸(G'pGp),2′-O-甲基胞嘧啶核苷-3′-磷酸-5′-鸟便嘌呤核苷酸(C'pGp),2′-O-甲基胞嘧啶核苷-3′-磷酸-5′-腺嘌呤核苷酸(C'pAp)及2′-O-甲基鸟便嘌呤核苷-3′-磷酸-5′-腺嘌呤核苷酸(G'pAp)。除此以外,还得到核苷二磷酸的层析峰,其中主要为鸟便嘌呤核苷-2′(3′),5′-二磷酸,只有少量的腺嘌呤核苷-2′(3′),5′-二磷酸。     

三链形成寡聚核苷酸的反基因作用机理

1957年Felsenfeld等发现一条Poly A链能跟两条Poly U链形成三螺旋,这是三链形成寡聚核苷酸(triple-forming oligonucleotide,TFO)研究的开始[1].随着DNA合成技术的进展,人们能合成各种序列的寡聚核苷酸.1987年Le Doan等[2]发现聚嘌呤或聚嘧啶寡聚核苷酸能序列特异的结合于同聚嘌呤/同聚嘧啶DNA双链的大沟内,识别的机制包括形成Hoogsteen和反Hoogsteen氢键.现在常用的包括含(G、A),含(G、T)或含(C、T)的3种TFO以及它们的类似物.人们根据TFO能序列特异的识别双螺旋DNA,从而可能影响基因的转录而发展出反基因战略.     

《生物工程讲座》名词解释(Ⅰ-Ⅳ讲)

1.bp碱基对。DNA长度的单位。1000bp=1kb。 2.kp千碱基对。参见bp。 3.A,G,T,C DNA双链上四种脱氧核苷酸(或其碱基)的符号,A为脱氧腺嘌呤核苷酸,G为脱氧鸟便嘌呤核苷酸,T为脱氧胸腺嘧啶核苷酸,C为脱氧胞嘧啶核苷酸。在双链上。A恒与T配对,G恒与C配对。在RNA链上,四种核苷酸的符号为A,G,u,c,相应为腺嘌呤核苷酸,鸟便嘌呤核苷酸,尿嘧啶核苷酸和胞嘧啶核苷酸。     

一种新的核糖核酸酶-栝楼核糖核酸酶的纯化

从一种高等植物栝楼中分离出一种新的单一碱基特异性核楼核酸内切酶—栝楼核糖核酸酶(RNase TCS),它在pH 3.57M脲的变性条件下,能单一地把RNA分子中尿嘧啶核苷酸的5′端切开,纯化酶在SDS-PAGE中呈单一泳带,分子量为24.2KD,最大吸收峰279nm,比活12800U/mg。     

作用于cip-cel mRNA的核糖核酸内切酶的鉴定

【目的】本研究以革兰氏阳性细菌解纤维素梭菌(Ruminiclostridium cellulolyticum)为研究对象,筛选作用于纤维小体编码基因簇cip-cel mRNA的核糖核酸内切酶。【方法】通过对预测的4个假定编码核糖核酸内切酶基因进行基因敲除、体内过表达、体外过表达和活性分析等方法,分析它们对cip-cel mRNA剪切位点的剪切能力。【结果】敲除rnc和rnj基因,对cip-cel mRNA剪切没有任何影响;体内过表达RNase时能够加速cip-cel mRNA的降解,而过表达RNase G时,则结果与野生型对照菌株无异;RNase G基因rng和RNase Y基因rny的体外活性鉴定分析,发现RNase G对体外转录的包含cip-cel mRNA剪切位点的RNA没有作用,而RNase Y能够对其进行剪切和降解。【结论】RNase Y是能够作用于cip-cel mRNA的核酸内切酶。该研究结果对理解革兰氏阳性细菌核糖核酸内切酶的作用机制,及其在转录后水平的调控基因差异表达等方面具有重大意义。     

名词解释

核苷、核苷酸碱基与脱氧核糖或核糖以糖苷键连接而成的糖苷叫做核苷。所含的糖若为脱氧核糖,所形成的核苷叫脱氧核糖核苷:所含的糖若为核糖。则所形成的核苷叫核糖核苷。碱基有多种,组成脱氧核糖核苷的碱基主要有腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)和胞嘧啶(C)四种:而组成核糖核苷的碱基主要也是四种,但它没有胸腺嘧啶(T),被尿嘧啶(U)所代替。组成核酸的碱基数量都是很大的,排列的顺序富有多样性。核替的糖上再连上一个磷酸,就成为核苷酸。很多核苷酸连接起来,就成为多核苷酸——核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA)。     

核糖核酸一级结构微量分析方法的研究 Ⅲ.萤光标记法测定寡核糖核苷酸3′端及核苷酸顺序

本文报导了一种新的萤光试剂DNS-GIy-NHNH_2在寡核糖核苷酸一级结构分析中的应用。寡核糖核苷酸3′端经高碘酸氧化后能与萤光试剂DNS-Gly-NHNH_2反应,经红酵母RNase 酶解后得到DNS-Gly-核苷腙。通过聚酰胺薄板层析鉴定DNS-Gly-核苷腙,从而能测定寡核糖核苷酸3′端核苷。另外,运用β消去循环,对寡核糖核苷酸进行化学逐步降解,在此基础上结合上述萤光标记测定寡核糖核苷酸3′端技术,对化学合成片段UpCpCpA 进行了顺序分析。片段用量为0.16A~(260)单位。这一方法较紫外吸收法灵敏,易在一般实验室中使用。     

核糖核酸一级结构微量分析方法的研究 Ⅲ.萤光标记法测定寡核糖核苷酸3′端及核苷酸顺序

本文报导了一种新的萤光试剂DNS-Gly-NHNH_2在寡核糖核苷酸一级结构分析中的应用。寡核糖核苷酸3′端经高碘酸氧化后能与萤光试剂DNS-Gly-NHNH_2反应,经红酵母RNase酶解后得到DNS-Gly-核苷腙。通过聚酰胺薄板层析鉴定DNS-Gly-核苷腙,从而能测定寡核糖核苷酸3′端核苷。另外,运用β消去循环,对寡核糖核苷酸进行化学逐步降解,在此基础上结合上述萤光标记测定寡核糖核苷酸3′端技术,对化学合成片段UpCpCpA进行了顺序分析。片段用量为0.16A_(260)单位。这一方法较紫外吸收法灵敏,易在一般实验室中使用。     

G蛋白调节剂和花柱S-核糖核酸酶对花粉管生长及其钙离子浓度的影响

以‘丰水’和‘幸水’梨花柱及花粉为试材,用激光共聚焦显微技术,研究了离体条件下G蛋白活性调节剂和花柱S-RNA酶对花粉管生长及其游离Ca~(2 )浓度的影响。结果表明:G蛋白激活剂CTX可促进花粉管生长,且可解除花柱S-RNA酶对自身花粉管生长的抑制作用;G蛋白抑制荆PTX和花柱S-RNA酶共同处理使异体的花粉管生长受到抑制。CTX处理使花粉管尖端区的[Ca~(2 )]_i明显升高,花柱S-RNA酶处理引起自身花粉管尖端区的[Ca~(2 )]_i梯度消失;CTX和花柱S-RNA酶共同处理则使自身花粉管内的[Ca~(2 )J_i表现出两者单独处理时的综合特征;而花柱S-RNA酶和PTX共同处理后,异体的花粉管内[Ca~(2 )]_i表现出先升高后下降的趋势。     

多聚核苷酸的合成与研究——Ⅵ.用于DNA无性繁殖研究的八脱氧核苷酸EcoRI接头的化学合成

用均三甲基苯磺酰氯(MS)作缩合剂,合成了带保护基的八脱氧核苷酸 dMMTr GpGpApApTpTpCpCp。B_2B_2B_2B2 AnAn脱去保护基后,经葡聚糖G-50凝胶过滤和7M尿素柱层析分离和纯化,得到双链的完全自身配对的八脱氧核苷酸 5′G—G—A—A—T—T—C—C—3′ 3′C—C—T—T—A—A—G—G—5′。经双向同系层析分析,核苷酸排列顺序符合实验设计要求。用Eco RI酶处理后,可以降解成小片段。     

肝癌的生化研究 Ⅰ.3’-甲基-4-二甲基氨基偶氮苯引起大白鼠肝癌癌变过程中核酸嘧啶化合物代谢酶系的变化

肿瘤组织的核酸代谢和正常组织有所不同,已有不少工作证实,Skipper,Bennett等观察到肿瘤组织利用甘氨酸、甲酸等小分子化合物合成核酸嘌呤的能力较正常组织强,而利用嘌呤碱、嘌呤核苷及嘌呤核苷酸的能力则不如正常组织。de Lamirande等发现核酸嘌呤化合物代谢酶系活力在大白鼠Novikoff肝癌组织和正常组织中有明显区别,如黄嘌呤氧化酶和尿酸酶活力在肿瘤组织中完全不能测到。但有关核酸嘧啶化合物在癌组织中代谢的报导则较少,Reichard和Skold曾报告艾氏腹水癌尿嘧啶核苷磷酸     

核糖核酸酶A超家族：不仅仅是一组降解RNA的酶

核糖核酸酶A超家族(ribonuclease A superfamily; RNase A superfamily),也称脊椎动物分泌型核糖核酸酶超家族(vertebrate secreted ribonucleases superfamily),是二十世纪蛋白质结构、酶学和分子进化领域研究最多最广泛的核糖核酸酶家族。自上世纪初期从牛胰腺中分离鉴定第一个成员以来，已从哺乳动物、两栖动物、爬行动物、鸟和鱼等几百种动物中鉴定了几千个成员。早期对该家族成员的研究不仅促进了蛋白质化学技术的发展，而且为现代生物学研究奠定了基础。目前已知人的核糖核酸酶A超家族成员包括8个典型成员(RNase 1～RNase 8)和5个非典型成员(RNase 9～RNase 13)。功能方面，曾一度以为该家族成员只具有降解核糖核酸的能力。随着血管生成素(angiogenin; RNase 5)、嗜酸性粒细胞衍生神经毒素(eosinophils-derived neurotoxin, EDN; RNase 2)、嗜酸性粒细胞阳离子蛋白(eosinophils cationic protein, ECP; RNase ...     

装载戊型肝炎病毒核酸片段的重组MS2噬菌体衣壳的制备及其特性研究

为制备一种可以实际应用于戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus,HEV)核酸检测的质控品,即装载戊型肝炎病毒核酸片段的重组MS2噬菌体衣壳(rHEPC)。根据装甲RNA技术原理,设计将MS2噬菌体基因组的5’端部分非编码区、成熟酶蛋白、衣壳蛋白以及部分复制酶起始位点等编码基因与HEV ORF2保守区部分基因序列串联并合成目标基因MS2-HEV。随后将MS2-HEV基因克隆、插入原核表达载体pET-28b中构建pET-28b-MS2/HEV重组质粒,转化大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3),经过1mM/L IPTG诱导培养4h后,SDS-PAGE鉴定表达情况;将验证的表达菌体超声破碎、离心、取上清、去除核酸杂质后再经超滤离心纯化、浓缩,电镜分析回收浓缩的rHEPC形态;梯度稀释rHEPC进行稳定性鉴定包括DNase I、RNase A抗性以及保存期三方面的稳定性试验检测。SDS-PAGE分析结果表明重组MS2-HEV基因获得有效表达,重组rHEPC纯度高无杂带;RT-PCR鉴定结果表明设计的HEV保守基因序列成功地被包装到重组rHEPC中。进一步的病毒颗粒稳定性试验结果表明制备的rHEPC能够有效抵抗高浓度的DNase I和RNase A的降解作用,并且在-20℃条件下可以持续保存7个月而无明显降解。上述结果表明制备的rHEPC达到了作为RNA病毒核酸检测阳性质控品的基本要求。     

人源化抗肝癌单链抗体与牛蛙核糖核酸酶融合基因的构建及表达

利用RT-PCR的方法从牛蛙肝脏中克隆牛蛙核糖核酸酶(RC—RNase)基因并进行序列测定;将人源化抗肝癌单链抗体(scFv)基因与RC—RNase基因相连接,制备scFv—RC—RNase融合基因表达质粒,转化大肠杆菌B121(DE3),用IPTG诱导进行表达。以SDS-PAGE和免疫印迹法对表达产物进行分析鉴定。序列分析表明,扩增出的RC—RNase基因片断大小约为405bpc,经SDS—PAGE和免疫印迹分析显示,scFv—RC—RNase融合基因表达质粒在大肠杆菌中的诱导表达产物出现相对分子质量约为38000的一条新生蛋白带,与预期结果相符。融合蛋白表达量占菌体总蛋白量的18．5％,主要以包涵体形式存在。表明成功地构建了抗肝癌scFv—RC—RNase融合基因,并在大肠杆菌中获得有效表达,为进一步进行肝癌的导向治疗研究奠定了基础。     

核酸碱基组成分析方法的研究——Ⅱ.核糖核酸中嘌呤和嘧啶衍生物的直接分光光度测定法

(一)核酸碱基在—定pH情况下产生(?)构并表現出不同的紫外綫吸收的特性。利用pH1和pH13的溶剂条件,在AGCU四种混合碱基体系中,由不同两处波长的光密度差值,可以求解出其中每种碱基的含量。本方法适用于合有AGCU四种碱基的提純核糖核酸样品,测定步驟簡单,重复性恆定,回收率在94～106%之間。(二)核酸样品經过氯酸降解后,降解液用蒸餾水稀释至相当于2.0N HClO_4的浓度。离心,吸取一定量的上清液,分別加入标准的HCl及NaOH溶液,調整酸碱度至相当于0.10N HCl(pH1)及0.10N NaOH(pH13)。酸液在249mμ,262mμ,274mμ和290mμ处,碱液在256mμ,258mμ,282mμ和290mμ处,分別用分光光度計测定光密度。测定溶液的适宜总浓度为60～160微克/5.0毫升。按下列公式計算混合体系中碱基的含量。U=0.194·△D(290_(13))-290_1·V A=0.108·△D_(262_1-282_(13))·V—0.221U G=0.198·△D_(249_1-258_(13))·V—0.542U C=0.127·△D_(274-256_(13))·V—0.133U AGCU为碱基的微克分子,V为測定溶液的体积毫升数。(三)核酸样品經1.0N HCl降解后,在嘌呤碱基和嘧啶核苷酸的混合体系內,可按以下公式求出胞嘧啶核苷酸或胞嘧啶含量。C=0.149·△D_(290_1-290_(13))·V C为碱基的微克分手数,V为测定溶液体积的毫升数。(四)在四种碱基不同时存在的体系中,本方法可用作为鉴定体系中的主要碱基种类,并可得到所合碱基的近似含量。