一种从PAXgene全血RNA管内提取基因组DNA的方法

目的:从同一生物样本同步提取RNA和DNA,能提高样本的利用率,而且对于基因组学、转录组学和表观遗传学检测数据之间的比对和匹配分析也十分重要。本研究在不影响RNA样品制备的前提下,建立一种从PAXgene全血RNA管内提取基因组DNA的方法。方法:取一定量PAXgene全血RNA管血液样本,使用QIAamp DNA试剂盒提取血细胞基因组DNA,系统优化提取过程中的离心参数、洗脱量以及初始血液样本量等实验参数,并对提取的基因组DNA质量进行检测。结果:用PAXgene全血RNA管3 mL血液样本能够提取出8.918±1.100μg基因组DNA,紫外分光光度计检测DNA样品的OD 260/280比值为1.89±0.09,琼脂糖凝胶电泳结果显示DNA样品完整无降解。结论:利用本方法提取的DNA样品能够满足下游DNA芯片、DNA甲基化测序等实验要求。该方法有助于从有限的临床血液样本中获取全面的遗传信息,并且提高后续不同实验方法所生成数据之间的可比性和匹配度。     

基于多重置换扩增技术的RNA病毒基因组扩增方法研究

为了便于新发或罕见病毒性传染病的筛查检测,本研究利用多重置换扩增技术,以负链RNA病毒—发热伴血小板减少综合征病毒和正链RNA病毒—登革病毒为模拟样本探索临床样本中RNA病毒基因组非特异性扩增方法。研究中通过梯度稀释的RNA病毒模拟样本中可能存在的不同丰度的病原体,样本核酸依次加工成单链cDNA、双链cDNA、T4DNA连接酶处理后的双链cDNA以及添加外源辅助RNA后合成并连接的双链cDNA形式,然后进行Phi29DNA聚合酶等温扩增,使用荧光定量PCR方法比较各种方法对RNA病毒核酸扩增的影响。结果显示,对于不同类型的RNA病毒模拟标本,多重置换扩增对于单链及双链cDNA的扩增效果有限,而双链cDNA经DNA连接酶处理后的扩增能达到6×103倍;在cDNA合成过程中加入外源辅助RNA,模拟样本中病毒基因组的扩增可达2×105倍,尤其是对含有低丰度病原体的模拟样本扩增效果的改善更为明显。本研究摸索建立了基于多重置换扩增技术的RNA病毒基因组扩增方法,能够对样本中低丰度RNA病毒基因组实现有效扩增,可满足开展多种病原体筛查检测的需求。     

应用RAPD技术鉴定地霉的实验研究

目的探讨RAPD技术在快速鉴定地霉中应用。方法用E.Z.N.A.yeastDNAkit提取地霉菌基因组DNA,采用随机引物AP3(5'-TCGTAGCCAA-3')、ATG(5'-ATGGATCGGC-3')、RP2(5'-AAGGATCAGA-3')、OPA-10(5'-GTGATCGCAG-3')对临床上致病性白地霉、林生地霉皮损株和血液株的基因组DNA进行扩增,对各病原菌的DNA指纹的特征进行分析。结果成功提取了地霉的基因组DNA,其纯度和浓度均能满足PCR反应的要求。利用4种引物对基因组DNA进行扩增,不同种真菌的DNA显示不同的DNA带型,分离自不同感染部位的同种不同株真菌的DNA显示的主要DNA带型基本一致。结论采用E.Z.N.A.yeastDNAkit提取的地霉基因组DNA可以用于PCR反应。RAPD法鉴定地霉菌简单、快速、特异,可用于临床诊断。     

黄地老虎颗粒体病毒cDNA文库的构建

以感染黄地老虎颗粒体病毒（Agrotis segetum ganulosis virus,AsGV)黄地老虎幼虫为材料提取总RNA,分离mRNA,并反转录合成cDNA ,构建了包括黄地老虎（Agrotis segetum,As)幼虫和黄地老虎颗粒体病毒的cDNA 文库。用Eco RI和HindⅢ限制性内切酶酶切AsGV基因组DNA,制备地高辛探针,与上述总RNA,mRNA,cDNA 杂交,从文库中筛选出AsGV的阳性克隆1081个,经cDNA测序,cDNA 编码序列与基因组编码序列相符。并根据基因组阅读框序列合成引物,PCR扩增出59个阅读框的编码基因,也完全与基因组序列相符。     

黄地老虎颗粒体病毒cDNA文库的构建

以感染黄地老虎颗粒体病毒(Agrotis segetum ganulosis virus,AsGV)的黄地老虎幼虫为材料提取总RNA、分离mRNA,并反转录合成cDNA,构建了包括黄地老虎(Agrotis segetura,As)幼虫和黄地老虎颗粒体病毒的cDNA文库.用EcoR Ⅰ和HindⅢ限制性内切酶酶切AsGV基因组DNA,制备地高辛探针,与上述总RNA、mR-NA、cDNA杂交,从文库中筛选出AsGV的阳性克隆1081个,经cDNA测序,cDNA编码序列与基因组编码序列相符.并根据基因组阅读框序列合成引物,PCR扩增出59个阅读框的编码基因,也完全与基因组序列相符.     

16S核糖体DNA宏基因组测序中细菌核酸提取方法的比较研究

目的:探究细菌核酸提取方法对16S核糖体DNA(r DNA)宏基因组测序的影响。方法:分别采用TRIzol提取、试剂盒提取、溶葡酶+试剂盒提取、超声波+试剂盒提取、超声波+溶葡酶+试剂盒提取、匀浆+试剂盒提取、匀浆+溶葡酶+试剂盒提取共7种方法对模拟样本进行细菌核酸提取,特异性地扩增16S r DNA的V1~V2高变区,测序后分析模拟样本中各种细菌的含量和相对分布。结果:超声波处理结合试剂盒提取方法中不同细菌数据分布及含量都相对均匀,是一种广谱、高效的细菌核酸提取方法。结论:超声波处理结合试剂盒提取方法适用于细菌宏基因组测序中样本核酸的提取。     

梅花类黄酮3'-羟化酶基因片段基于基因组DNA的简并PCR法克隆

用本研究设计的"预先去杂-SDS法"从梅花嫩叶提取到高质量的基因组DNA.根据11条已公开发表的并提交到GenBank的类黄酮3'-羟化酶基因cDNA的假定氨基酸序列的保守区设计2个正向简并引物和3个反向简并引物组成6对引物,仅有1对引物能以PCR法同时从梅花'南京红须'、'南京红'和'粉皮宫粉'的基因组DNA扩增到一个469 bp的核苷酸片段,这3个片段在总体上有99.72%的一致性,与11条类黄酮3'-羟化酶基因cDNA的相应区域有65.57%的一致性.同时,"GGEK"并非类黄酮3'-羟化酶的特征性模体.这是首次从木本植物的基因组DNA克隆到类黄酮3'-羟化酶基因片段.本研究结果可为梅花类黄酮3'-羟化酶基因全长的克隆奠定基础.     

几种提取白木香茎干总RNA方法的比较

目的:通过比较多种RNA提取方法,确定白木香茎干RNA提取的有效手段,为白木香伤害形成沉香药材的分子研究奠定基础。方法:取2年生白木香茎,分别用CTAB法、TRIzol法、异硫氰酸胍-SDS法、Qiagen试剂盒和Nor gen试剂盒法提取总RNA,通过琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度法测定其产量与质量,并通过cDNA合成及小样本克隆测序检查RNA的可用性。结果:异硫氰酸胍-SDS法及Norgen试剂盒法提出的RNA条带清晰,完整性好;D260nm/D280nm值可达2.0左右,纯度较高,其产量足够应用于cDNA合成;其他方法不能提出RNA。结论:异硫氰酸胍-SDS法及Norgen试剂盒法可用于白木香茎干RNA提取。     

不同来源的脱氧核糖核酸酶在基因表达量分析中应用效果的比较研究

目的：比较在基因表达量分析中使用不同来源的脱氧核糖核酸酶（DNase）去除样本中残留DNA的应用效果差异,为研究者根据自己的实验需求选择合适的DNase提供依据。方法：选择国内外广泛使用的3种DNase,分别为Invitrogen DNase,T擞aRaDNase和TiandzDNase。按照各种DNase的说明书对Trizol法提取的胎盘总RNA中残留DNA进行降解,定量方法采用实时荧光PCR测定反转录后的cDNA量。比较各种DNase对不同浓度RNA样本中残留DNA的处理效率、RNA损失量、操作时间及成本等。结果：三种DNase酶均能够完全降解不同残留量的DNA（10ng、100ng及1恤g）,实时荧光定量PCR均未检测到残留DNA。InvitrogenDNase对DNA的处理过程耗时最短,操作过程造成各种浓度RNA模板的损失量均最低,但成本最高;TaKaRaDNase处理的耗时居中,成本居中,RNA损失量最高,尤其对低浓度（〈100ng／μL）RNA样本;TiandzDNase处理的耗时最长,成本最低,RNA损失量居中,当模板浓度较高（〉500ng/μL）时,损失量相对减少。结论：不同来源的DNase在基因表达量分析中对样本处理的应用效果各不相同,在不同样本分析中可参考以下原则正确使用合适的DNase,以保证分析的顺利和结果的准确：对于RNA提取量较多的样本,三种DNase均可选择,但如考虑成本,首选TiandzDNase,如考虑耗时或RNA损失量,首选InvitrogenDNase,如既考虑耗时又考虑成本,可选TaKaRaDNase;对RNA提取量较少的血液或少量细胞（如单细胞）样本,应选择Invitrog—enDNase。     

猪FGL2基因cDNA末端序列检测及结构分析

检测猪FGL2基因cDNA末端序列并对该基因结构初步分析。α-32P dCTP放射性同位素标记cDNA探针筛选猪基因组DNA文库;cDNA末端快速扩增(rapid amplification of cDNA end,RACE)。以猪正常小肠及心脏组织提取新鲜总RNA,反转录后作为模板,设计基因特异性引物,采用Advantage 2 聚合酶混合物进行PCR扩增;依据猪与人FGL2基因3′端已知同源序列设计PCR上游引物,以人FGL2基因3′末端序列设计下游引物,以猪基因组DNA为模板采用Advantage 2 聚合酶混合物进行PCR反应;PCR载体重组质粒DNA亚克隆扩增。同位素探针未能筛选到特异阳性克隆,RACE反应检测到特异性转录起始位置及第一个转录终止位置,但仍未检测到第二个转录终止位置。猪基因组DNA行PCR扩增成功检测到猪FGL2基因3′末端未知序列及第二个转录终止位置。     

内含子中正筛选标记neo基因在转录中的剪切研究

目的:研究插入内含子中的正筛选标记基因neo在转录中的剪切情况。方法:克隆了猪血清白蛋白基因5'端调控序列,以猪基因组DNA为模板,P10/P11为引物,PCR扩增猪血清白蛋白基因翻译终止密码子后2.9kb的3'端调控序列;以pEGFP-1为模板,P400/P401为引物PCR扩增绿色荧光蛋白(EGFP)基因,插入猪血清白蛋白基因5'端调控区之后,在3'端调控序列的内含子中靠近N端的序列中插入正筛选标记基因neo,构建了表达EGFP的真核表达载体pEXp11。转染人肝癌细胞系HepG2,通过G418药物筛选获得稳定转染的抗药性细胞克隆。提取抗性细胞克隆基因组RNA并进行反转录,获得cDNA序列。结果:用引物D400/D401及分别位于neo基因和3'端调控序列上的一对引物D394/D357进行PCR检测,其中D394/D357并未扩增出目的条带。结论:插入内含子中的neo基因在转录过程中可随内含子一起被剪切。     

人体蠕形螨的DNA提取与随机引物PCR检测

【目的】探索人体毛囊蠕形螨和皮脂蠕形螨DNA的提取方法。【方法】采用液氮反复冻融研磨法破碎螨体细胞, 选用改良小昆虫DNA提取法、碱裂解法和试剂盒提取法, 分别提取冻存时间在5个月内和8~10个月的毛囊蠕形螨和皮脂蠕形螨基因组DNA, 并用随机引物PCR方法进行检测。【结果】蛋白核酸测定仪检测结果显示, 试剂盒法提取的DNA纯度较高、量较多, 明显优于改良小昆虫法和碱裂解法。随机引物扩增结果显示清晰的DNA指纹图谱, 两种人体蠕形螨DNA指纹具有明显差异。蠕形螨冻存时间影响DNA提取的量, 但对DNA提取的纯度和RAPD指纹图谱影响较小。不同DNA提取方法提取的同一种蠕形螨DNA指纹图谱基本相似, 试剂盒法和改良小昆虫法提取的DNA样本条带多而清晰, 碱裂解法提取的样本条带少而模糊。【结论】液氮反复冻融研磨法破碎蠕形螨细胞是有效的, 蠕形螨冻存时间不宜超过6个月, 试剂盒提取法是提取蠕形螨DNA的好方法。RAPD技术可以用于这两种人体蠕形螨DNA分子水平上的检测和分类。     

肝癌组织及细胞系总RNA抽提逆转及基因克隆方法的改进与比较

本文建立了高效肝组织及细胞总RNA抽提、反转录以进行基因克隆和实时定量PCR（q-RT-PCR）的方法。 比较了2种反转录酶(M-MLV和SuperScriptII)、2种cDNA合成引物(Oligo dT和random 6 primer)对总RNA反转录效率的影响,与4种DNA聚合酶（Taq聚合酶、Pfu聚合酶、LA taq聚合酶、Prime Star聚合酶）进行长片段基因克隆的能力及效率;同时,该研究比较了不同质量总RNA对有效进行q-RT-PCR与长片段分子克隆的影响。新建立的RNA提取方法使得RNA完整性和均一性提高。RNA的完整性及均一性对长片段cDNA的克隆至关重要。部分降解的组织RNA及细胞RNA仅适合于q-RT-PCR检测mRNA的表达水平,而不适合于cDNA的克隆。     

一种自制DNA提取剂在微量细胞和单个囊胚上的应用

目前微量DNA的提取方法,不仅操作繁琐耗时,而且所需试剂价格昂贵。为了解决这个问题,本研究旨在开发一种快速、经济的微量DNA提取剂。用自制提取剂快速提取50个、100个、500个、5 000个、50 000个猪胎儿成纤维细胞的基因组DNA。经PCR扩增,电泳结果显示:自制提取剂可有效提取数量低至50个的猪胎儿成纤维细胞。分别采用自制提取剂、酚氯仿以及试剂盒3种方法提取猪单个囊胚基因组DNA,结果显示:酚氯仿方法提取的单个囊胚基因组DNA,经PCR扩增后,并没有检测到目的条带;而自制提取剂提取模板DNA,能直接扩增出清晰的目的条带,与试剂盒扩增效果相当。自制提取剂能够快速、有效地提取少量细胞和单个囊胚的基因组DNA,满足下游分子生物学研究需要,因此,本研究为微量样本基因组DNA提取提供帮助。     

骨骼肌特异表达线虫ω-3脂肪酸去饱和酶基因载体的构建与验证

根据猪α-actin基因已知DNA序列设计合成了两个特异性引物,以猪基因组DNA为模板,通过PCR扩增得到α-actin 5'调控序列,然后与线虫ω-3脂肪酸去饱和酶基因cDNA、去除CMV启动子的表达载体pcDNA3.1连接构成肌肉特异性表达载体pcDNA3.1-AF,小鼠股四头肌注射该重组载体,RT-PCR检测证明...     

油梨基因组DNA提取、SSR-PCR反应体系优化及引物筛选

旨在建立稳定可靠的油梨(Persea americana Mill)叶片DNA的提取方法和SSR-PCR反应体系及筛选出稳定的油梨SSR多态性引物,为开展油梨种质SSR分子标记提供遗传研究的基础。以油梨叶片为试材,比较3种油梨叶片DNA提取方法 ;利用L16(45)正交实验设计对油梨SSR-PCR反应体系进行优化;利用优化的反应体系筛选引物;同时,选取5对多态性引物对45份油梨种质进行PCR扩增,进一步检测该优化体系的稳定性。结果表明,常规2×CTAB法、改良2×CTAB法和植物DNA提取试剂盒法等3种DNA提取方法中,改良2×CTAB法对油梨基因组DNA的提取效果最佳;获得最优反应体系为:20μL总反应体系中,含约40 ng DNA模板、1.5 mmol/L Mg~(2+)、0.15 mmol/L d NTPs、0.5 U Taq DNA聚合酶、0.5μmol/L引物;以此体系为基础进行引物筛选,从73对油梨SSR引物中筛选出了30对扩增条带清晰的多态性引物,说明该反应体系可用于油梨SSR标记的进一步研究;稳定性检测获得的谱带清晰,表明该优化反应体系是稳定可靠的。由此可见,改良的2×CTAB法可用于油梨叶片DNA的大量样本提取,优化后的SSR-PCR反应体系及筛选出的30对多态性引物可用于油梨SSR标记的进一步研究。     

中国家蚕抗菌肽基因CBM1全长cDNA序列测定及其基因结构分析

用大肠杆菌感染中国家蚕（Bombyx mori）蛹,从中提取总RNA,用RT-PCR方法获得蚕抗菌肽基因CBM1 cDNA部分片段并克隆测序,以此蚕抗菌肽基因CBM1的部分片段,设计特异性引物,用3’、5’RACE的方法,获得蚕抗菌肽基因CBM1 cDNA的全长序列;用PCR的方法,从中国家蚕蛹基因组DNA获得抗菌肽CBM1基因的700bp、1100bp左右的2个片段,初步证实中国家蚕抗菌肽基因在单倍体染色体中至少存在2个拷贝。     

玉米雄性不育细胞质特异DNA片段的发现及差异展示

利用3对线粒体引物对玉米同核异质和同质异核不育系的基因组总DNA进行PCR扩增;对检测到多态性的引物,再分别对供试材料小孢子发育至四分体、单核期和双核期的花药总RNA进行差异显示分析。结果表明：以基因组总DNA为模板,引物P1-P2在所有供试不育材料都有一相同的特异扩增带,而在保持系中均无扩增;引物P3-P4在所有供试材料中均无扩增;引物P5-P6仅在保持系黄早四中有扩增,而在其他供试材料中无扩增。这一结果说明以P1-P2为引物所检测到的特异扩增带为所有供试不育细胞质所特有,且不受供试材料不同核背景的影响。对于在不育材料基因组总DNA中具有特异扩增的引物P1-P2,进一步以cDNA为模板进行PCR扩增（RT-PCR）,所有不育材料在小孢子发育的3个时期均有一相同的特异扩增带,而保持系在小孢子发育的相应时期均无扩增,说明以P1-P2为引物所检测到的转录本的大小和数目,在同核异质及同质异核不育材料间均表现一致,且不受小孢子发育时期的影响。这说明以P1-P2为引物所检测到的不育材料DNA水平的共同结构特点在小孢子发育中具有转录上的一致性,因此可以认为供试不育细胞质DNA水平的这一特异序列结构与雄性不育性状的表现有关。     

鹌鹑肠道微生物PCR-DGGE方法的优化

通过对鹌鹑肠道微生物总DNA不同提取方法的效率进行比较,探讨DNA质量以及PCR-DGGE反应条件对研究鹌鹑肠道微生物多样性的影响。本试验利用常规的饱和苯酚/氯仿法和3种试剂盒(QIAGEN试剂盒、上海生工试剂盒、天根试剂盒)方法提取鹌鹑肠道微生物总DNA,分别以细菌V3可变区引物和V6-V8可变区引物以及不同退火温度进行PCR-DGGE分析。QIAGEN试剂盒法提取的肠道微生物总DNA的A260/A280值在1.8-1.9之间,浓度约200 ng/μL,DGGE微生物多样性条带均匀度均高于其他3种提取方法。此外,利用不同引物扩增的DGGE图谱发现,以V6-V8可变区引物扩增的DGGE图谱条带均匀,分离充分,较V3可变区更能反映鹌鹑肠道微生物种群的多样性;同时,随PCR退火温度的升高,V6-V8可变区的微生物多样性指数下降,V3可变区的微生物多样性则无明显变化。     

野生山梨基因组DNA提取方法和部位比较

以野生山梨(Pyrus ussuriensis Maxim)嫩叶、一年生枝韧皮部和成熟叶片为材料,分别用CTAB,改良CTAB+高盐+5%PVP和试剂盒3种方法提取基因组DNA,通过测OD值、DNA琼脂糖凝胶电泳和SSR引物扩增检验.结果表明:韧皮部和嫩叶是最理想的提取DNA材料,改良CTAB法是比较理想的方法,试剂盒是提取DNA最简便快捷的有效方法.