抑制eIF3I蛋白的泛素化降解促进人宫颈癌细胞增殖

目的:研究eIF3I蛋白在细胞中的泛素化修饰,阐明其对人宫颈癌细胞系Hela增殖的影响.方法:通过点突变技术获得突变体K282R,与野生型eIF3I比较泛素化的水平,研究细胞内的泛素化修饰调控.经流式细胞仪分析细胞周期,研究野生型蛋白eIF3I和突变体K282R对Hela细胞的细胞周期影响.再从周期蛋白水平研究eIF3I对细胞增殖的调控作用.结果:突变体K282R比野生型eIF3I蛋白的外源表达量大.在Hela细胞中K282R突变体的泛素化水平低,抑制了该蛋白的泛素-蛋白酶体途径降解.过表达eIF3I能上调周期蛋白Cyclin D1的表达量,促进细胞进入由G1期进入S期.同时,泛素化程度低的突变体K282R具有较强的促进细胞增殖的作用.结论:抑制eIF3I的泛素-蛋白酶体途径降解能上调周期蛋白CyclinD1的表达,促进肿瘤细胞增殖,提示eIF3I在细胞增殖和肿瘤发生发展中发挥作用.     

Cancer Cell揭示泛素化信号调节细胞选择性自噬的分子机制

<正>2014年7月15日,Cancer Cell在线发表了中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所胡荣贵研究组与多家单位合作的研究新成果:具有肿瘤抑制活性的泛素连接酶HACE1,通过介导细胞自噬受体蛋白Optineurin(OPTN)的泛素化修饰,促进细胞自噬受体复合物形成,"激活"细胞自噬,从而抑制肿瘤细胞增殖的分子机制。该研究团队发现具有肿瘤抑制活性的泛素连接酶HACE1能够与自噬受体蛋白OPTN蛋白直接相互作用,并催化OPTN的多泛素化,被泛素化的     

维生素K3通过调控Ras信号通路抑制前列腺癌细胞增殖

摘要 目的：研究维生素K3对前列腺癌细胞增殖的影响及其机制。方法：CCK-8检测维生素K3对前列腺癌细胞系增殖的影响;应用siRNA干扰Siah2表达之后,CCK-8检测维生素K3对前列腺癌细胞系增殖的影响;Western Blot检测维生素K3对前列腺癌细胞Siah2和Spry2表达的影响;免疫共沉淀技术检测维生K3对Siah2介导的Spry2泛素化水平的影响;Western Blot检测维生素K3对Ras信号通路中pERK表达的影响;构建裸鼠皮下前列腺癌模型,研究维生素K3对肿瘤生长的影响。结果：维生素K3抑制前列腺癌细胞系增殖,并且维生素K3浓度越高,对细胞抑制增殖作用越明显。前列腺癌细胞中干扰Siah2表达后,10 μM维生素K3对细胞增殖无明显抑制作用即维生素K3对前列腺癌细胞增殖抑制作用依赖Siah2。10 μM维生素K3能减弱Siah2对Spry2的泛素化水平使Spry 2表达升高。维生素K3能使前列腺癌细胞中Ras信号通路中的pERK蛋白表达降低。动物实验显示维生素K3治疗12天后,对照组和维生素K3组间肿瘤体积大小具有统计学差异,说明维生素K3能够有效地抑制裸鼠皮下前列腺癌生长。结论：维生素K3通过抑制Siah2泛素连接酶活性,介导其底物Spry2表达升高,进而抑制Ras/Raf/MEK/ERK信号通路起到抑制前列腺细胞增殖作用。     

鳞盖肉齿菌的抗肿瘤细胞增殖活性及抗肿瘤细胞增殖机制的研究

为了从鳞盖肉齿菌(Sarcodon scabrosuskarst)的二氯甲烷提取物中分离纯化得到Sarcodonin G,对Sarc-odonin G进行抗肿瘤细胞增殖活性及其抗肿瘤细胞增殖机制的研究。本文利用MTT实验法测定Sarcodonin G对HeLa细胞株增殖的抑制率,检测其抗肿瘤细胞增殖的效果;利用流式细胞术检测Sarcodonin G对HeLa细胞的凋亡的影响;利用电镜技术观察Sarcodonin G对HeLa细胞形态学改变。结果发现,Sarcodonin G对体外培养的HeLa细胞的增殖具有明显抑制作用,其IC50为7.19μmol/L,并有较好的剂量依赖关系;流式细胞学检查发现Sarcodonin G处理后的HeLa细胞出现凋亡现象;超微结构发现Sarcodonin G处理后的HeLa细胞的胞核染色质浓缩,边集,核固缩及形成新月体,线粒体肿胀,空泡样变,胞浆出现大量空泡等凋亡的形态学改变。结果表明,鳞盖肉齿菌的纯化物Sarcodonin G能抑制体外培养的HeLa细胞的增殖,并初步推测Sarcodonin G有可能是通过诱导HeLa细胞的凋亡来实现其抗肿瘤增殖作用的。     

PDGF-BB下调血管平滑肌标志物SM22α表达的机制

血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cell,VSMC）表型转化是血管重塑性疾病的细胞病理学基础,血小板源性生长因子（platelet-derived growth factor,PDGF）-BB抑制平滑肌分化标志基因表达、加速其降解,是VSMC表型转化的关键。该研究用PDGF-BB刺激VSMC诱导细胞发生表型转化,利用Western blot和免疫共沉淀等技术,检测PDGF-BB对早期分化相关基因平滑肌22 alpha（smooth muscle 22 alpha,SM22α）磷酸化与泛素化的影响。实验结果显示,PDGF-BB促进VSMC增殖;上调增殖相关蛋白PCNA的表达,下调分化相关蛋白SM22α与SMα-actin的表达;诱导SM22α发生磷酸化和泛素化,而且,该过程与SM22α水平下调具有时相相关性;抑制剂阻断分析证实,ERK和PKC参与介导了PDGF-BB诱导的SM22α磷酸化。以上结果提示,在VSMCs表型转化中,PDGF-BB可能是通过激活ERK-PKC信号通路,促进SM22α的磷酸化和泛素依赖的蛋白质降解。     

siRNA抑制c—myc基因的表达对宫颈癌细胞增殖的影响

目的：利用siRNA（small interference RNA）技术研究C-myc基因的对宫颈癌HeLa细胞增殖的影响。方法：依据Promega公司在网上提供的设计软件,设计针对C-myc基因的siRNA,合成DNA模板,体外转录合成siRNA。通过阳离子聚合物jet—SITM—ENDO将合成的siRNA转染入HeLa细胞,以未转染细胞以及错义序列siRNA—scr转染细胞为对照。用细胞计数法检测siRNA对HeLa细胞增殖的影响。流式细胞法检测细胞周期及蛋白表达的变化,RT—PCR法比较转染前后C-myc mRNA表达水平的变化。结果：细胞计数法结果显示,转染24h后c-myc基因siRNA明显抑制MCF-7细胞增殖,转染48h后,抑制效率稳定。c-myc基因siRNA转染后能有效地抑制HeLa细胞的增殖,阻滞细胞周期于G0／G1期,siRNA转染组c-myc mRNA、蛋白的表达量明显低于空白对照组、错义序列组。结论：体外转录合成的siRNA可有效降低HeLa细胞c-myc基因的表达,抑制细胞增殖。     

敲除含α-Arrestin结构域蛋白3对肾癌细胞PI3K/AKT信号通路及增殖能力的影响

目的:探究敲除含α-Arrestin结构域蛋白3 (α-Arrestin-Domain-Containing-3,ARRDC3)对肾透明细胞癌786-O细胞PI3K/AKT信号通路和增殖能力的影响及作用机制。方法:使用Crispr-Cas9技术构建稳定敲除ARRDC3的786-O细胞系;通过免疫印迹检测敲除ARRDC3对AXL蛋白水平的影响;借助免疫沉淀技术研究敲除ARRDC3对AXL泛素化水平的影响;利用免疫印迹、shRNA干扰蛋白表达技术和及构建的敲除ARRDC3细胞检测ARRDC3和AXL表达水平对PI3K/AKT信号通路活性的影响;CCK-8技术检测ARRDC3和AXL表达水平对肾癌细胞增殖能力的影响。结果:与野生型786-O细胞相比,稳定敲除ARRDC3的786-O细胞内AXL的蛋白水平显著升高。进一步检测细胞内AXL的泛素化水平发现,ARRDC3稳定敲除组细胞内AXL蛋白的泛素化水平显著降低;免疫印迹和CCK-8实验结果显示,敲除ARRDC3会显著增加AXL/PI3K/AKT信号通路磷酸化和细胞增殖能力,而在ARRDC3缺陷细胞内降低AXL蛋白的表达,会导致AXL/PI3K/AKT的活性和细胞增殖能力恢复到与野生型相似的水平。结论:在786-O细胞内敲除ARRDC3可通过降低ARRDC3对AXL的泛素化降解,上调AXL蛋白水平和PI3K/AKT信号通路的活性,并促进肾癌细胞的增殖。     

掌叶半夏有效提取物对宫颈癌细胞株增殖的抑制作用

目的既往的临床研究证实中药掌叶半夏可有效治疗宫颈癌。在此基础上,课题组观察了中药掌叶半夏有效提取物(Pinellia Extract,PE)对宫颈癌细胞株CaSki和HeLa细胞增殖的作用,先前采用MTT法检测细胞活性以及倒置相差显微镜观察细胞形态的变化,初步显示了PE对CaSki和HeLa细胞的增殖有抑制作用;本文将对PE的增殖抑制作用进行进一步的研究。方法采用扫描电镜和透射电镜观察PE作用后CaSki和HeLa细胞表面及内部超微结构的变化,In-cell Western blot检测不同浓度PE作用15min后CaSki和HeLa细胞磷酸化ERK的表达。结果0.15mg/mlPE作用24h后CaSki和HeLa细胞表面结构及内部结构均发生了显著的变化,提示细胞增殖受到抑制;不同浓度PE作用15min后CaSki和HeLa细胞磷酸化ERK的表达随PE浓度的增加逐渐下降。结论PE对CaSki和HeLa宫颈癌细胞株的增殖有明显抑制作用,表现在细胞表面及内部超微结构的变化;增殖抑制作用之一是阻断ERK的磷酸化。实验结果为进一步研究PE的抗宫颈癌作用机制以及新药的研制开发奠定了一定的理论依据和实验基础。     

泛素信号途径、自噬受体与细胞选择性自噬

蛋白质泛素化是真核生物细胞内蛋白质合成后最重要和最普遍的修饰方式之一。发生在蛋白质底物上的泛素化,由于其泛素化方式及形成泛素链的连接形式的多样性,又统称为泛素信号途径。研究表明,泛素信号途径对蛋白质的调节作用分为降解相关和非相关的两种。细胞内蛋白质的降解主要通过泛素-蛋白酶体或溶酶体-自噬途径来完成。一般认为,通过泛素-蛋白酶体降解的蛋白质具有很强的选择性,而通过溶酶体-自噬途径降解的蛋白质一般选择性较差。然而,近年来,细胞自噬受体如p62等的发现则表明细胞自噬同样具有很强的选择性,这一类由细胞自噬受体介导的细胞自噬被称为细胞选择性自噬(Selective autophagy)。蛋白质泛素化及降解调控几乎所有类型的细胞活动;与之对应的是,蛋白质泛素化及降解异常与包括肿瘤在内的多种人类疾病的发生发展密切相关。本文综述了泛素信号途径调控蛋白质通过蛋白酶体或自噬途径降解的基本过程和部分最新进展,并结合本实验室的研究成果介绍泛素化修饰细胞自噬受体调控细胞选择性自噬的新机制。     

MDM2与端粒保护蛋白1的相互作用及其功能

目的:探究鼠双微体2同源体(MDM2)与端粒保护蛋白1(POT1)在细胞水平是否有相互作用,及其是否发挥E3泛素化连接酶的功能。方法:首先,用蛋白酶体抑制剂MG132处理稳定表达Flag-POT1的HeLa细胞,Western印迹检测Flag-POT1的表达情况;其次,在HeLa细胞中转入外源的Myc-MDM2和Flag-POT1质粒,48 h后收集细胞,通过免疫共沉淀方法验证Myc-MDM2和Flag-POT1是否具有相互作用;再次,在稳定表达Flag-POT1的HeLa细胞中转入Myc-MDM2或MDM2 siRNA,48 h后收集细胞,Western印迹检测Flag-POT1的表达水平。结果:MG132处理后,Flag-POT1的表达量明显升高且有拖尾现象,免疫共沉淀显示Myc-MDM2和Flag-POT1具有相互作用,但无论转入Myc-MDM2还是MDM2 siRNA,Flag-POT1的表达水平没有明显变化。结论:POT1通过泛素化途径降解,MDM2与POT1具有相互作用,但MDM2不是POT1主要的E3泛素化连接酶。     

Ⅰ型磷酸酶抑制亚基-1对人宫颈癌HeLa细胞增殖的抑制作用

PPI1(Inhibitor-1 ofprotein phosphatase 1)是I型磷酸酶的抑制亚基之一,其活化依赖于35位苏氨酸蛋白激酶(PKA)的磷酸化而发挥抑制作用.本研究目的在于探讨PPIl持续活化型突变体的表达对人宫颈癌细胞株增殖的影响及其可能的作用机制.利用PPI1野生型和活化型突变体表达质粒分别转染HeLa细胞,首先通过H~3TdR掺入实验、迁移实验观察PPI1基因对HeLa细胞增殖能力的影响,研究结果表明:在活化型突变体表达的HeLa细胞株中,细胞~3H掺入量和迁移能力明显受抑.其次通过流式细胞术、Giemsa染色法分析PPIl对HeLa细胞的细胞周期的影响;FACS分析表明HeLa细胞G2/M期比例明显升高;经脱氧胸苷同步化后,该组细胞进入有丝分裂期明显滞后.最后利用Western blot分析PPI1对MAPK信号转导通路的影响,Western blot分析显示该组细胞的ERK磷酸化水平明显下降.研究表明PPI1活化型突变体的表达可抑制人宫颈癌细胞株的增殖,这与其诱导HeLa细胞G2/M期停滞、有丝分裂的进入延缓有关,其中涉及到MAPK信号转导通路的活化受抑制.     

M-CSF上调cyclinD1/D3和CDK2/6的表达促进HeLa细胞增殖

非分泌型巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)的表达在肿瘤的发生发展过程中发挥重要作用,为探讨胞质M-CSF对细胞增殖的影响,采用基因重组技术构建胞内稳定表达M-CSF的HeLa细胞系,以空载体(pCMV/myc/cyto)转染HeLa细胞和未转染HeLa细胞作为对照,MTT法及反义寡核苷酸抑制实验分析M-CSF对细胞增殖的影响,并计算细胞倍增时间,RT-PCR观察胞内M-CSF对G1期细胞周期相关蛋白的影响．结果显示,与对照组比较,转染M-CSF的HeLa细胞倍增时间明显缩短、增殖能力显著增强,M-CSF的特异性反义寡核苷酸能抑制转染M-CSF的HeLa细胞的增殖,且抑制率随着反义寡核苷酸浓度的增高而增强,转染M-CSF 的HeLa细胞的cyclinD1/D3和CDK2/6 mRNA表达显著升高(P < 0.05)．提示：M-CSF可上调cyclinD1/D3和CDK2/6的mRNA表达,促进HeLa细胞的增殖．     

VD通过VDR下调β-catenin磷酸化水平抑制胃癌细胞增殖

为探讨维生素D(vitamin D, VD)及维生素D受体(vitamin D receptor, VDR)对胃癌细胞增殖的作用及分子机制,该研究首先通过免疫荧光实验观察胃癌细胞SGC-7901和MKN-45中VDR的表达水平,进一步利用shRNA干扰慢病毒转染两种胃癌细胞,嘌呤霉素筛选建立shVDR稳定株,应用CCK8及细胞集落形成实验,流式细胞学实验, Western blot实验检测VD/VDR在两种胃癌细胞恶性表型增殖及细胞周期中的作用;最后再次应用Western blot实验检测VD/VDR对胃癌细胞中β-catenin磷酸化表达水平的影响。结果表明两种胃癌细胞均表达VDR;在配体骨化三醇(1α,25(OH)_2D_3)存在的情况下,胃癌细胞的增殖和集落形成受到明显抑制,同时抑制β-catenin的磷酸化水平,但对细胞周期分布及细胞周期蛋白Cyclin D1无明显作用。下调VDR的表达水平后, VD对β-catenin磷酸化表达水平无明显影响。证实VDR通过下调β-catenin的磷酸化水平,发挥抑制胃癌细胞增殖的作用。     

模式识别受体激活状态对小胶质细胞p38-MAPK磷酸化水平的影响

为了探讨小胶质细胞模式识别受体（pattern recognition receptor,PRR）激活状态对Aβ42诱导下的细胞应激性p38丝裂原活化蛋白激酶（p38-mitogen activated protein kinase,p38-MAPK）磷酸化及细胞吞噬能力的影响,在不同模式识别受体（SRA,TRL2,SRB,CD36）的抗体存在的条件下用寡聚物Aβ42蛋白（oAβ42）孵育并活化小胶质细胞,测定细胞活化后的p38-MAPK激酶磷酸化水平和小胶质细胞模式识别受体TLR2的阻断对细胞Aβ42吞噬量的影响。结果发现,与正常小胶质细胞对比,模式识别受体SRA（scavenger receptor A）及TLR2受体（toll-like receptor 2）被相应抗体阻断的小胶质细胞在受到Aβ42蛋白激活时,p38-MAPK的磷酸化水平显著降低;TLR2受体被其抗体阻断后小胶质细胞对Aβ42的吞噬量降低,说明该模式识别受体激活状态影响胶质细胞吞噬能力,该过程与p38-MAPK的磷酸化水平相关。而受体内吞抑制剂对小胶质细胞的Aβ42蛋白的吞入量没有显著影响,说明上述细胞对寡聚物Aβ42的吞入过程并非经典的受体内吞过程。TLR家族受体有望成为阿尔茨海默病(Alzheimei Disease, AD)免疫治疗的潜在治疗靶标。     

肿瘤抑制因子CYLD对细胞功能的调控作用

肿瘤抑制因子（cylindromatosis,CYLD）是一种在体内广泛分布的去泛素酶,其包含去泛素化酶结构域和富含甘氨酸细胞骨架相关蛋白结构域,前者可通过去泛素化信号分子,调控细胞信号传导途径,后者主要通过对微管的调节,改变多聚化和乙酰化过程,进而调控其组装和排列。CYLD主要通过对信号传导和细胞骨架的调节,从而调控细胞增殖、细胞凋亡、细胞运动和细胞分化等细胞功能。该文对近年来肿瘤抑制因子CYLD对细胞功能调控的研究进行概述。     

siRNA抑制c-myc基因的表达对宫颈癌细胞增殖的影响

目的:利用siRNA(small interference RNA)技术研究c-myc基因的对宫颈癌HeLa细胞增殖的影响.方法:依据Promega公司在网上提供的设计软件,设计针对c-myc基因的siRNA,合成DNA模板,体外转录合成siRNA.通过阳离子聚合物jet-SITM-ENDO将合成的siRNA转染入HeLa细胞,以未转染细胞以及错义序列siRNA-scr转染细胞为对照.用细胞计数法检测siRNA对HeLa细胞增殖的影响.流式细胞法检测细胞周期及蛋白表达的变化,RT-PCR法比较转染前后c-myc mRNA表达水平的变化.结果:细胞计数法结果显示,转染24h后c-myc基因siRNA明显抑制MCF-7细胞增殖,转染48h后,抑制效率稳定.c-myc基因siRNA转染后能有效地抑制HeLa细胞的增殖,阻滞细胞周期于G0/G1期,siRNA转染组c-myc mRNA、蛋白的表达量明显低于空白对照组、错义序列组.结论:体外转录合成的siRNA可有效降低HeLa细胞c-myc基因的表达,抑制细胞增殖.     

东北红豆杉(Taxus cuspidata)中四种紫杉烷类化合物抑制妇科肿瘤细胞增殖活性研究及其作用机制的初步探讨

通过四唑盐(MTT)比色法检测东北红豆杉中四种紫杉烷类化合物对人子宫颈癌细胞、人子宫内膜癌细胞、人卵巢透明癌细胞和人卵巢囊腺癌细胞增殖的影响,不仅探讨了这些化合物作用的构效关系,还初步探讨了其抑制肿瘤细胞增殖的作用机制。结果发现9,10-去乙酰紫杉宁对人子宫颈癌细胞、人子宫内膜癌细胞和人卵巢囊腺癌细胞的增殖均有明显的抑制作用,与紫杉宁和1β-羟基紫杉宁即使在100μmol/L的高浓度下,对五种妇科肿瘤细胞的增殖不显示抑制活性;流式细胞学检查发现9,10-去乙酰紫杉宁作用后的HeLa细胞出现凋亡现象。因此推测:1.C-9,10位的羟基和C-5位的肉桂酰基侧链是该类化合物抑制肿瘤细胞增殖所必需的;2.9,10-去乙酰紫杉宁有可能是通过诱导肿瘤细胞凋亡来实现其抑制HeLa细胞的增殖作用。     

原癌蛋白c-Cbl促进受体酪氨酸激酶EphA2的降解

c Cbl最近被证明是泛素 蛋白酶体 (ubiquitin proteasome)通路中的一个新的RINGFinger型泛素连接酶 (ubiquitinligase ,E3) .c Cbl可以介导受体酪氨酸激酶和非受体酪氨酸受体激酶的降解 .利用内源性表达较高EphA2的大肠癌细胞株HCT1 1 6 ,通过转染野生型c Cbl和显性负变异体(dominantnegativemutant)c Cbl 70Z ,探讨c Cbl在EphA2降解中的作用 .结果显示 ,c Cbl可促进磷酸化EphA2的降解 ,EphA2的降解必须依赖其配体ephrin A1的刺激 ;利用蛋白酶体 (proteasome)抑制剂MG1 32可抑制磷酸化的EphA2降解 ,提示EphA2的最终降解部位是在蛋白酶体 .研究的结果提示 ,c Cbl作为泛素连接酶诱导磷酸化后的EphA2在蛋白酶体中降解     

miR-124和miR-520b下调Eps8表达并抑制HeLa细胞增殖

Eps8是一个多功能的信号分子,参与肌动蛋白重排、受体内吞和肿瘤的发生发展. 为了寻找靶向Eps8的microRNAs (miRNAs)并研究其在宫颈癌中的调控作用,本文采用软件预测获得4个可能调控Eps8表达的miRNAs. 利用双荧光素酶报告系统和Western印迹研究发现,miR-124 和miR-520b结合到人EPS8 mRNA的3′非翻译区(untranslated region, UTR)并有效抑制Eps8蛋白的表达. 进一步细胞存活检测、MTT法和克隆形成实验分析显示,miR-124和miR-520b过表达显著抑制HeLa细胞的生长和增殖.而且,miRNA调节的Eps8下调能提高HeLa细胞对化疗药物顺铂的敏感性. 同时证明,miR-124和miR-520b激活肿瘤抑制基因p53与下游基因p21报告基因转录活性,也相应地上调了p53与p21的蛋白表达. 这些结果提示,miR-124和miR-520b下调癌基因EPS8表达,从而抑制HeLa细胞增殖,负调控宫颈癌细胞生长.     

泛素化和磷酸化协同作用调控蛋白质降解

在真核细胞中,泛素化和磷酸化是2种常见的蛋白质修饰方式。泛素在蛋白酶体降解途径中发挥重要的靶向作用,细胞外信号严格调控着目的蛋白的泛素化。在很多情况下,这种调控依赖于蛋白质的磷酸化。由磷酸化影响的调控步骤可能与E3泛素连接酶对底物的识别有关,也可能与实际的交联反应有关。这种调控是通过对底物或E3连接酶本身的磷酸化实现的。