抗CD52单克隆抗体HPLC-肽图分析方法的建立

建立高效液相色谱(HPLC)-肽图分析方法,用于抗人CD52单克隆抗体的专属性鉴别。抗CD52单抗样品经盐酸胍变性、DTT还原,释放出的游离半胱氨酸残基进行烷基化。超滤置换酶切缓冲液后进行胰蛋白酶酶切并终止。色谱条件:采用Eclipse XDB-C18 4.6×250 mm 5μm(Aglient)色谱柱,0.1%TFA水溶液与0.1%TFA乙腈溶液为流动相,梯度洗脱,检测波长为214 nm,柱温为30℃;质谱条件:分析时长135 min;检测方式正离子,TOF;MS+扫描范围350-1 500 Da;Product Ion+扫描范围100-1 500 Da;质谱分辨率40 000;Exceeds,150 Cps。CD52单抗重链CDR1、CDR3、轻链CDR1对应肽段由质谱鉴定出。HPLC-肽图方法专属性验证显示辅料制剂及异种抗体对检测结果无干扰;精密度验证结果显示目标峰的峰面积RSD%均在1.7%-7.6%之间。且目标峰的保留时间RSD%均在0.1%-0.2%之间,小于5%的可接受标准;耐用性结果显示,3μg胰蛋白酶、37℃和18 h的酶切条件是最合适的样品处理条件。基于CDR相关肽段鉴别的HPLC-肽图分析方法可定性鉴定出抗CD52单抗,方法学验证结果显示该方法适用于抗人CD52单抗的专属性鉴别并可用于质量控制及批检验放行。     

重组人睫状神经营养因子肽图分析

建立重组人睫状神经营养因子(recombinant human ciliary neurotrophic factor,rhCNTF)的肽图分析方法,用于rh-CNTF的质量控制。胰蛋白酶对rhCNTF进行酶切后,利用RP-HPLC方法对酶切液进行分析,以获得胰蛋白酶切最佳条件及色谱条件,并对连续3批样品进行分析。rhCNTF的胰蛋白酶最佳酶切条件为37℃酶切24h,以A(0.1%TFA-H2O)、B(0.1%TFA-CH3CN)为流动相,采用梯度洗脱的方法对酶切液进行分析,结果连续3批rhCNTF制备产品的肽图完全一致,且其检出峰数目与理论推测值相符。3批产品肽图的一致性为rhCNTF产品的结构同一性提供了有利证据,同时,建立了rhCNTF产品质量控制的一项指标。     

重组单抗药物的肽图分析

建立了重组单抗药物的肽图分析方法。在变性条件下向抗体溶液加入还原剂,打开抗体内部所有交联的二硫键,再加入烷基化试剂封闭所有的自由巯基,使抗体分子在溶液中以游离伸展肽链的形式存在。加入胰蛋白酶,将充分伸展的肽链酶解成小的肽段。用反相高效液相色谱层析分析肽图谱。对连续3批中试产品及理化测定对照品进行肽图分析,各样品均能酶解完全,批间肽图谱一致。该方法实用有效,适于进行重组单抗等结构复杂的大分子蛋白药物的肽图检查分析。     

重组双功能水蛭素质量标准研究

以生色底物法测定抗凝血酶活性,比浊法测定抗血小板聚集活性,还原型SDS-PAGE测定分子量,SDS-PAGE和反相高效液相色谱测定纯度,毛细管电泳法测定等电点,胰蛋白酶酶切后进行肽图分析,其余检测项目按《中国药典》2005版三部规定进行。结果显示,用建立的方法对原液和成品进行了检定,各项指标均符合《人用重组DNA制品质量控制技术指导原则》和《中国药典》2005版三部的要求。建立的质控方法和质量标准具有保证产品安全、有效、质量可控的特点,可用于重组双功能水蛭素产品的常规检定。     

测序级胰蛋白酶的制备工艺与质量检测简

目的：制备高纯度、酶解效率高、酶切位点专一的测序级胰蛋白酶,应用于蛋白组学研究的蛋白质鉴定与分析中。方法：取实验室自制的猪胰蛋白酶粗酶,经硼氢化钠、甲醛还原甲基化修饰抑制胰蛋白酶自水解,采用高效液相色谱仪15RPC反相柱纯化,收集对应的甲基化胰蛋白酶峰组分,冷冻干燥;甲基化修饰的胰蛋白酶进一步经甲苯磺酰苯丙氨酰氯甲酮（TPCK）修饰,以抑制糜蛋白酶等非特异性酶切活性,并经反相色谱柱再纯化,获得终产物即质谱测序级胰蛋白酶;自制的测序级胰蛋白酶经SDS-PAGE、HPLC反相色谱分析、酶比活力测定,并应用于胶内蛋白质酶切质谱鉴定氨基酸序列等,检测其纯度、酶水解效率及酶切位点特异性。结果：自制甲基化TPCK修饰的测序级胰蛋白酶纯度大于95％,酶比活力为200U/mgP（TAME）以上,质谱分析酶切特异性好;且酶的制备工艺流程稳定,可应用于测序级胰蛋白酶产品的生产与开发中。结论：制备的测序级胰蛋白酶纯度高、酶解效率优、酶切特异性强,可广泛应用于实验室中蛋白质和肽段测序鉴定、HPLC肽段谱图分析等蛋白组学研究分析中。     

甘精胰岛素肽图分析方法研究

目的:探索并确定甘精胰岛素的最佳酶解条件,建立酶解更完全、特异性更强的甘精胰岛素肽图分析方法。方法:采用0.4 mol/L Tris-HCl(pH9.0)溶液作为酶解缓冲液,V8蛋白酶与甘精胰岛素之比为1 U∶10μg,于37℃反应1 h后加入磷酸终止反应,采用RP-HPLC分离目标肽段,采用液相色谱-质谱联用(LC-MS)方法鉴定酶解产生的肽段。结果:甘精胰岛素基本完全酶解,未消化的主成分较《欧洲药典》9.5版(EP9.5)方法大幅减少,时间缩短了1/2,酶解的完全性与有效性大幅提高。产生的4个目标肽段可通过RP-HPLC清晰呈现并有效分离,肽段Ⅱ和Ⅲ的分离度大于25.0,拖尾因子均小于1.5,且各肽段与对照品的相对保留时间在1.00±0.01范围内。4个目标肽段和2个非特异肽段均由质谱鉴定出。较好地克服了现行EP9.5甘精胰岛素分析方法酶解反应的完全性较差、非特异酶解肽段含量较高、理论目标肽段Ⅳ及Ⅰ含量过低等不利于表征目标肽段并确证其氨基酸序列正确性的缺陷。选取B32脱精氨酸甘精胰岛素评价方法的专属性,证实本方法专属性良好;6次重复测定各肽段的保留时间及峰面积的RSD为0.05%～0.20%,考察不同实验人员在不同时间处理样品得到结果的变异程度,RSD为0.01%～0.36%,表明方法的中间精密度较好。V8酶量为15～25 U、柱温为38～42℃、采用3个不同厂家的色谱柱时测定的相对保留时间的RSD为0.12%～0.26%,表明方法的耐用性较好。酶解后的样品于6℃存放24 h及-20℃储存7 d,稳定性较好。结论:实现了甘精胰岛素主成分的高效特异酶解及目标肽段的有效分离,该方法专属性、重复性、中间精密度及耐用性均表现良好,可用于甘精胰岛素的结构确证及专属性鉴别。     

测序级胰蛋白酶的制备工艺与质量检测

目的:制备高纯度、酶解效率高、酶切位点专一的测序级胰蛋白酶,应用于蛋白组学研究的蛋白质鉴定与分析中。方法:取实验室自制的猪胰蛋白酶粗酶,经硼氢化钠、甲醛还原甲基化修饰抑制胰蛋白酶自水解,采用高效液相色谱仪15RPC反相柱纯化,收集对应的甲基化胰蛋白酶峰组分,冷冻干燥;甲基化修饰的胰蛋白酶进一步经甲苯磺酰苯丙氨酰氯甲酮(TPCK)修饰,以抑制糜蛋白酶等非特异性酶切活性,并经反相色谱柱再纯化,获得终产物即质谱测序级胰蛋白酶;自制的测序级胰蛋白酶经SDS-PAGE、HPLC反相色谱分析、酶比活力测定,并应用于胶内蛋白质酶切质谱鉴定氨基酸序列等,检测其纯度、酶水解效率及酶切位点特异性。结果:自制甲基化TPCK修饰的测序级胰蛋白酶纯度大于95%,酶比活力为200 U/mgP(TAME)以上,质谱分析酶切特异性好;且酶的制备工艺流程稳定,可应用于测序级胰蛋白酶产品的生产与开发中。结论:制备的测序级胰蛋白酶纯度高、酶解效率优、酶切特异性强,可广泛应用于实验室中蛋白质和肽段测序鉴定、HPLC肽段谱图分析等蛋白组学研究分析中。     

胶原蛋白降解物高效液相色谱/质谱联用分析

利用高效液相色谱／质谱联用技术分析了胶原蛋白Ⅱ和Ⅰ经变性和酶解处理得到的多肽混合物,比较研究了两种类型胶原蛋白降解物之间的区别,利用液相色谱质谱连用技术识别出了不同类型胶原蛋白中的特征肽段。胶原蛋白在50℃处理3h可溶解于盐溶液,凝胶过滤分析结果表明,热变性的胶原蛋白分子量在10万以上,因此在热变性过程中胶原蛋白的三螺旋结构被破坏但没有明显的随机降解。利用胰蛋白酶对胶原蛋白进行了酶切处理,在酶用量为2％,pH 8.1~8.2,温度37℃条件下,处理20h后胶原蛋白降解较完全,多肽混合物的平均分子量在1万以下。利用液质联用技术研究Ⅱ型和Ⅰ型胶原蛋白降解物中的多肽,通过多级质谱分析了胶原蛋白降解物多肽的序列。结果表明,不同类型的胶原蛋白酶解后的多肽混合物中存在特定序列的特征肽段,利用特征肽段进行胶原蛋白类型识别是可行的。     

棒状链霉菌中隐性羊毛硫肽CLA 124的半体外生物合成

摘要:【目的】利用半体外生物合成方法获得棒状链霉菌中的隐性羊毛硫肽,为放线菌中羊毛硫肽资源的挖掘提供借鉴。【方法】利用nisin修饰系统,在大肠杆菌(Escherichia coli)中对隐性羊毛硫肽的核心肽进行体内修饰。修饰后产物经亲和层析和高效液相色谱(HPLC)纯化后,体外酶切反应切除前导肽,利用MALDITOFMS检测核心肽的脱水情况,并结合二级质谱解析其成环结构。【结果】获得了新的羊毛硫肽CLA 124,其核心肽脱去了4分子水,并形成2个硫醚键和一个二硫键。【结论】半体外生物合成方法可用于放线菌来源隐性羊毛硫肽的资源挖掘。     

混合谱图所引发的肽段质谱数据分析的问题及其解决方案

基于数据依赖性采集模式(DDA)的质谱分析是进行规模化蛋白质组学研究的常用方法。由于这类方法往往是液相色谱与质谱联用,因此肽段分离及其质量鉴定是该方法的核心指标。对于复杂肽段混合物而言,混合质谱图是广泛存在的;它们给肽段定性和定量都带来严重的问题。在当前的技术条件下,开发用于识别和分析混合质谱图的生物信息学工具是解决这一问题的可行方案。本文主要介绍了混合质谱图产生的原因和影响因素,以及识别和分析混合谱图的相关生物信息学工具的最新开发进展。     

螺旋藻源血管紧张素转化酶抑制肽的纯化和鉴定

血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂通过影响肾素-血管紧张素系统,对减缓和抑制高血压具有重要的作用.该研究通过超滤、凝胶过滤色谱、反相高效液相色谱等方法,从钝顶螺旋藻的木瓜蛋白酶水解液中分离、纯化得到一种血管紧张素转化酶(ACE)抑制肽,并利用基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)和氨基酸测序对纯化肽进行鉴定.此外,对其抑制类型和体外模拟消化环境稳定性也进行了研究.结果表明,分子质量范围为0～3000ku的酶解液ACE抑制活性最高,IC50值为(1.03±0.04)g/L.该部分酶解液通过纯化获得ACE抑制肽,IC50值为(0.0094±0.0002)g/L,相当于(27.36±0.14)μmol/L,序列经鉴定为Val-Glu-Pro.Lineweaver-Burk图和Dixon图表明该ACE抑制肽为非竞争性抑制剂,Ki值为(23.59±0.54)μmol/L.体外稳定性实验显示,该抑制肽在胃蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶等胃肠蛋白酶的消化下能够保持良好的抑制活性,表明螺旋藻源ACE抑制肽可以用于降血压功能食品和药剂方面,具有很好的发展前景.     

人表皮生长因子肽谱及一级结构的质谱法分析

采用液相色谱－质谱联用法（ＬＣ－ＭＳ）,分别对基因工程表达的人表皮生长因子胰蛋白酶和Ｖ８蛋白酶的酶解产物进行了肽质谱分析,获得各肽段的分子量信息。并对大部分肽段用串联质谱（ＭＳ－ＭＳ）分析了肽的序列,获得其氨基酸序列信息。此外,还测定了分子中二硫键的数目。均获得满意的结果。这一方法的建立将有助于天然的,人工合成的及基因工程表达的蛋白质或多肽的鉴定和结构分析,其精确度及分辨率都超过常规方法。     

基于马尔科夫链的胰蛋白酶肽段蛋白酶切位点概率预测

在基于质谱技术的蛋白质鉴定过程中,数据库搜索是主要的方法。漏切位点和酶切规则决定了图谱候选肽段的范围,是数据库搜索算法的重要参数。对于常用的胰蛋白酶切来说,除了局部构象、三维结构、实验条件,以及其它偶然因素会影响赖氨酸K或者精氨酸R后的位点能否被酶切外,该位点附近的其它氨基酸也会影响蛋白水解酶的酶切效果。从质谱图谱中时常会鉴定出包含漏切位点的肽段,因此,预测蛋白质的酶切位点能够为数据库搜索算法提供更为可靠的模型,也能够为了解和分析蛋白质的酶切规律提供依据。本文提出了一种基于马尔科夫(Markov)链的预测方法,能够利用蛋白质的序列信息来预测候选酶切位点的酶切概率,在蛋白酶切过程中,预测肽段的覆盖率可以达到85%以上。     

天花粉蛋白胰酶肽图谱的毛细管区带电泳法分析

目的:以天花粉蛋白胰蛋白酶解肽段为测定对象,用毛细管区带电泳法(CZE)研究天花粉蛋白的肽图谱分离条件。方法:采用未涂层石英毛细管(长50cm,内径75μm,有效长度42cm),以50mmol/L磷酸盐和150mmol/L三氟乙酸溶液为运行缓冲液,在25℃、pH2.0和压力为3447.4Pa(×10s)的条件下进样,以12kV恒压电泳分离,检测波长214nm。结果:运用CZE也能较好地对天花粉蛋白进行肽图谱分离,在缓冲体系中加入离子对试剂三氟乙酸,可极大地改善多肽的峰形和分辨率;同时运用反相高效液相色谱(RP-HPLC)技术,也很好地鉴定了部分肽段在CZE和RP-HPLC肽图谱中的对应关系。结论:与传统的RP-HPLC分析天然或重组蛋白肽图谱相比,CZE也不失为一种鉴定蛋白肽图谱的有效、快速和简单的方法。     

免疫八肽的纯化工艺研究

目的:研究免疫八肽的纯化工艺.方法:以水-乙腈为二元梯度洗脱流动相,以0.1%三氟乙酸(TFA)为离子对,用RP-HPLC(反相高效液相色谱)对合成产物进行分析,探索主峰出峰时间和杂肽分离度,优化程序后将程序放大并制备纯化,用RP-HPLC分析纯肤产物并与标准品对照其色谱保留值,结果一致,结果:此程序下收集的纯肽产物是目标八肽,并且收集的3段肽液纯度全部大于95%,产率高,纯度高.结论:建立了适于大规膜生产免疫八肽(AT-N)的纯化工艺.     

葛根糖基转移酶蛋白肽段序列的分离与鉴定

目的:分离鉴定葛根糖基转移酶蛋白肽段序列.方法:从野葛根部提取糖基转移酶,分离后对符合糖基转移酶分子量大小的5条蛋白条带进行酶解,经过高效液相色谱分离纯化后,电喷离子化质谱测定获得蛋白.结果:共获得440蛋白,发现有明确功能的蛋白有325个;具有催化活性的蛋白质有247个.根据报道的糖基转移酶分子量和等电点分布的特点,筛选出6个可能为糖基转移酶的蛋白.结论:初步推测葛根糖基转移酶的蛋白肽段序列,为其在葛根素生物合成中的作用研究奠定基础.     

重组定点突变巴曲酶质量标准研究

目的 建立重组定点突变巴曲酶的质控方法和质量标准.方法 生物学活性测定采用血浆凝集活性测定法;通过胰蛋白酶消化和RP-HPLC法分析该蛋白还原型肽图;其余检测项目均按<中华人民共和国药典>2010年版(三部)相关规定进行.结果 用建立的方法对三批重组定点突变巴曲酶原液和成品进行检定,各项指标均符合2010版<中华人民共和国药典>和相应指导原则的要求.三批原液比活性均≥2000 kU/mg.肽图三批次之间一致,原液的蛋白含量、纯度、分子质量、等电点、N末端氨基酸序列等指标均符合规定.结论 建立的质控方法可有效地控制重组定点突变巴曲酶产品质量,并可用于定点突变巴曲酶原液及成品的常规检定.     

β—鹅膏毒肽的反相高效液相色谱分离纯化

用反相高效液相色谱,以0．02mol/L醋酸铵—乙腈为流动相的梯度洗脱模式,在295nm吸收值的条件下,灰花纹鹅膏菌Amanita fuliginea的肽类毒素可以被成功的分离和纯化。单个肽类毒素的鉴定是用反相高效液相色谱和质谱同时进行。用这一方法可从灰花纹鹅膏菌中分离纯化出β-鹅膏毒肽(β-amanitin),产量可达到：1158μg／g(干重),产品纯度达98％以上,回收率为95．3％。β-鹅膏毒肽的分子量为919．3Da。这个方法可用于其它鹅膏菌肽类毒素的分离纯化。     

rUreB亚单位疫苗中试产品的纯度检测和肽图分析

分析重组幽门螺杆菌尿素酶B亚单位疫苗 (rUreB)中试产品的纯度 ,制备肽指纹图 ,证明rUreB三批中试产品在一级结构上的一致性和生产工艺稳定性。利用面积归一法检测产品的纯度 ,在非还原条件下用TPCK处理过的胰蛋白酶水解 3批中试产品 ,用反相HPLC制备分析肽图。结果显示 ,rUreB的 3批中试产品的纯度达到中试质量要求和肽图分析要求 ,3批中试产品的肽指纹图基本一致 ,重现性好。     

新型冠状病毒S蛋白RBD肽段的原核表达与纯化

目的:利用原核系统对新型冠状病毒S蛋白的受体结合域(RBD)肽段进行克隆、表达和纯化,制备高纯度的RBD肽。方法:在RBD肽段N端加入肠激酶位点序列(DDDDK),对应的核酸序列参照原核系统表达偏好进行全基因合成,构建pET-DsbC-RBD融合表达载体,通过原核表达和亲和纯化获得DsbC-RBD融合蛋白,用肠激酶对融合蛋白进行酶切和二次亲和纯化,获得高纯度新冠病毒S蛋白RBD肽。结果:构建了pET-DsbC-RBD表达载体,融合蛋白DsbC-RBD在大肠杆菌中实现了高效表达,经亲和层析纯化,重组融合蛋白DsbC-RBD相对分子质量为58×103,纯度约90%。用肠激酶对融合蛋白进行酶切,酶切效率近100%,通过二次亲和纯化获得了RBD肽,相对分子质量为25×103,纯度92%以上。结论:利用原核表达系统获得可溶性DsbC-RBD融合蛋白,采用亲和纯化和肠激酶酶切联用的方法制备获得高纯度的新冠病毒S蛋白RBD肽,为后续抗体制备和抗病毒药物筛选奠定了基础。