昆明小鼠胚胎干细胞滋养层制备条件的实验研究

目的:建立小鼠胚胎成纤维细胞(MEFS)滋养层,用于昆明小鼠胚胎干细胞的培养。方法:取妊娠13.5的胎鼠,采用组织消化法分离培养出原代成纤维细胞,对MEFs的生长形态、生长曲线及分裂指数进行观察;MTT法筛选丝裂霉素C(MMC)作用的最佳浓度和时间;取妊娠3.5d的囊胚在经MMC处理的饲养层上培养,观察胚胎干细胞集落生成情况。结果:MEFS为一种贴壁生长且增殖速度较快的细胞,第三代细胞增殖旺盛,第5代以后细胞开始变形并趋于衰老;MMC能抑制胚胎成纤维细胞的增殖,最佳的作用浓度和时间是10ug/ml作用2.5～4h,20ug/ml作用1-2.5h。妊娠3.5d小鼠囊胚在饲养层上培养能形成典型的"鸟巢"状干细胞集落,并可维持胚胎干细胞的正常形态且不发生分化。结论:这种方法制备的滋养细胞层适用于胚胎干细胞的培养。     

东方田鼠胚胎成纤维细胞的分离培养及生物学特性

目的对影响东方田鼠胚胎成纤维细胞（MfEF）分离和培养的因素进行探索,并观察其生物学特性。方法取室内繁殖饲养不同胎龄的东方田鼠胚胎分离成纤维细胞,通过原代和继代培养,分析比较不同胎龄、不同血清浓度、不同胰蛋白酶浓度等因素对MfEF分离及培养的影响,观察MfEF的生长形态及其生物学特性。结果 MfEF为贴壁型生长,细胞形态多样,呈梭形、不规则多边形;采用0.125%的胰蛋白酶室温消化12～13 d胚胎组织5 min,以DMEM培养基添加15%小牛血清分离培养MfEF的效果最佳;MfEF2～7代增殖最旺盛。结论获得了实验室分离、培养MfEF的有效方法 ,为进一步深入研究东方田鼠抗日本血吸虫机制以及开展不同动物成纤维细胞间比较研究奠定了基础。     

鸡胚胎生殖细胞在鼠胚成纤维细胞饲养层上的生长

目的:探讨以鼠胚成纤维细胞为饲养层分离、培养鸡胚胎生殖细胞的方法和条件。方法:分离、培养12.5～13.5d鼠胚成纤维细胞。分离孵化5.5d鸡胚原始生殖细胞,原代培养时不使用饲养层,与性腺基质细胞共培养;继代培养时将其置于鼠胚成纤维细胞饲养层上,在含生长因子、分化抑制因子的培养体系中培养胚胎生殖细胞。结果:鼠胚成纤维细胞可连续传代18代以上(4个月),3～15代细胞可以用作饲养层细胞。分离的鸡胚胎生殖细胞在饲养层上可增殖形成典型胚胎生殖细胞集落,并能连续在体外培养超过9代。集落未分化标志高碘酸希夫反应(PAS)呈强阳性,体外分化实验表明胚胎生殖细胞具有多能性。结论:用鼠胚成纤维细胞作为饲养层能获得可连续增殖的胚胎生殖细胞。     

用饲养层分离胚胎干细胞集落的实验初探

目的 用饲养层分离胚胎干细胞集落。方法 用胚龄为13~14 d的小鼠胚胎分离原代成纤维细胞,制成饲养层,用于囊胚的培养。结果 小鼠原代胚胎成纤维细胞（PMEF）贴壁能力较好,增殖快,易铺层。囊胚和内细胞团（ICM）在饲养层上贴壁生长良好,当培养4~5 d时,其增殖率为16/28（57%）。在ICM离散48 h后,各种胚胎干细胞（ES）集落开始出现。此种集落经碱性磷酸酶染色成阳性。结论 用饲养层分离胚胎干细胞获得初步成功。     

昆明小鼠胚胎干细胞的体外分离培养

利用昆明小鼠13.5dpc的胚胎制备小鼠胚胎成纤维细胞,并以小鼠胚胎成纤维细胞作为饲养层;收集3.5dICR小鼠的囊胚和桑椹胚进行体外培养,筛选纯化ES细胞集落,使其稳定传代后,对其形态学和生物学性状进行初步鉴定,获得阳性细胞集落。     

不同饲养层对鸡胚胎干细胞培养效果的影响

目的:为探索鸡胚胎干细胞培养的优化条件,比较不同饲养层对鸡胚胎干细胞离体培养的效果。方法:用传至第2代的鸡胚成纤维细胞与鸭胚成纤维细胞,经丝裂霉素处理后制作饲养层,比较这2种饲养层以及不用饲养层对鸡胚胎干细胞离体培养效果的影响。结果:在以鸡胚成纤维细胞和鸭胚成纤维细胞作为饲养层的培养体系中,鸡胚胎干细胞均可保持良好的生长状态,而且2种饲养层对鸡胚胎干细胞克隆形成的影响差异不显著(P0.05)。结论:鸡胚成纤维细胞和鸭胚成纤维细胞均可作为较好的饲养层细胞用于鸡胚胎干细胞的离体培养。     

绿色荧光小鼠胚胎干细胞的分离与培养

目的:建立绿色荧光小鼠胚胎干细胞系.方法:以ICR及GFP转基因小鼠为实验动物,冲取交配后3.5天小鼠GFW-/+囊胚,去透明带后进行完全培养,以13.5天鼠胚胎成纤维细胞(MEF)为饲养层,并对细胞克隆用亚克隆的方法分离扩大培养.结果:获得了边缘清晰,表面平滑,结构致密,隆起生长的鸟巢状克隆,碱性磷酸酶染色呈强阳性,干细胞特异性的多能因子OCT4及Nanog表达呈阳性,且能稳定表达绿色荧光的雄性干细胞系.结论:本文为小鼠ES细胞系的建立提供了一种稳定而可靠的方法.     

国产丝裂霉素处理的胎儿成纤维细胞支持具有生殖系转化能力的小鼠胚胎干细胞的分离

应用于胚胎干细胞(embryonic stem cells,ES细胞)培养的国产药物可以降低ES细胞的实验成本。研究中以浙江海正药业生产的丝裂霉素(mitomycin,国药准字H33020786)处理小鼠胎儿成纤维细胞,用于胚胎干细胞建系。并制备饲养层,将小鼠囊胚种植在该饲养层上。4-6天后,挑选形态良好的内细胞团(inner cell mass)来源的克隆在胰酶中进行消化,将消化下来的细胞团块传至新鲜的饲养层上。之后,每2-3天传代一次。结果表明,经该丝裂霉素处理的胎儿成纤维细胞支持具有生殖系嵌合能力的胚胎干细胞的分离。     

国产丝裂霉素处理的胎儿成纤维细胞支持具有生殖系转化能力的小鼠胚胎干细胞的分离

应用于胚胎干细胞（embryonic stem cells, ES细胞）培养的国产药物可以降低ES细胞的实验成本。研究中以浙江海正药业生产的丝裂霉素（mitomycin，国药准字H33020786）处理小鼠胎儿成纤维细胞，用于胚胎干细胞建系。并制备饲养层，将小鼠囊胚种植在该饲养层上。4—6天后，挑选形态良好的 内细胞团(inner cell mass)来源的克隆在胰酶中进行消化，将消化下来的细胞团块传至新鲜的饲养层上。之后，每2—3天传代一次。结果表明，经该丝裂霉素处理的胎儿成纤维细胞支持具有生殖系嵌合能力的胚胎干细胞的分离。     

胰蛋白酶消化法和组织块法原代培养人包皮成纤维细胞的比较

小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)是目前国际上公认的人胚胎干细胞(hESCs)体外培养的饲养层细胞,但MEFs存在寿命短、动物源性污染等问题,需要探索适于hESCs体外培养且寿命长的人源性饲养层.采用胰蛋白酶消化法和组织块法分别原代培养人包皮成纤维细胞(hFFs),探索hFFs原代培养的最佳方法,为hFFs作为饲养层在hESCs研究中的应用提供可靠的科学依据;通过倒置显微镜下观察其生长状态和免疫细胞化学染色鉴定,结果显示两种原代培养方法获得的hFFs的形态及生物学特性均符合成纤维细胞;通过测定细胞生长曲线及MTT法检测,结果显示两种原代培养方法获得的不同代数的hFFs均具有较高的增殖活性,传代10余代仍能保持较好的细胞形态,可以制备成饲养层用于hESCs的研究.     

六种藓类植物茎的比较解剖学研究

通过对6种藓类植物,即褶叶青藓(Brachythecium salebrosum(Web.et Mohr.)B.S.G.)、湿地匐灯藓(Plagiomnium acutum(Lindb.)Kop.)、侧枝匐灯藓(Plagiomnium maximoviczii(Lindb.)Kop.)、大凤尾藓(Fissidensnobilis Griff.)、大羽藓(Thuidium cymbifolium(Doz.et Molk.)B.S.G.)和大灰藓(Hypnum plumaeforme Wils.)嫩茎和老茎的石蜡切片和显微观察发现,同一藓类植株的嫩茎和老茎,茎结构稳定,不同种藓类植物茎横切面具有不同特征.植物体茎横切面形状、表层细胞的层数、细胞大小和细胞壁厚薄、皮层细胞大小和形状、中轴的有无以及比例等特征可以作为藓类植物的分科分类依据之一.