嗜水气单胞菌毒力基因在传代过程中的稳定性研究

为了解嗜水气单胞菌毒力基因在传代过程中的稳定性,对传代前后嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila,A.hydrophila)的毒力和毒力基因进行测定和检测.采用急性毒性试验方法测定10株嗜水气单胞菌原代、第10代及第20代的菌株对异育银鲫(Carassais auratus gibebio)的半数致死量,通过聚合酶链式反应(PCR)检测原代、第10代及第20代的菌株中5种毒力基因aerA、hlyA、ahpA、altA及ast的变化情况.试验结果表明,嗜水气单胞菌在传代过程中毒力基因分布相对较稳定.但是ahpA基因极易发生变异,在培养基上连续多次传代后,毒力逐渐减弱甚至消失.可推知,ahpA基因与毒力相关性最大,并易受传代影响.     

和厚朴酚对嗜水气单胞菌气溶素表达的抑制作用

为了研究不同浓度和厚朴酚对嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)致病力的影响, 筛选抗嗜水气单胞菌感染的天然化合物, 通过溶血试验、免疫印记试验、荧光定量PCR试验和动物试验进行了研究。结果发现, 和厚朴酚能在亚抑菌浓度下降低嗜水气单胞菌培养物上清中的溶血活性; 蛋白免疫印迹试验发现和厚朴酚能降低嗜水气单胞菌气溶素的分泌; 荧光定量PCR试验进一步表明和厚朴酚与嗜水气单胞菌共培养后降低了气溶素编码基因aerA的转录而降低气溶素的分泌。此外, 通过动物试验发现和厚朴酚治疗能显著提高斑点叉尾鮰( Ictalurus punctatus )嗜水气单胞菌感染模型的存活率。以上研究表明, 和厚朴酚能通过降低气溶素编码基因aerA的转录而降低嗜水气单胞菌的致病力, 和厚朴酚是一种潜在的新型抗嗜水气单胞菌感染的先导化合物。     

中长链聚羟基脂肪酸酯（mcl PHA）在嗜水气单胞菌I型PHA合酶缺失突变株中的合成

拥有Ⅰ型聚羟基脂肪酸酯(PHA)合酶基因的嗜水气单胞菌CGMCC0911株可利用月桂酸而不能利用葡萄糖作为碳源积累PHBHHx。将氯霉素抗性基因(Cm)插入到该基因中,获得带有I型PHA合酶断裂基因(phaC::Cm)的自杀质粒pFH10。自杀质粒pFH10通过接合作用转入嗜水气单胞菌CGMCC0911株中并发生体内同源重组,Cm被整合到基因组上,获得Ⅰ型PHA合酶缺失突变株。DNA序列测定证明了这一结果。GC分析表明,突变株不再产生PHBHHx,但却可利用月桂酸或葡萄糖积累中长链PHA,明显表明野生型嗜水气单胞菌基因组中存在另一个编码Ⅱ型PHA合酶的基因,且只有Ⅰ型PHA合酶被钝化后,这个功能被隐藏的Ⅱ型PHA合酶才可在细胞中发挥作用。     

中长链聚羟基脂肪酸酯(mcl PHA)在嗜水气单胞菌Ⅰ型PHA合酶缺失突变株中的合成

拥有Ⅰ型聚羟基脂肪酸酯(PHA)舍酶基因的嗜水气单胞菌CGMCC 0911株可利用月桂酸而不能利用葡萄糖作为碳源积累PHBHHx。将氯霉素抗性基因(cm)插入到该基因中,获得带有Ⅰ型PHA合酶断裂基因(phaC：：Cm)的自杀质粒pFH10。自杀质粒DFH10通过接合作用转入嗜水气单胞菌CGMCC 0911株中并发生体内同源重组,Cm被整合到基因组上,获得Ⅰ型PHA合酶缺失突变株。DNA序列测定证明了这一结果。GC分析表明,突变株不再产生PHBHHx,但却可利用月桂酸或葡萄糖积累中长链PHA,明显表明野生型嗜水气单胞菌基因组中存在另一个编码Ⅱ型PHA合酶的基因,且只有Ⅰ型PHA合酶被钝化后,这个功能被隐藏的Ⅱ型PHA合酶才可在细胞中发挥作用。     

诸氏鲻虾虎鱼出血病病原鉴定及传播途径分析

目的分离鉴定诸氏鲻虾虎鱼(Mugilogobius chulae)出血病病原,并探讨其传播途径,为虾虎鱼微生物质量控制提供技术依据。方法从患出血病虾虎鱼肝脏取样分离病原菌,经菌落形态、生化特性和分子特征鉴定细菌,回归感染确定其致病性,并采用双重PCR方法对虾虎鱼、轮虫、卤虫、水进行嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)检测。结果分离到1株优势菌PYMc15-1,该菌株API生化反应结果与嗜水气单胞菌一致,gry B序列与Gen Bank上的嗜水气单胞菌相应基因序列同源性最高;根据已知序列构建gry B分子系统进化树,分离株PYMc15-1与嗜水气单胞菌聚类;分离株PYMc15-1溶血素基因(hly A)和气溶素基因(aer A)检测结果阳性,对虾虎鱼半致死剂量(median lethal dose,LD_(50))为每尾1. 2×104cfu。野生虾虎鱼、卤虫和野生轮虫致病性嗜水气单胞菌检测出现阳性结果,虾虎鱼封闭群、室内培育的轮虫以及海水样品致病性嗜水气单胞菌检测均为阴性。结论嗜水气单胞菌可自然感染虾虎鱼;野生虾虎鱼和生物饵料是其潜在传播媒介,引进虾虎鱼和生物饵料时应检测该病原。     

嗜水气单胞菌HBNUAh01 外膜蛋白A 基因在烟草叶片细胞中的瞬时表达

【目的】从嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)HBNUAh01中克隆外膜蛋白A(outer membrane proteinA,ompA)基因并在烟草(Nicotiana tabacum)叶片细胞中瞬时表达该蛋白。【方法】以嗜水气单胞菌HBNUAh01为模板进行嗜水气单胞菌外膜蛋白A(AhompA)基因片段的PCR扩增,并将其克隆到pEASY-Blunt Simple载体中以进行测序。测序正确的AhompA基因序列与含有黄色荧光蛋白(yellow fluorescentprotein,YFP)基因的表达载体pCAMBIA1300构建重组表达载体。将该重组表达载体转化到农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)GV3101感受态细胞中,随后用阳性转化子转染烟草叶片细胞。使用激光扫描共聚焦成像系统(Confocal Laser Scanning Microscope)检测观察融合表达AhompA基因的黄色荧光蛋白并采用RT-PCR检测AhompA基因在烟草叶片中的转录情况。【结果】从嗜水气单胞菌HBNUAh01中克隆出大小为1032 bp的AhompA基因序列,并在烟草叶片中成功表达AhompA和YFP的融合蛋白。【结论】AhompA基因在烟草叶片细胞中的成功表达为进一步研究利用植物疫苗防治嗜水气单胞菌引起的水产动物疾病奠定了基础。     

嗜水气单胞菌cpxRA缺失株构建及生物学特性研究

为了探讨Cpx系统在嗜水气单胞菌生长及毒力等方面发挥的作用, 利用融合PCR和基因同源重组原理, 以自杀质粒pRE112为载体构建缺失57—1879 bp序列的cpxR-A基因簇突变株 Δcpx, 然后比较缺失株和野生株在生长、生物膜形成、应激耐受及毒力等生物学特性方面的差异。普通PCR及荧光定量PCR结果验证了突变株中cpxRA基因簇片段的部分缺失, 表明突变株构建成功; 生物学特性研究结果显示, 突变株在形态、生长、生物膜形成及毒力等方面与野生株没有显著差异, 两者主要在应对高渗透压、SDS (十二烷基磺酸钠)刺激及含有EDTA (乙二胺四乙酸二钠)或多黏菌素B环境表现不同。结果表明Cpx双组分系统在嗜水气单胞菌应对外界刺激方面扮演着重要角色, 但在毒力方面则可能处于次要地位。     

嗜水气单胞菌菌落多重PCR方法的建立及应用

[背景]嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)对水产动物、畜禽和人类均有致病性.基因表达的溶血素、气溶素和肠毒素是重要毒力因子,在致病性嗜水气单胞菌早期检测及防治中尤为重要.目前采用菌落直接提取DNA用于多重PCR研究的相关报道较少.[目的]基于菌落PCR方法建立针对嗜水气单胞菌溶血性基因、肠毒素基因...     

白藜芦醇抑制嗜水气单胞菌毒力作用研究

为探索白藜芦醇(Resveratrol, Res)在水产动物细菌病防控中的应用价值, 实验以淡水养殖中重要的细菌病原嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)为研究对象, 通过设置药物浓度梯度, 检测其对嗜水气单胞菌生长、生物膜形成和溶血活性的抑制作用, 和对毒力及群感调控系统相关基因表达的影响; 同时通过人工感染异育银鲫(Carassius auratus gibelio)试验检测其对鱼体保护作用和对鱼体炎症相关因子基因表达的影响。结果显示: 白藜芦醇对嗜水气单胞菌的最小抑菌浓度(MIC)>1024 μg/mL; 浓度低于64 μg/mL时, 对菌株生长影响不显著; 浓度≥32 μg/mL时, 对病原菌株生物膜形成和溶血活性具有显著抑制作用(P<0.05), 且随剂量增加而增强。荧光定量RT-PCR结果分析发现白藜芦醇能引起嗜水气单胞菌群感调控系统中luxR和luxS基因分别显著上调和下调表达; 外膜蛋白基因omp表达显著下降。人工感染试验发现攻毒前两小时腹腔注射25、50和100 mg/kg白藜芦醇处理组的异育银鲫死亡率显著下降, 鱼体炎症相关的肿瘤坏死因子(TNF-α)和Ⅱ型干扰素(IFN-γ)的mRNA表达量也显著下降。研究表明药用植物大黄、虎杖等所含白藜芦醇成分能有效抑制嗜水气单胞菌毒力, 降低鱼体炎症反应的功效; 腹腔注射25—100 mg/kg白藜芦醇对感染病原菌的异育银鲫有一定保护作用。     

西伯利亚鲟源嗜水气单胞菌致病菌的分离及其全菌苗的免疫效果

从患细菌性败血症的西伯利亚鲟(Acipenser baerii)的体内分离到一株致病菌株X1,其对西伯利亚鲟的半数致死浓度(LC50)为5.62×105 cfu/ml,具有较强毒力;经ATB细菌鉴定仪生理生化鉴定和16SrDNA序列分析,菌株X1为嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila);其系统发育分析表明,菌株X1与嗜水气单胞菌ATCC35654(登录号:X74676.1)的亲缘关系最近,其同源性为99%.用0.30%福尔马林灭活,将菌株X1制成灭活全菌苗,对西伯利亚鲟进行注射免疫.研究结果表明,嗜水气单胞菌X1全菌苗能够明显提高西伯利亚鲟的血清抗体水平及总蛋白、免疫球蛋白、溶菌酶含量,而且在嗜水气单胞菌X1全菌苗中加入弗氏不完全佐剂,有利于进一步增强西伯利亚鲟血清抗体水平及总蛋白、免疫球蛋白、溶菌酶含量.此外,嗜水气单胞菌X1全菌苗对西伯利亚鲟抗嗜水气单胞菌X1人工感染也具有较好的免疫保护作用,其对西伯利亚鲟的免疫保护率为50%,而且在嗜水气单胞菌X1全菌苗中加入弗氏不完全佐剂,嗜水气单胞菌X1全菌苗对西伯利亚鲟抗嗜水气单胞菌X1人工感染的免疫保护作用更好,其对西伯利亚鲟的免疫保护率为70%.因此,将嗜水气单胞菌X1全菌苗用于西伯利亚鲟细菌性败血症的防治具有广阔的发展前景.     

嗜水气单胞菌RPA-LFD快速检测方法的建立

文章旨在建立一种针对嗜水气单胞菌的敏感性高、特异性强的快速临床诊断方法。研究根据嗜水气单胞菌促旋酶B亚单位(gyrase subunit B, gyrB)基因的保守序列,设计特异性重组酶聚合酶扩增技术(RPA)扩增引物,通过结合琼脂糖凝胶电泳(AGE)和侧流层析试纸条(LFD)的方法进行反应条件的优化、特异性及灵敏度检测。实验结果表明,所建立的嗜水气单胞菌RPA-LFD快速检测方法可在38℃最适温度下30min内无干扰地检测到嗜水气单胞菌,对嗜水气单胞菌纯培养物和基因组DNA的最小检出限为10³ cfu/mL和100 pg/μL。利用建立的RPA-LFD与普通PCR同时检测杂交鲟鱼处理临床样品的结果表明,两种方法的结果一致。综上所述,通过对RPA反应条件的探索和优化,成功建立了嗜水气单胞菌快速检测方法。该方法操作简便,反应迅速,与普通PCR相比,不需要昂贵的仪器,为未来嗜水气单胞菌细菌性疾病的早期诊断提供了更有效的技术支持。     

嗜水气单胞菌溶血素基因的克隆表达及其类毒素的免疫原性分析

根据嗜水气单胞菌溶血素保护性抗原基因序列(GenBank Accession No. AF539467)设计一对引物, 以嗜水气单胞菌河北分离株基因组为模板, 经PCR扩增得到hly基因。序列分析表明, 该基因产物大小为1485 bp, 经测序与GenBank报道的多个嗜水气单胞菌hly基因序列一致性高于99%。将得到的hly基因定向克隆到原核表达载体pET-28a中构建原核重组质粒pET-28a- hly, 转化大肠杆菌 BL21(DE3)中, 得到重组菌株BL21(DE3)(pET-28a-hly), 经IPTG诱导后, SDS-PAGE分析可见一条56 kD的特异条带。Western blotting分析结果显示表达的Hly蛋白能与抗体发生特异性结合,说明其具有较好的免疫原性。将表达的溶血素蛋白制成类毒素疫苗免疫小鼠后, 具有较高的保护效力, 表明该类毒素疫苗有望作为预防由嗜水气单胞菌引起疾病的基因工程类毒素疫苗。     

CP7抗菌蛋白对嗜水气单胞菌的抑杀作用机理

[目的]研究多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa) CP7菌株的抗菌蛋白(CP7ACP)对嗜水气单胞菌的抑杀作用机理,为防治嗜水气单胞菌引起的鱼病提供新的潜在天然药物.[方法]采用抑菌试验、钼锑抗比色法和紫外光谱法研究其对嗜水气单胞菌S12菌株生长、磷泄漏和生物大分子的影响,并利用扫描电镜和透射电镜观察了嗜水气单胞菌细胞结构遭受的破坏作用.[结果]CP7ACP对嗜水气单胞菌的抑菌圈直径约8.1 mm,最小抑菌浓度(MIC)与最小杀菌浓度(MBC)分别为原液浓度的1/8和1/4;嗜水气单胞菌受CP7ACP处理后,电镜观察发现其细胞壁、细胞膜、细胞器以及菌体均受到不同程度的破坏,胞内的生物大分子和磷泄漏明显,基因组DNA发生增色效应.[结论]CP7ACP抑制嗜水气单胞菌生长,可用于防治嗜水气单胞菌引起的鱼病.     

嗜水气单胞菌bamA、bamB、bamD突变株的构建及其对外膜蛋白转运的影响

革兰氏阴性细菌的BAM(β-barrel assembly machinery)系统一般由BamA-E等5个亚基组成,以β-桶状外膜蛋白的结构对细菌的转运和正确折叠中起重要作用。目前对于BAM系统的研究大多集中在大肠杆菌、脑膜炎双球菌等细菌中,而在其他细菌中的相关功能还有待进一步研究。以嗜水气单胞菌为研究对象,首先利用同源重组技术,分别构建完成bamA、bamB、bamD的缺失突变株。尔后,利用SDS-PAGE检测技术对相应突变株差异外膜蛋白进行比较,并对这些差异蛋白进行质谱分析,共鉴定到7个差异蛋白,其中5个为外膜蛋白,2个为位于内膜上的蛋白酶。此外,还通过Western blotting对部分突变株外膜蛋白的表达进行验证。研究结果发现,嗜水气单胞菌BAM系统的突变不仅改变了其外膜蛋白表达,还影响了微生物的蛋白转运进程;且在系统中不同亚基对不同外膜蛋白的转运和表达效果也有所不同,结果提示了嗜水气单胞菌BAM转运系统的不同亚基存在特定外膜蛋白转运的特性。     

连翘提取物对嗜水气单胞菌群体感应系统的影响

【背景】传统抑菌剂的大量使用导致细菌产生多重耐药性与抗性,而基于细菌群体感应靶点调控的新型抑菌剂可缓解细菌耐药性与抗性,是未来抑菌剂的发展方向之一。【目的】研究连翘(Forsythiasuspensa)提取物对嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)群体感应系统的影响及可能的作用机制,为新型抑菌剂的开发提供理论依据。【方法】以紫色杆菌(Chromobacterium violaceum)CV026为报告菌株,以嗜水气单胞菌为供试菌株,采用倍比稀释法测定连翘提取物对2种菌的最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration,MIC),通过微量法测定提取物对嗜水气单胞菌生长、群集运动及蛋白酶活性的影响,利用高效液相色谱串联质谱法分析提取物中的主要成分,采用分子对接模拟探究提取物对嗜水气单胞菌群体感应系统的作用机制。【结果】连翘提取物对紫色杆菌CV026和嗜水气单胞菌的MIC均为16.00mg/mL。在亚抑菌浓度下,连翘提取物处理显著抑制了CV026紫色菌素的产生,最大抑制率高达56.30%。经8.00mg/mL连翘提取物处理后,嗜水气单胞菌的群集运...     

嗜水气单胞菌若干毒力因子同时缺失的突变株的构建及特性分析

以携带质粒pAM12 0 (Tcr Tn916 )的大肠杆菌CG12 0株为供体菌 ,采用滤膜接合法与受体菌嗜水气单胞菌J_1株 (cfzr)进行接合转移 ,在含Tc和cfz选择平板上进行筛选。共获接合转移菌落 380 0个 ,其接合频率为 3× 10 - 5(按供体细胞计算 )。任取 38个接合子 ,提取基因组DNA ,以嗜水气单胞菌特异性 16SrDNA引物进行PCR扩增 ,所有接合子均阳性。为证明Tn916确实插入基因组 ,以四环素基因 (tet)引物进行PCR扩增 ,结果所有抗性接合子均扩增出一条特异条带。与亲本J_1株相比 ,所有接合子的主要毒力因子如蛋白酶、溶血素、DNA酶和淀粉酶等均不表达 ,对小鼠失去致病力 ,其LD50 大于 10 9CFU。接合子连传 10次后 ,四环素抗性消失 ,但毒力未恢复 ,说明通过转座子Tn916的插入可获得稳定的无毒嗜水气单胞菌突变株。Tn916引起嗜水气单胞菌毒力性状改变的机制有待研究 ,推测可能与该菌染色体上存在Tn916的热点或毒力岛有关。     

翘嘴鳜病原嗜水气单胞菌分子特征及LAMP检测方法的建立

嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)是一种危害鳜鱼养殖生产的重要病原细菌, 为进一步明确该病原菌的分子特征及建立快速检测技术, 实验对引起翘嘴鳜(Siniperca chuatsi)暴发性死亡的病原嗜水气单胞菌进行了致病性、菌株毒力特征研究, 同时以嗜水气单胞菌气溶素基因aerA为分子靶标设计引物, 利用环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)建立了病原嗜水气单胞菌的快速检测方法。结果表明, 本次引起翘嘴鳜暴发性死亡的病原嗜水气单胞菌半致死浓度为1.6×106 CFU/mL, 携带aerA等14种毒力基因, 此14种毒力基因可用于其致病性分析及分子检测。以气溶素基因aerA设计引物进行的环介导恒温扩增, 结果显示可扩增出阶梯状条带, 加入SYBR Green I染色后呈现绿色的阳性反应, 而对照组均未出现任何扩增条带且反应体系呈现橙色, 表明LAMP检测方法对于嗜水气单胞菌检测具有很好的特异性; 灵敏度检测的最低检测限为4.6×101 CFU/mL; 10种经人工感染的淡水养殖鱼虾组织匀浆增菌液, 提取DNA后进行LAMP方法检测, 结果均可获得阳性扩增结果, 而对照未染菌组呈阴性, 表明该方法具有较好的应用性, 可应用于嗜水气单胞菌引起的水生动物疾病的检测。     

嗜水气单胞菌TPS-30株丝氨酸蛋白酶基因与溶血素基因在大肠杆菌中的融合表达

嗜水气单胞菌丝氨酸蛋白酶和溶血素是该菌重要的致病因子与保护性抗原。致病性嗜水气单胞菌TPS-30株为江浙一带鱼类暴发病病原主要血清型O:9的代表株。研究利用PCR方法扩增嗜水气单胞菌TPS-30株的丝氨酸蛋白酶基因(Spe)和溶血素基因(Hly),将基因Spe和Hly通过柔性片段进行融合,并将融合片段插入pET32a的多克隆位点,构建成重组融合表达载体pET32a-Spe-Hly。将重组载体转化大肠杆菌BL21(DE3),经异丙醛-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,获得融合蛋白Spe-Hly。表达产物经SDS-PAGE检测,显示与预期大小约130kD相吻合的融合蛋白带。纯化融合蛋白并对鲫鱼进行免疫攻毒试验。结果表明,丝氨酸蛋白酶基因和溶血素基因融合表达载体构建成功,并成功获得了融合蛋白Spe-Hly,对鲫鱼的免疫保护率达81.4%。这为基因工程亚单位多价疫苗的开发提供基础。       

多个环境因素对嗜水气单胞菌感染团头鲂致病力的影响

采用正交试验L16(4×213)设计检验了养殖环境中多种理化因子(温度、p H、分子氨、亚硝酸盐)对嗜水气单胞菌感染团头鲂致病力的影响。试验设立温度(A)4个水平(20、24、28、32℃);p H(B)2个水平(6.5、8.0);分子氨(C)2个水平(0.02、0.04 mg·L-1)和亚硝酸盐(D)2个水平(0.1、0.3 mg·L-1),每组试验鱼分别注射嗜水气单胞菌106CFU·m L-1;以试验鱼存活时间的长短判断嗜水气单胞菌对团头鲂致病力的大小。结果表明:分子氨与p H的交互作用(B×C)和温度(A)因素分别对嗜水气单胞菌致病力影响极其显著(FF0.01),p H(B)对嗜水气单胞菌致病力影响显著(FF0.05),而亚硝酸盐(D)和分子氨(C)对嗜水气单胞菌致病力的影响不显著;团头鲂存活时间y(单位为h)与环境因子间的多元线性回归方程为y=164.713-6.399A+14.367B-11.914(B×C);根据该线性回归方程,当温度为20℃、p H=8.0、分子氨浓度为0.02 mg·L-1时,嗜水气单胞菌对团头鲂的致病力最弱,鱼体的存活时间最长(149.76 h)。本实验结果可为团头鲂养殖中的嗜水气单胞菌出血病防控预警提供一定的参考。     

嗜水气单胞菌毒力基因的研究进展

嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)隶属于气单胞菌科(Aermonadaceae)气单胞菌属(Aeromonas),为人、畜及水生动物共患的条件致病菌。该菌广泛存在于水环境中,是多种水产动物的主要致病菌。国内外学者对其进行了许多研究,现普遍认为嗜水气单胞菌的致病性与其产生的毒素密切相关。随着分子生物技术的发展,已有许多学者从分子水平上对嗜水气单胞菌进行了研究,为阐明嗜水气单胞菌的致病机理提供了一些理论依据,并建立起针对几种主要毒力因子的检测手段。本文将嗜水气单胞菌目前的研究策略、部分主要毒力因子及其检测手段作一综述,以期为嗜水气单胞菌致病机理的研究及嗜水气单胞菌病的防治提供参考和借鉴。